第十周生化实验 影响酶活性的因素

生物化学实验影响酶活性的因素2012.11.20一、实验目的观察淀粉在水解过程中遇碘后溶液颜色的变化。观察唾液淀粉酶在不同底物、温度、pH、和激活剂、抑制剂存在下活性的变化情况。二、实验原理淀粉在唾液淀粉酶（含淀粉酶和少量麦芽糖酶）的作用下被逐步水解成单糖，水解的中间产物遇碘呈现不同的颜色：淀粉→不同大小分子的糊精→麦芽糖、葡萄糖蓝色紫色→暗褐色→红色不变色根据水解液和碘反应的颜色，可以判断水解是否已完全，观察底物、温度、pH及激活剂与抑制剂对唾液淀粉酶活性的影响。三、试剂和器材1.试剂新鲜唾液稀释液、1%蔗糖溶液、Benedict试剂、0.5%淀粉、0.5%淀粉溶液（含0.3%NaCl）、1％氯化钠溶液、1％硫酸铜溶液、碘液、0.2mol/L磷酸氢二钠溶液、0.1mol/L柠檬酸溶液2.器材恒温水浴锅、4°冰箱、电磁炉(沸水锅)纸杯、试管、试管架、锥形瓶，pH试纸一、酶的特异性实验目的：了解酶的特异性并掌握酶特异性的检测方法和原理。实验原理：酶的特异性是指一种酶只能对一种或一类化合物（此类化合物通常具有相同的化学键）起作用，而不能对别的化合物起作用。本实验以唾液淀粉酶对淀粉的作用为例，说明酶的特异性，淀粉酶只能催化淀粉水解，对蔗糖的水解无催化作用。淀粉和蔗糖都无还原性，但淀粉水解产物为葡萄糖，蔗糖水解产物为果糖和葡萄糖，均为还原性糖，糖类的醛基或酮基能与Benedict试剂反应，生成砖红色的氧化亚铜沉淀。试管编号试剂处理#1#2含0.3％NaCl的淀粉溶液（mL）3－2%蔗糖溶液（mL）—3Benedict试剂（mL）22摇匀，沸水浴煮沸3min记录观察结果2、检查试剂（取2只试管，按下表操作）1、唾液淀粉酶液的准备实验者用蒸馏水嗽口，除去食物残渣。然后含一口蒸馏水于口中，轻嗽一分钟，吐入小烧杯中。将其稀释一倍。操作步骤3.淀粉酶的专一性实验试管编号试剂处理#1#2已稀释的唾液溶液（mL）11含0.3％NaCl的0.5%淀粉溶液（mL）3－2%蔗糖溶液（mL）—3摇匀，置37℃水浴保温15minBenedict试剂（mL）22摇匀，沸水浴煮沸2min记录观察结果（取2只试管，按下表操作）二、pH对淀粉酶活性的影响实验目的了解pH对酶活性的影响及最适pH的定义。实验原理酶的催化活性与环境pH有密切关系，通常各种酶只在一定pH范围内才具有活性，酶活性最高时的pH，称为酶的最适pH，高于或低于此pH时酶的活性都逐渐降低。不同酶的最适pH不同。酶的最适pH不是一个特征性的物理常数，对于一个酶，其最适pH因缓冲液和底物的性质不同而有差异。操作步骤1.取3个锥形瓶，按下表比例移取磷酸氢二钠溶液和柠檬酸钠溶液，制备pH为5.0、6.8、8.0的三种缓冲溶液。锥形瓶号0.2M磷酸氢二钠（mL）0.1M柠檬酸（mL）缓冲液pH1235.157.729.724.852.280.285.06.88.02、另取3只干净试管，按下表操作。试管编号试剂处理#1#2#3pH5.0缓冲溶液（mL）2--pH6.8缓冲溶液（mL）-2-pH8.0缓冲溶液（mL）--2含0.3%NaCl的0.5%淀粉溶液（mL）111置37℃水浴,每隔1min逐管加入唾液稀释液1mL，充分摇匀保温10min，到达保温时间后，每隔1min依次取出立即加碘化钾－碘溶液/滴222记录观察结果三、温度对淀粉酶活性的影响实验目的了解温度对酶活性的影响及最适温度的定义。实验原理对温度敏感是酶的一个重要特性，酶作为生物催化剂也有温度效应，提高温度可以提高酶促反应速度，但另一方面又会加速酶蛋白的变性速度，所以在较低的温度范围内，酶反应速度随温度升高而增大，但是超过一定温度后，反应速度反而下降。酶反应速度达到最大时的温度称为酶的最适温度。酶的最适温度不是一个常数，它与作用时间的长短有关系。操作步骤1.取3支试管，各加2mL含0.3％氯化钠的0.5％淀粉溶液。2.另取3支试管，各加1mL淀粉酶液。3.将此6支试管分为3组，每组中盛淀粉溶液与淀粉酶液的试管各1支。4.三组试管分别置入0℃、37℃与100℃的水浴中。5.等5min后，将各组中的淀粉溶液倒入淀粉酶液中，继续维持原温度条件5min后，立即滴加2滴碘液，观察溶液颜色的变化。四、激活剂与抑制剂对酶的影响实验目的了解激活剂和抑制剂对酶活力的影响。实验原理酶的活性受某些物质的影响，能使酶活性增加的称为激活剂，能使酶活性降低的称为抑制剂。很少量的激活剂和抑制剂就会影响酶的活性，而且常具有特异性，但激活剂和抑制剂不是绝对的，浓度的改变可能使激活剂变成抑制剂。试管编号试剂处理#1#2#31%NaCl溶液（mL）1__0.1%CuSO4溶液（mL）_1_蒸馏水（mL）__10.5%淀粉溶液（mL）333稀释的唾液（mL）111摇匀，放入37℃恒温水浴保温10min，取出，冷却。KI-I2溶液（mL）2滴2滴2滴记录观察结果（取3支试管，按下表加入各种试剂）操作步骤从1号试管中用玻棒取出1滴溶液，置于白磁板上用碘液检查淀粉的水解程度。待1号试管内的溶液遇碘不再变色后，立即取出所有的试管，各加碘液2滴，观察溶液颜色的变化。思考题：通过本实验，结合理论课的学习，小结影响唾液淀粉酶活性的因素，以及它们发挥作用的原理。