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地衣芽孢杆菌β-1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆和表达 *基金项目：高等学校骨干教师资助计划资助和国家自然科学基金（No.30000118）。吕文平：1968年生，博士研究生。 E-mail: . **通讯作者。Author for correspondence. E-mail:. 收稿日期：2003-07-25 接受日期：2003-09-19 农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12 (4): 446~449 ·研究论文· 地衣芽孢杆菌 β -1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆和表达 * 吕文平许...

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资助和国家自然科学基金（No.30000118）。吕文平：1968年生，博士研究生。 E-mail: < wplu@zju. edu. cn>. **通讯作者。Author for correspondence. E-mail:. 收稿日期：2003-07-25 接受日期：2003-09-19 农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2004,12 (4): 446~449 ·研究

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· 地衣芽孢杆菌 β -1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆和表达 * 吕文平许梓荣 ** 杜文理李卫芬孙建义（浙江大学饲料科学研究所教育部动物分子营养重点实验室，杭州 310029）摘要：提取地衣芽孢杆菌（）基因组，通过 PCR克隆了该菌的 β -1,3-1,4-葡聚糖酶基因全长。该基因全长 818 bp,ORF为 732 bp,编码 243个氨基酸，计算分子量为 27.35 kD，等电点为 8.31。经 Blast分析，该序列与短小芽孢杆菌 ( )同源性最高（99%），而与基因库中地衣芽孢杆菌的同源性为 94％，该基因已被 GenBank接受（AY225317）。用 H玉和玉双酶切目的片断和表达载体 pET-30a(+)后相连接，构建重组表达载体 pET-lic，并导入大肠杆菌( )BL21菌株中表达。酶学特性表明：SDS-PAGE电泳在 27 kD左右有表达蛋白带，该工程菌总酶活达 67.34 U/mL，是出发菌的 60倍，最适温度在 50 ℃左右，最适 pH在 5～ 6之间。该工程菌可作为材料构建耐热性好和酶活高的杂合基因工程菌。关键词：β -1,3-1,4葡聚糖酶；地衣芽孢杆菌；克隆；表达 Cloning and Expression of β -1,3-1,4-glucanase Gene from * Lü Wen-Ping XU Zi-Rong** DU Wen-Li LI Wei-Feng SUN Jian-Yi (Key Laboratory of Animal Molecular Nutrition, Ministry of Education, Feed Science Institute, Zhejiang University, Hangzhou 310029,China) A gene encodingβ -glucanase from was cloned and expressed in .. The whole length of the gene was 818 bp, including an ORF of 732 bp and encodeing 243 amino acids. The enzyme showed a molecular size of 27.35 kD and a pI of 8.31. The nucleotide sequence of the gene shared high degree of sequence similarity to that of and accessed in GenBank, and their similarities were 99% and 94％ respectively. The gene has been registered in Genank (Accession number is AY225317). The gene from recombinant cloning plasmid was subcloned into H玉and 玉site of ex- pression plasmid pET-lic in . The recombinant expression plasmid was transformed into strain BL21. The result of SDS-PAGE showed that about 27 kD protein of theβ -1,3-1,4-glucanase was expressed in strain BL21. The enzyme activity of expressed strain was 67.34 U/mL, which was about 60-fold higher than that of original strain. The pH and temperature at the highest activity was found were pH 5~6 and 50℃ respectively. It’s a good material for gene engineering to construct highly active and thermophilic enzymatic gene. β -glucanase; ; cloning; expression β - 葡聚糖是植物细胞壁中结构性非淀粉多糖，它是以 β -1,3和 β -1,4混合糖苷键连接形成的 D-葡萄糖聚合物[1]。大麦中 β -葡聚糖的含量高达 4.0%~8.0％，当它用作啤酒原料时，β -葡聚糖会降低麦汁的分离速度和浸出率，而且会增加啤酒的混浊度和胶状沉淀物,造成啤酒质与量的下降[2]；当大麦用作饲料原料时 β -葡聚糖使食糜具有很高的粘度，阻碍肠道消化液与食糜的混合，影响营养物质特别是蛋白质和脂肪的消化吸收，降低饲料转化率[3]。 β -1,3-1,4-葡聚糖酶（EC3.2.1.73，以下简称为 β -葡聚糖酶）是高效、专一分解 β -葡聚糖的主要酶，在啤酒和饲料的生产过程中添加该酶能有效地解决上述问题[3]。国外已克隆和表达了不同来源的 β -葡聚糖酶基因[4,5],并得到广泛的应用。目前我国 PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建 www.fineprint.cn 第 4 期吕文平等:地衣芽孢杆菌 β -1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆和表达对 β -葡聚糖酶的研究还处于起步阶段，酶产量和比活低，耐热性较差，不适合工业化生产的要求[6]。本研究报道地衣芽孢杆菌 β -葡聚糖酶基因的克隆和在大肠杆菌中表达，旨在筛选酶活高的基因工程菌，为构建耐热且酶活高的基因工程菌奠定基础，促进我国啤酒、饲料工业的发展。 1 材料和方法 1.1 菌种和质粒地衣芽孢杆菌（）购自浙江省农业科学院微生物研究所，大肠杆菌 ( ) JM109、 BL21 和表达载体 pET-30a 由本室保存， pGEM-T Easy Vector 购自 Promega公司。 1.2 试剂 β -葡聚糖购自 Sigma公司（St.louis,MO）；基因组提取试剂盒购自杭州维特洁生化技术公司；凝胶回收试剂盒（QIAqueick DNA gel extraction kit）为 QIAGEN公司产品；PCR试剂、质粒提取试剂盒（Wizard Kit）均为 Promega 公司产品， SephadexG-25、SephadexG-100、EAE-SephadexA-50 和标准蛋白（ codeRPN756）购自 Amersham Pharmacia Bioteach公司。 1.3 β-葡聚糖酶基因的克隆 1.3.1 β -葡聚糖酶基因扩增基因组提取参照试剂盒操作说明进行。以基因组为

