胶原蛋白与骨折愈合的关系

Q 生 旦箜 卷第 8期 China J Orthop& I'raIJn1a，Aug 2002，Vo1．15，No 8 胶原蛋 白与骨折愈合的关系 The relationship between collagen and fracture healing 姜福全 赵铁军 沈洪兴 JIA',4G Fu—quart，ZHAO Tie-jun，SHEN Hong-a'ing 【关键词】 骨折愈合； 胶原蛋白 【Key Words】 Fracture healing； Collagen l 胶原蛋白在骨和体内其他组织中的分布 到 目前为止人们已经发现 了 l9种基因编码不同 的胶原 蛋白，各种类型的胶原按其发现顺序用罗马数字标记 ，按照它 们 的结构特点的不同又可分组 1 。 胶原 I、Ⅱ、Ⅲ、V、Ⅺ是连接纤维形成胶原。 I、Ⅱ、Ⅲ型 胶原是在结缔组织基质中发现的主要胶原。 I型胶原主要存 在于肌腱 、韧带 、骨、器官被膜 、皮肤 、纤维软骨和筋膜 中。 Ⅱ 型胶原主要存在于透明软骨和弹性软骨 中，它被作 为软骨细 胞的标志 。Ⅲ型胶原在许多组织 中都有分布 ，包括动脉 、肝 、 脾 、肉芽组织等 ，它可以构成大量的纤维问的横 向连接 。由Ⅲ 型胶原构成的分 子间的二硫键横 向连接 在体 内有着重要作 用。因为二硫键连接可以很快 生成，所 以Ⅲ型胶原在愈合过 程中最早产生，它们对新合成的基质提供机械力量l3一。 相对地，Ⅳ、Ⅵ到 X、Ⅻ到 XⅨ型胶 原不构成纤 维。 I＼、 Ⅻ、XⅣ、XⅥ和 Ⅸ型胶原不单独构成超分子结构 ，而通常与 其它胶原一起构成纤维l4 。它们的结构为短的非三维螺旋结 构，起到分隔体内各种三维螺旋结构物质的作用。其他胶原类 型形成非胶原 聚合体 ，如板层(Ⅳ、Ⅷ、X型胶原)，串珠样微丝 (Ⅵ型胶原)，辅助基底膜连接 的定位纤维(Ⅶ型胶原)。 、＼ 和 XⅧ型胶原的特征 是在正常胶原三维结构区内广泛间断。 胶原家族中其他 已知胶原如 XⅢ、 Ⅱ型胶原是 由单链构成。 在不同个体间，各种胶原的分布 也不尽相 同，随年龄 、性 别等有差异。Wang等l5j研究 了 33名不 同性别 和年龄人 的 股骨样本后发现年龄主要 可以影 响骨组 织 中变性胶原 的数 量 、骨折强度 、骨折能量及弹性系数 ；而性别则对骨折强度 、弹 性系数等有影响。进一步研究发现变性胶原的 比例与骨强度 负相关 ，而与其弹性系数正相关；而矿化成分则与骨强度及其 弹性系数皆正相关。Alvarez等 J研究 了不 同年龄 大鼠胫骨 中胶原基质达的差异 。结果发现胶原基质和 Ⅲ型原胶原酶 在软骨细胞分化 的特异 时期表达 ，并与动物生 长速 度相关。 在软骨细胞分化 的过程 中 Ⅱ型 、X型胶原及 Ⅲ型原胶原酶表 达的与基因表达的一系列改变相关 。 2 胶原蛋白在骨折愈合 中的时空表达 胶原超家族中被认为在骨修复中起到直接作用的胶原为 I、Ⅱ、Ⅲ、V、Ⅸ、Ⅺ、Ⅻ、XⅣ型胶原等。 上海第二军医大学附属长海医院，上海 200433 · 505 · · 综 述 · I型胶原 占全部胶原的 90％，它有着广泛的分布。 I型 胶原在骨中增加了大量 的机械力量。Martin等_7 J发现在牛的 皮质骨 中，纵向排列的胶原纤维的数量是骨强度的最好预测 指标。