脐带血造血干细胞采集、分离和冷冻保存研究
创新交流
E-mail:zhyh@csta.org.en\胡杨\编辑\第Ol期\2009年\中国科技成果
CHINASClENCEANDTECHNOLOGYACHIEVEMENTS
脐带血造血干细胞采集、
分离和冷冻保存研究
文/刘忠1孙自敏2吕蓉1李敏1郭晓睫1方勤1周学勇1刘会兰2丁利1杨红友3
(1合肥市中心血站,安徽合肥230031;2安徽省立医院,安徽合肥230001;
5加拿大多伦多脐血库Toponto,Canada)
擅 要:目的:优化脐带血造血干细胞采集、分离
和冷冻保存的方法,初步探讨建立脐带...
创新交流
E-mail:zhyh@csta.org.en\胡杨\编辑\第Ol期\2009年\中国科技成果
CHINASClENCEANDTECHNOLOGYACHIEVEMENTS
脐带血造血干细胞采集、
分离和冷冻保存研究
文/刘忠1孙自敏2吕蓉1李敏1郭晓睫1方勤1周学勇1刘会兰2丁利1杨红友3
(1合肥市中心血站,安徽合肥230031;2安徽省立医院,安徽合肥230001;
5加拿大多伦多脐血库Toponto,Canada)
擅 要:目的:优化脐带血造血干细胞采集、分离
和冷冻保存的方法,初步探讨建立脐带血遣血干细胞库
的系统方法。方法:运用抗凝、密闭式血袋无茵采集符
合要求的足月顺产或剖宫产新生儿脐带血,进行相应的
微生物项目检测及HLA分型检测,采用二次回浆再提取
的方法分离制备脐带血有核细胞(Nc),并通过对不同
的降温速率优化脐带血遣血干细胞的冷冻保存及复温方
法,对复温后的脐带血造血干细胞进行计数及活性检测。
结果:共收集脐带血49份,筛选并冷冻保存了26份,
所收集的脐全血体积124.6±26.27删,NC总数(1.64士
0.94)×109;分离后脐血体积25.77士1.45ml,NC总数
(1.52-i-0.89)×109,回收率为(92.12土5.78)%。分
离前后细胞活性台盼蓝拒染率分别为(96.8士1.14)%
和(95.7土1.63)%冻融前后Nc总数分别为(2.16士0.79)
×109和(1.97±0.95)×109,NC回收率(92.97土7.55)%,
台盼蓝拒染率分别为95.7%和96%,CD34+细胞数分别
为(8.02士4.61)X106和(6.89士4.15)×105,cD54+
细胞回收率(85.56±5.27)%,粒单系细胞集落形成单
位(cFlH3M)回收率(91.45士5.44)‰脐血遣血干细胞
在冷冻保护剂和复苏方法相同而降温速率不同的情况下,
4"C~-40。C时采用l。c/嘲的降温速率优于5。c/r咖的降
温速率,一40。C~-90‘C时采用I'C/嘲或5"C/咖的降温
速率以及在置一196。C液氮保存前自-40。C降至-go。C或降
至一150。C之间,结果均无显著性差异。结论:优化的脐带
血遣血干细胞采集,分离和冷冻保存的方法,造血干细胞
回收率高,可以满足普通病人造血干细胞移植的需求。
关键词:脐带血;干细胞;低温保存
DOI:10.5772/J.issnl009--5659.2009.01.016
造血干/祖细胞移植(HSC/HPCT)已广泛用于
治疗多种恶性血液系统疾病。研究表明,脐带血含有丰
富的造血干细胞及造血刺激因子,T淋巴细胞功能不健
全,对HLA相合要求不严格,正常情况下不含细菌、
病毒或肿瘤细胞,建立脐带血造血干细胞库已成为近年
来造血干细胞移植的最重大进展之一。本文通过优化脐
带血造血干细胞采集、分离和冷冻保存的方法,初步探
讨建立脐带血造血干细胞库的系统方法。
一、材料与方法
1.脐带血采集
脐带血由安徽省立医院,合肥市妇幼保健医院等提
供。采用抗凝(ACD-B)、密闭式血袋在脐远端近胎盘
8~10cm处穿刺收集脐血,采集后室温保存,24h内分
离处理。各项检测标本取自留样管。
2.脐带血NC制备
(1)将采集的脐血试管留样lml并称重,计算脐血
万方数据万方数据
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体积}以1:4(脐血为4)的比例向脐血中加入羟乙基淀
粉(HES),充分混匀并静置5分钟后以509离心,离
心时间根据脐血的体积来确定,分出脐血的上层液体至
100毫升的转移袋内,脐血原袋保留待用;将转移袋以
4409、lOmin离心,上清液加回到原脐血袋内并混匀,
下层脐血干细胞留在转移袋内待用,将混匀后的脐血袋
以509离心,7离心时间比第一次离心时间少1min,离
心后的上层液体加入到转移袋内,和下层脐血干细胞混
合,将转移袋以4409、10min离心,分出上清液,留取
