分子生物学的应用技术 ppt

nullnull分子生物学技术 在医学研究中的应用（基因表达）null基因表达基因表达指基因组中某基因在细胞中 转录为mRNA和翻译成蛋白质的过程。基因表达的改变预示着细胞在分子水平 上的变化。它往往是细胞形态功能变化之 前的变化。null影响基因表达的因素：1、遗传因素 个体差异，终生不变。2、环境因素 激素、药物，细胞因子、机械刺激、 病原体感染、电刺激、细胞转化…..null研究基因表达的手段1、RT-PCR (RNA) 2、Northern blot (RNA) 3、Western blot (蛋白质） 4、免疫组化 （蛋白质）原位杂交、点杂交、RNA酶保护试验 基因芯片null1、RT-PCR基本原理： 将细胞中mRNA逆转录为cDNA，以cDNA 为，进行PCR反应。根据PCR产物的 量，判断基因表达的强度。RT-PCR是一种半定量方法null实验操作：1）RNA提取：Trizol 试剂盒。 防止RNA降解RNA提取的成功与否 是RT-PCR检测中最 重要的步骤。null2)逆转录： RNA、缓冲液、dNTP、逆转录酶、 引物（随机引物，Oligo dT)null3) PCR特异性引物、模板、Taq 聚合酶。通过PCR，将目的片段扩增几十—百万倍。 在一定范围内和一定的条件下，PCR的产物量 与模板量呈正比关系。null模板量null4）几个注意问题：反应平台 内参 1、PCR效率差异，重复性 2、内参选定 3、共同扩增 4、扩增片段长度 5、mRNA丰度，目标片段与内参片段nulliNOS (诱导型一氧化氮合酶) GAPDH (磷酸甘油醛脱氢酶)null5) PCR产物量的测定 应用图象分析软件进行密度测定。100%160%nullA B C D2.0 2.02.0 1.02.0 2.01.0 1.0nullRT-PCR特点：优点： 灵敏度高、特异性高、操作简便。缺点： 可靠性差、不能细胞定位。null2、Northern blot标记探针与膜固相RNA杂交。 根据杂交信号强弱判断表达量， 根据杂交信号位置判断分子长度。杂交信号null实验操作：1）RNA提取 2）RNA电泳（分离不同长度RNA) 3）转膜 (形成固相RNA) 4）探针标记（同位素/非同位素） 5）预杂交，杂交 6）洗膜 7）显影（放射性/酶促）nullNorthern blot 特点：因为没有扩增过程，Northern blot 的结果可靠性高。 可以确定未知基因的转录产物（mRNA）长度。优点：缺点： 1、操作烦琐 2、同位素 3、灵敏度低 4、对RNA质量要求高 5、不能定位细胞 null3、Western blot标记抗体与膜固相蛋白作用。 根据信号强弱判断蛋白表达强度。 根据信号位置判断蛋白分子量。标准分子量 蛋白特异性反应带null1）蛋白提取 2）蛋白电泳（分离不同分子量蛋白） 3）转移 4）封闭 5）一抗作用 6）标记二抗（HRP/AP标记）作用 7）显色实验操作：nullWestern blot 特点：优点： 直接检测蛋白质的表达量。缺点： 灵敏度低 一抗制备难度大，购买价格高 容易出现交叉反应 不能细胞定位null4、免疫组化标记抗体与组织细胞作用。 根据信号强弱判断表达强度， 根据信号位置判断表达细胞。eNOS表达（对照）（实验）null实验操作1）组织切片（石蜡/冰冻） 2）封闭，内源性过氧化物酶失活 3）一抗作用 4）二抗（HRP标记）作用 5）显色 6）复染，封片null免疫组化特点：优点： 细胞定位缺点： 定量不准确，人为因素干扰大 （图象分析系统）null5、基因芯片特定载体上密集的大量探针与荧光标记 的样品反杂交。 根据杂交信号强弱判断基因表达强度。null基因芯片特点：优点： 一次杂交可以得到大量表达信息。通用 性好。缺点： 成本高，需要专门设备。null 人类基因组揭示了人类有3—4 万个基因，转录本多达10万个。基因不 同时空表达是细胞结构和功能的基础； 是组织、器官和系统发育和分化的基础； 也是大多数细胞病变的基础。了解不同 状态下的基因表达调节机制是后基因组 时代的主要任务，是探索生命本质的重 要环节。结束语谢谢