同时，骨的胶原纤维也是骨质矿化的部位。 骨折修复 中产生的胶原类型可 因组织 修复的需要而 变 化。Lane等l8 3hi!实大 鼠胫骨只有 I型胶原在成熟骨 中广 泛 存在 ，Ⅱ型胶原和 Ⅲ型胶原仅在骨痂 中有其特殊定位 。胶 原 在骨折愈合三个过程中的生成有时间上的顺序性 ：炎症期供 应骨膜 、骨膜下骨及周围的结缔组织的血管破裂从而导致血 肿形成和细胞坏死 ，坏死组织的趋化作用可吸引原始问质成 分分化成成熟的细胞成分 ，如软骨细胞和成骨细胞 ，这些细胞 随后产生 Ⅱ型胶原和 Ⅲ型胶原 ；在修复期 Ⅲ型胶原纤维基质 沿骨膜表面分泌 ，作为骨原细胞和毛细血管生长的底物，也可 作为较松散的可延伸 的支架 ，在其基础上纤维可以定 向。接 着，I型胶原在纤维组织 中作为骨生发的小梁 ，最后 ，在软骨 内骨化中产生 Ⅱ型胶原作为修复过程 ，Ⅱ型胶原 的表达依赖 于骨折愈合的机械类型。只有不稳定型骨折才通过软骨 内骨 化愈合。 Moro等l9 发现近干骺端和骨干的海绵骨与远干骺端的海 绵骨I型胶原蛋白中羟脯氨酸 、羟赖氨酸、糖基化的羟赖氨酸等 的比例皆有所差异。从而肯定了骨功能对胶原的影响作用。 接着，人们又在基因水平对骨愈合过程 中的胶原表达做 了进一步研究 ，Scandberg等【lo]在大 鼠骨折骨痂中使 用原位 杂交技术定位产生 Ⅱ型和Ⅲ型胶原 。发现第一个检测到的是 Ⅱ型原胶原 mRNA，它在第 5天 时已在靠近皮质骨 的细胞 中 有表达。这些软骨细胞也有 I型原胶原 mRNA的表达，提示 它们是 由新生骨膜细胞分化而来的。因为外骨痂的总数在第 7天至第 l5天没有改变 ，所 以作者提 出软骨的发生主要来 自 问质细胞的分化 ，而不是软骨细胞的增殖 。在软骨基 质沉积 之后 ，Ⅱ型胶原 mRNA明显下降。在骨折愈合 的第 15天至 第 28天 间，在每一骨折骨痂单位 内检测到的 I型原胶原 的 mRNA数量达到最高峰 ，这与成骨细胞将软骨转化为编织骨 相一致 。 Hiltunen等【11 J从大鼠正常胫骨和骨折后外骨痂中提取出 全部胶原蛋白的 RNA，使 用特殊 的 cDNA探针进行 Northern 杂交 ，发现 Ⅲ型胶原的合成在骨折后 5天的炎症期达到高峰 ， 此后逐渐下降 ，在第 28天时已非常少 ，正常骨组织中有低水平 维普资讯 http://www.cqvip.com · 506 · 生国量 2Q 生 旦箜 鲞箜 期 China J Orthop&Trau-m，A岖 2002，vol 15，No．8 但仍可检测到的Ⅲ型胶原 mRNA。数种软骨特异性的基 因在 第 7到第 9天时上调。当软骨形成活跃时 ，机体有高水平 的Ⅱ 型胶原 mt~NA与 Ⅸ型胶原 mRNA。这两种胶原 的表达相一 致。而在第 28天骨痂和正常骨中未见Ⅱ型胶原 mt~NA与 Ⅸ型 胶原 mRNA表达。X型胶原仅在软骨骨化时的肥大软骨细胞 中有表达，它在骨折后第 9天达到高峰 ，在软骨生成上稍晚于Ⅱ 型胶原和Ⅸ型胶原。I型胶原在所有时间皆有表达，在第 l4到 28天间最高 ，这与骨形态学上活跃 的新骨生成 和骨塑形相一 致，正常骨组织中I型胶原 mRNA水平非常低 。 3 胶原蛋 白在骨折愈合中表达的调控 3．1 胶原蛋 白间的相互调节 胶原蛋 白在骨折愈合 中的表 达具有一定顺序性 ，而且相互 之间还具有调节作用。