下层脐血干细胞悬液20毫升,
(2)右旋糖苷和二甲基亚砜(DMSO)以1:1的比
例配制,置4℃预冷15minl将预冷后的保护剂用注射
器和静脉输液针缓慢加入到转移袋内并不断地混匀,使
DMSO终浓度为10‰将加好保护剂的脐血干细胞悬液
转入到冷冻袋中,体积约为25±5ml,试管留样Iml并
称重,计算出回收率。
3.脐血造血干细胞低温保存和复温
在4"C~-40℃、-40℃一-90℃降温过程中分别
使用两种不同的降温速率1℃/min、5℃/min和5℃
/min、1℃/min进行冷冻保存效果比较,以及在放入
液氮前从-40℃分别降至一90℃和降至一130℃的效果
比较。
复温选择将冻存脐血自液氮罐液相移至气相,放置
5~lOmin取出,在37"(2恒温水浴箱内快速复温。
4.脐带血检测
·4.1细菌检测
严格按国家标准对每一份脐血标本进行细
菌培养。对细菌培养阳性的标本,采用药敏试
验,有特异性抗菌素的标本分类保存,防止交
叉污染。对没有发现特异性抗菌素的标本不予
保存。
4.2传染性指标检测
胞率=活细胞总数/(活细胞总数+死细胞总数)×
100%l②CD34+细胞检测:使用流式细胞仪检测。采
用BectonDickinson公司产品。③CFU-GM的细胞培
养:采用商品化的MethocultTM培养基,随机选择5份
脐带血干细胞,37℃、5%C02饱和湿度培养14天,用
倒置显微镜计数40个细胞以上(冻融后8个以上)组成
的集落。
二.结果
1.脐带血采集
共采集49例,其中150ml以上的5例,100~150mi
的19例,60~100ml的20例,不足50ml的5例。平均
脐全血体积124.6±26.27IIll。
2.脐带血NC制备
采用二次回浆离心法,根据脐血的体积来确定离心
时间(图1),提纯的脐血NC回收率为(92.12+5.78)%,
分离后的NC总数为(1.524-0.89)×109,见表l。
300
o250
二Ef200
誊150
鲁100
盗 50
O
101 1 1213141516171819
时间(min)
脐血体积与离心时间关系图
表1脐血样本的Nc回收结果(n=26)
分离前 分离后(蛆收牢%)
I脐带I舡体积{lnl) 124.^±26.1725.77±1.45
NC计放f×Iln 1.64_-4-0.94I气'+n.Xqf02.1'4-气.781
严格按国家标准对每一份脐血标本进行ALT、
HBV、HCV、HIV、CMV和梅毒的初、复筛检测。阳
性结果不予保存。
4.5HLA分型
对脐血标本开展HLA—I,II类A,B、DR六个位
点采用PCR-SS0方法进行分型。
4.4遣血干细胞冻融前后数量及活性检测
(1)NC计数:采用血细胞计数仪和人工计数相结
合的方法。
(2)NC活性检测:①台盼蓝拒染率计数:活细
3.脐带血微生物项目检测
对49份脐带血细菌培养结果显示无细菌生长,初、
复筛结果均显示有4份标本ALT呈阳性,l份标本
HBV呈阳性,阳性标本弃用。
4.脐血造血干细胞低温保存
脐血造血干细胞在冷冻保护剂和复苏方法相同而
降温速率不同的情况下,提示从4℃~-40℃时采用
l℃/min的降温速率优于5℃/min的降温速率,NC
回收率和细胞活性检测经统计学比较有显著性差异
(P
0.05),见表2。
表2不同降温速率效果比较(n--16)
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自然沉降法、Fico]1分离法等,这些方法存在着耗时长、
降温适嘈嚏 NC叫收牢 台盼蝮拒染牢 P愤
1.1IL‘/n讧n 97.4+’30。91.1±3.50—n
4℃~-40℃ <0.05
5.0C/lllhtH4.74-'4q。H^’+5.30■
1.0C/Jl正Il91.1±!.1o; 91.1±1.97。
一加℃~-90℃ >11.05
5.Ur,fntin0,14-1.铲。 90.34-’.R%
采用从412开始以1℃/min的速率降至一40℃,然
后以512/min速率分别降至-9012和-130℃之后放
入一19612液氮进行比较,结果显示两者无显著性差别
(P>0.05),见表3。
5.造血干细胞冻融前后数量及活性检测
表3程序冷冻仪降至不同温度效果bt较(n--.--16)
操作步骤繁琐、易染菌等缺陷,我们经过实验
研究采取了一系列改进方法,提高了脐血有核
细胞的回收率。(1)我们按1:4的比例向脐血
中加入HES使红细胞形成串状聚集,加速红
细胞沉降;分离脐血的分离袋我们选用了特制
的窄长型转移袋,这些措施有利于离心时的细
胞分层,提高了有核细胞的回收率。(2)脐血