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，95℃水浴变性 5 min。据和 β -葡聚糖酶的同源性，

设计

领导形象设计圆作业设计 ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计

1对可获得全长编码序列的 PCR引物,引物序列分别为： 6-5PA3: 5'-ATGATGACCGACGATGAGAT-3'； 6-3PA3: 5'-AATGAGCGTGAAAGTGGAGTGGAGT-3'。 PCR反应体系（50 滋L）为：10× PCR缓冲液 5 滋L，MgCl2 (25 mmol/L)3 滋L, dNTP (10 mmol/L) 1 滋L，引物各 1 滋L，模板 1 滋L，酶（10 000 U/mL） 0.5 滋L,H2 O 37.5 滋L。PCR 程序如下：（1）94℃ 2 min；（2）94℃ 1 min， 50℃ 1 min，每个循环降 0.3℃，72 ℃ 1 min；（3）第 2步重复 35次；（4）72 ℃ 10 min；（5）4 ℃保存； PCR反应在 PTC-200型热循环仪上进行。 1.3.2 β -葡聚糖酶基因克隆 PCR 产物经 1.0％琼脂糖凝胶电泳，用试剂盒回收扩增 DNA片断；回收产物与 pGEM-T Easy Vector经 T4连接酶 4 ℃连接过夜后，将连接产物加入到感受态 JM109中，42 ℃热激转化；150 r/min摇 1 h。接种在含氨卡青霉素的（Amp）LB固定培养基（加 X-gel和 IPTG）上过夜，挑单菌落接种于含 Amp的液体 LB培养基中，于 37℃培养过夜。质粒提取采用Winzard kit,并用 PCR方法鉴定（条件同上）,测序由上海生工测序。 1.4 β-葡聚糖酶基因在大肠杆菌 BL21中表达 1.4.1 β -葡聚糖酶基因亚克隆根据测序结果设计表达引物, 6-5PB3: 5'-AATGGATCCATGTCTTACCGTGTAAA-3' HⅠ ; 6-3PB1：5'-AAACTCGAGCTCTATTTAAATGAAGA-3′ 。引入酶切位点 ⅠTTA为终止密码子，以重组克隆载体为模板进行 PCR扩增，PCR反应体系和程序同上。 1.4.2 PCR 产物和表达载体酶切 PCR 产物经 H玉和玉37 ℃双酶切 12 h 后，65 ℃灭活 10 min。酶切产物经凝胶电泳并回收酶切 DNA片断。 1.4.3 表达载体与基因产物连接 4℃连接过夜，转化入感受态 BL21细胞中，并涂布 LB固体培养基（含 Kan 30 滋g/mL）过夜。随机挑取单个菌落，分别接种于 3.0 mL LB培养液。以菌液为模板，PCR 方法鉴定阳性菌 (除 1.3.1（1）94 ℃ 2 min改为 5 min外，其它条件同上)。 1.4.4 阳性菌诱导表达将阳性菌转接入 50 mL LB培养液，37 ℃ 150 r/min培养过夜，至对数生长期加 IPTG(50 滋g/50 mL)诱导表达，再培养 4和 8 h。 1.5 表达产物 SDS-PAGE电泳参照文献[7]进行。 1.6 酶的生物学特性研究 β -葡聚糖基因的分离和纯化参照文献[8]。蛋白质含量的测定以牛血清蛋白为标准，采用考马斯亮蓝法，详细步骤参见文献[9]。β -葡聚糖活力测定参见文献[8]，并作适当的修改。用 DNS法测定葡萄糖的含量[9]。酶活力单位定义：在一定的条件下，每分钟产生相当于 1 滋mol葡萄糖的酶量为 1个酶活力单位（U）。 2 结果和分析 2.1 酶基因 PCR扩增以基因组 DNA为模板进行 PCR扩增，扩增产物经凝胶电泳后，发现有 1条 800 bp左右的特异性条带，与预计大小一致（图 1）。 2. 2 PCR产物克隆将特异性条带割胶回收，然后与 pGEM-T Easy 447 PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建 www.fineprint.cn 农业生物技术学报 2004 年 vector于 4 ℃连接过夜，取 5 滋L连接产物转化至 JM109宿主菌。