在众多 的胶原分子中，Ⅱ型胶原是在 软骨生成 中最受重视的。但最 近 ，小纤维胶原如V型胶原和Ⅺ型胶原也被研究。V型胶原 和Ⅺ型胶原有着非常相近的结构 ，在不同的组织 中有着相同 的作用 。已有研究表明这些小胶原在软骨组织和非软骨组织 中调节 I型胶原和 Ⅱ型胶原的生长和定 向。对这两种胶原基 因表达的研究发现：在骨折愈合过程中 V型胶原在软骨痂和 硬骨痂中皆有表达 ，从 内生骨痂生成开始一 直持续到整个塑 形期。在进行膜 间骨化 的骨膜下骨痂 中V型胶原 表达得最 多 l 。最近 ，对软骨痂 中的软骨组织的研究发现 ：表达较强 胶原 ⅡA1信号的增殖软骨细胞 同时表达 ⅪA型信号。随着 组织的分化软骨细胞的分化 ，ⅡA胶原信号迅速消失 ，在肥大 软骨细胞和钙化处软骨细胞 中检测 不到。 ⅡA1胶原阴性 的 细胞皆不表达 ⅪA1基 因。 在软骨生成缺陷的实验模 型中，转基因鼠其 Ⅱ型原胶原 基因的外显子 7和内含子 7被敲除 ，发现骨折骨痂处软骨细 胞内Ⅸ型胶原和 X型胶原水平较正常 鼠低 ，并且其骨痂生成 受到抑制|l引。进一步验证 了 Ⅸ型胶原和 X型胶原与 Ⅱ型原 胶原间密切的调解关系。尚无其他种胶原间相互调节的研究 报道。 3．2 病理情况对胶原蛋 白表达 的影响 临床 医生早就观察 到。在某些病理状态下 ，如糖 尿病 ，骨折愈合 明显受 到影 响。 现在研究表明，这与胶原蛋 白有密切关 系。Macey等ll 报道 糖尿病鼠骨折后骨痂胶原合成减少 ，伴随着骨痂机械强度 的 下降。Topping等 ll 发现正常大鼠骨痂中 X型胶原在骨折后 第 l4天达到最高 ，而在糖尿病大 鼠中则下降了 54％～70％， 其原因可能是糖尿病大 鼠骨痂中软骨全部受抑制的结果，从 而解 释 了糖 尿 病 大 鼠骨折 愈 合缺 陷 的 原 因。Spanheimer 等[15]报道糖尿病大鼠的关节软骨和骨组织在体外 总胶原 的 合成量下降，并且使用糖尿病大鼠的血清也使正常大鼠的软 骨胶原合成量减少。而在给糠尿病大鼠使用胰 岛素治疗后再 取其血清 ，则没有抑制作用 ，这提示存在一种循环 因子介导糖 尿病对结缔组织 的作用 ，但具体的机制正在研究之 中。 3．3 骨折类型对胶原蛋白形成的影响 Roman等ll 总结 丁 稳定型和不稳定型骨折愈合过程 中胶原的不同。稳定型骨折 主要是 I型胶原，也有 Ⅱ型胶原和 Ⅲ型胶原。形成支架支持 软骨骨痂 ，随后进行软骨 内骨化 。而不稳定型骨折则情 况不 同。骨折后 3天Ⅲ型胶原和V型胶原就覆盖在骨膜表面。骨 折后 5～7天起初的纤维基质就被 Ⅱ型胶原和 Ⅸ型胶原代替。 仅在靠近正常骨质的外周发现 I型胶原 。并且两者在 I型胶 原和 Ⅲ型胶原的相对数 目上存在较大差异。因为 Ⅲ型胶原主 要是在愈合早期起作用 ，故而它的差异可以导致延迟愈合或 不愈合 。在实验性骨不连模型中，胶原合成延迟至 7周 才达 到稳定状态，而骨痂矿化在最初 的 3周后已停止 ，在第 12周 时仍未发现桥接骨痂 ；相反 ，正常的骨痂愈合 3周时是胶原合 成的高峰 ，次后矿化渐增。在这种实验性骨不连模型中骨折 愈合可能是被持续性的不稳定状态抑制或处于可逆状态 ，从 而在第 12周时骨折处的纤维骨痂组织仍在生成。 3．4 物理机械因素的影响 机械负重可以在各种物理位置 影响胶原表型。