的第一次离心条件我们改变以往不论脐血体积多少一概
使用固定的离心力和离心时间的方法,采用在固定离心
力的情况下,根据脐血体积的不同采用不同的时间进行
离心,取得了良好的分离效果。(3)为了提高脐血干
细胞的回收率,我们采用了二次回浆再提取的方法,把
降温范嘲 NC叫收率 f}盼蚯拒染牢 I'值
一40L‘~-90I、 01.1+1o。 91.1±1.9““
>0.05
一40(、~一l30℃ 92.3±1.9‰ 90.3+1.Xo。
表4 13份脐血冻融后细胞计数和台盼蓝拒染率结果(n=13)
冻触两 冻触J,j㈨1收串%)
CD344-细胞总数(×l矿)牲.014-4.6l6.89±4.15(85.364-3.27)
NC总教fx o}) 二.1(1±O.791.97±0.95(92.974-7.53)
台盼监姑染率(%) 95.7_-4-{.6396±1.5
表5粒单系细胞集落形成单位(CFU-GM)培养结果(n--5)
第一次离心后剩余的红细胞重新悬浮,再次离
心提取剩余的脐血干细胞,使整体回收率提高
5%~10%。(4)由于DMS0浓度高,渗透性强,
加注时会产生高热,我们采取了用右旋糖苷稀
释并预冷的方法,缓慢加注以减少DMSO对细
胞的破坏,提高复温后脐血干细胞的成活率。
(5)最终的浓缩脐血量我们控制在25±5ml,
较小的体积节省了液氮罐的储存空间,便于大
冷冻}lif 冷冻艟
体积(Inl)NCf×10”) 列收串(%)
袋落放 怂数(×to'’)袋落数 总教f×10^)
一
X 26。60 6.90 5.0IJ ,’^ ¨.IMJ 2.1J7 91.45
SD I.14 1.73 2.24 ('.85 I.87 11.79 5.44
使用流式细胞仪随机检测13份脐带血冻融前后
CD34+细胞总数分别为(8.02士4.61)X106、(6.89±
4.15)X106,回收率(85.36+3.27)%,NC回收率平
均92.97%,台盼蓝拒染率平均为96%,见表4,提示保
存条件和过程比较适合,对干细胞损失较小。由于保存
的标本数量有限,我们随机选择5份样本进行细胞集落
培养。结果见表5。
三.讨论
造血干细胞移植是迄今为止治疗各种恶性血液病、
艾滋病、先天性遗传性疾病等最有效的方法之一。由于
脐带血造血干细胞具有资源优势、独特的生物学特性和
移植适应症的广泛性,用脐带血代替骨髓及外周血进行
造血干细胞移植,已成为近10年来造血干细胞移植的最
重大进展之一。
目前,制备提纯脐血干细胞的方法有倒置离心法、
量保存脐血,节约了成本。我们用该方
法制备的脐血干细胞的有核细胞回收率
为(92.12土5.78)%,与美国纽约血液
中心脐血库、山东脐血库、上海脐血库
的水平相当,具有回收率高、操作简便、
节约成本等优点。分离出的有核细胞总数为(1.52±0.89)
X109,按2X10,/kg的移植标准计算,我们分离保存的
脐血能够满足70公斤以下患者的移植需要。
有核细胞检测及活细胞计数是检验之前采集、分离
和冷冻工作是否有效的标准之一,只有有效细胞达到一
定数量,才能满足I临床移植使用。因此,在脐血浓缩之前、
浓缩后、冻融后每一阶段我们都及时留样检测相关指标,
以监控脐血干细胞的制备质量,为脐带血干细胞移植提
供保证。
在细菌检测方面,我们严格按国家标准对每一份脐
血标本进行细菌培养。对细菌培养阳性的标本,采用药
敏试验, 有特异性抗菌素的标本分类保存,防止交叉污
染。对没有发现特异性抗菌素的标本不予保存。
此外,我们还对保存的脐血采用PCR-SSO方法进
行了HLA基因型分型,提供配型资料。圆 ’
万方数据万方数据
脐带血造血干细胞采集、分离和冷冻保存研究
作者: 刘忠, 孙自敏, 吕蓉, 李敏, 郭晓睫, 方勤, 周学勇, 刘会兰, 丁利, 杨红友
作者单位: 刘忠,吕蓉,李敏,郭晓睫,方勤,周学勇,丁利(合肥市中心血站,安徽,合肥,230031), 孙自敏
,刘会兰(安徽省立医院,安徽,合肥,230001), 杨红友(加拿大多伦多脐血库
,Toronto,Canada)
刊名: 中国科技成果
英文刊名: CHINA SCIENCE AND TECHNOLOGY ACHIEVEMENTS
年,卷(期): 2008(1)
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本文链接:http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgkjcg200901016.aspx
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