同样 ，制动后组 织底 物本身也可发生 变化 。 这些改变包括新合成胶原数 目的减少 ，而增加 了分子间可复 位胶原的横向连接 。这些不成熟 的胶原更 易弯 曲，其坚硬度 降低。它们以自由方式排列，所 以对外力的抵抗力差。这些 组织改变与下降的机械性能相关。而由于锻炼所产生的形态 学改变不同于制动，它可 以使胶原纤维增厚 ，这些增厚的胶原 纤维可以抵抗更强的外力 ，而胶原的排列也沿着外力的方向， 这样也可 以抵抗锻炼 中过度压力所可能引起 的变形。 在骨科手术后，使用外 固定所引起 的逐渐发生的骨脱位 是延 长 断 骨 和改 正成 角 畸 形 的越 来 越 普 遍 的方 法【"』。 Vauhkonen等【18]用羊来研究 在骨脱 位最初 4周内新合成 的 骨基质胶原 ，结果提示脱位骨生成不像骨痂愈合或软骨下骨 化，它不经历 Ⅱ型胶原产生期或 Ⅲ型胶原合成分泌期 ，而仅仅 是由 I型胶原所构成的成熟纤维有机基质合成。 国内，邓廉夫等 l 9l用生理性 电刺激周 围神经 ，发现早期 骨痂内胶原蛋 白合成量增加 ，基质钙化迅速 、完全 ，骨性 骨痂 发生早 ，骨转化过程缩短。并据此认为，周围神经功能性电刺 激可作为促进骨修复的辅助手段。但未进一步研究胶原蛋白 的种类及出现顺序。 3．5 细胞 因子对胶原蛋 白表达的调控 体外实验发现生长 因子可以调节胶原的合成 。另外 ，在骨折愈合部位也发现了 许多生长因子。在骨细胞 、软骨细胞 、软骨内骨及关节软骨中 都存在。这种多功能生长因子被认为在调节软骨基质及骨塑 形中有重要作用 。它可增加成骨细胞中 I型胶原的合成及人 皮肤成纤维细胞 中Ⅵ型胶原和人上皮角质细胞 中Ⅶ型胶原的 合成ll 。关于 TGF—t71对软骨 中 Ⅱ型胶 原的调节有不一 致 的结果。TGF一171可减少新生大鼠长骨 中成软骨细胞 和胚胎 鸡胸骨软骨细胞 中Ⅱ型胶原的产生 ，却增加了兔关节软骨细 胞中 Ⅱ型胶原 的产生 20 。在 牛的骨膜细胞 中 TGF一171可增 加 Ⅱ型胶原的合成 ，使这些细胞产生了软骨细胞的表型[21 J。 TGF一171的 mRNA已在骨修复期 内增殖间质组织 、骨 、软 骨中发现[22j。在骨折血肿 处细胞 和分化 的软骨细胞 中也有 低水平的表达 2 。TGF一171由血小板和炎症细胞释放后在间 质增殖的早期调节骨折愈合 2 3l。在整个愈合过程 中成骨细 胞和软骨细胞合成这种因子，直至编织骨骨塑形期作用才消 失【22,23]。另外，在大鼠和兔骨折处使用 TGF-17I已证实可 以 增加骨痂形成和愈合 6周时的骨强度 。 其他 2个在胶原合成中有作用的生长因子是胰岛素样生 长因子 I和 Ⅱll 。在骨骼肌肉系统中，胰岛素样生长因子 I 可刺激骨 、肌腱和成纤维细胞 中的胶原合成 ；胰 岛素样生长因 维普资讯 http://www.cqvip.com Q 生 第 15卷第8期 China J Orthop&Tra㈣ ，Aug 2002，vb【．15，N0 8 子 Ⅱ可刺激骨细胞中 I型胶原的合成。应用原位杂交技术 ， Andrew等_2 ]在人的骨折修复过程 中定位 了这两种生长因子 的 mRNA。胰岛素样生长 因子 lI mRNA早期 由内皮细胞和 间质细胞在肉芽组织阶段表达。这两种生长因子都可在骨和 软骨形成时期在成骨细胞和非肥大软骨细胞中检测到。在编 织骨骨塑形期一些 成骨细胞 内仍有胰岛素样生长 因子 Ⅱ的 mRNA。 在骨细胞培养中发现 了血小板来源 的生长因子(PDGF) 也可促进 I型胶原的合成 。在早期骨修复过程中，这种 因子 存在于靠近骨膜的巨噬细胞中[25 。在兔骨折愈合的前 4周 应用 PIN3F可 以增加骨痂 的强度和体积 ，这在放射影像学 上 已得到证实。另外 ，使用这种生长因子也可促进成骨分化 。 Longobardi和 Wallace等[26,27 就生长激素(GH)Xq骨的各 种生化标志物及胶原的影 响进行 了多中心、随机 、双盲研究 。 结果发现在使用生长激素 21天后骨 中 I型胶原及 Ⅲ型胶原 和其他一些骨生化标 志物皆有所增加，并且这种效应 与剂量 相关，并有性别差异。 4 小结与展望 虽然 19种基因不同的胶原已被发现 ，但就每一种胶原的 机械性能尚少见报道。研究 已经发现 ，根据骨承重性质 的不 同，胶原纤维的物理安排也会发生变化_l 。胶原纤维的随机 排列不能抵御较强的外 力；而沿力的方向排列的胶原纤 维有着更好的生物机械性能。 目前 ，就每一种胶原蛋白的生 物物理强度 尚不清楚。应用各种类型的胶原抗体进行免疫组 化，Northern分析 ，原位杂交和进行生物机械研究等才可能研 究清每一种胶原的作用及特定的外力条件下诱导何种胶原类 型。而只有 当以上问题都研究清楚后才有可能控制条件以产 生更符合需要的新型胶原。 参考文献 1 Burgeson RE，Nimni ME．Collagen types．Molecular structure and tis— sue distribution．Clin Orthop，1992，282：250—272． 2 Rehn M ，Pihlajaniemi T．Alpha—l(XⅧ )，a collagen chain with frequent interruptions in the collag enous sequence，a distinct tissue distribution and homology with type X V collagen Proc Natl Acad Sci USA， 1994，91(10)：4234—4238． 3 Cheng DT，Dicesare P，Benya PD，et a1．The presence of intermolecular disulfide cros．~linksin typeⅢ collagen．J Biol Chem，1993，258(11)： 7774—7778． 4 M ayne R，Brewton RG New members of the collag en superfamily． CurrOpinCell Biol，1993，5(5)：883—890． 5 Wang X，Bank RA，Tekoppele JM，et a1．Effect of collagen denatura— tion on the toughness of hone．Clin Orthop，2000，371：228—239． 6 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