将转化后的菌液涂布于 LB固体培养基上（含 1 滋g/mL Amp）, 37 ℃培养过夜，挑取单个菌落培养。抽提质粒并用同样引物和条件进行 PCR鉴定，发现有 2个扩增出和目的片段大小相同的条带，说明为阳性重组质粒。图 1.β -葡聚糖酶基因 PCR扩增产物 Fig.1. PCR product of β -glucanase gene M, 100 bp ladder marker；1, PCR product of β -1,3-1,4-glucanase 2.3 β-葡聚糖酶基因的序列分析茁-葡聚糖酶基因测序表明：该基因全长 818 bp, 已被 GenBank收录（Accession nuber AY225317）。经 Blast同源性分析，该序列与 GenBank登录的地衣芽孢杆菌( X57279)核苷酸序列仅有 94%的同源性,氨基酸同源性也仅有 97％，这可能是株系不同的缘故。而与短小芽孢杆菌( AY164456.1)同源性高达 99%,只有 3个核苷酸不同,氨基酸同源性达 98%；短小芽孢杆菌的该基因是作者首次登录的新基因，种内差异大于种间差异现象说明, 并不能用任意一个基因同源性来对菌种进行分类。用 DNA Tools分析表明，该基因 ORF为 732 bp,编码 243个氨基酸，计算分子量为 27.35 kD，等电点为 8.35。其中疏水氨基酸占 35.8％，中性亲水氨基酸占 46.9％，酸性氨基酸占 9.9％，碱性氨基酸占 7.4％。在起始密码子之前有一个核糖体结合位点（GTCGTC），前 27个氨基酸为信号肽序列，它不具有典型的信号肽特征，N-端只带几个正电荷氨基酸，其后为疏水氨基酸和亲水氨基酸交替排列，最后为 Ala-X-Ala信号肽的酶切位点。因此，成熟的蛋白质由 216个氨基酸残基组成,理论分子量为 24.46 kD，等电点为 6.93。 2.4 重组表达载体的构建表达空载体（pET-30a）和亚克隆 PCR产物经 H玉和玉双酶切后，连接产物转化入 BL21 感受态细胞中，涂 LB 平板（含 Kan 30 滋g/mL）,平板上长出很多白色菌落 ,随机挑取 10个菌落，接种于 3.0 mL LB培养液中。以菌液为模板 PCR鉴定，发现 2个菌落有目的基因条带，说明这 2个菌为含有茁- 葡聚糖基因的阳性基因工程菌，命名为 pET-lic。 2.5 表达产物 SDS-PAGE电泳阳性基因工程菌 pET-lic 诱导培养后进行 SDS-PAGE 电泳，与含空载体的 BL21 菌相比， pET-lic在 27 kD左右有表达的蛋白条带（图 2），与地衣芽孢杆菌茁-葡聚糖酶蛋白理论分子量相近。图 2.地衣芽孢杆菌 β -葡聚糖酶基因在大肠杆菌 BL21中表达 Fig. 2. Expression of β -1, 3-1, 4-glucanase gene in BL21 1, maker of protein; 2, BL21 contained pET-lic IPTG uninduced; 3, BL21 contained pET-lic IPTG induced 4 h; 4, BL21 contained pET-lic IPTG induced 8 h. 2. 6 酶的生物学特性按方法所述，测得含 pET-lic培养工程菌的上清和菌体内都有较高的酶活性，总酶活在最适温度为 67.34 U/mL,是出发菌株（1.12 U/mL）的 60 倍，上清液、胞内的酶活分别为 29.1 U/ mL、7.7 U/ mL 和 30.6 U/ mL，分别占总酶活的 43.2％、11.4％和 45.4％。经采用硫酸铵沉淀、SephadexG-25、 SephadexG-100 和 DEAE-SephadexA-50 过柱得到较为纯的 pET-lic葡聚糖酶样品，研究温度和 pH对它的影响，结果表明：最适温度(图 3)在 50 ℃左右； 40℃时的酶活和最适温度相同，在 80 ℃时仅有 10％。在耐热性方面（图 4）：2 min 50℃、60℃分别是最适温度酶活的 84％和 27％，70℃仅有 7％。最适 pH(图 5)7~8之间，pH 5~8对酶的影响不大，酶也较稳定（图 6），分析表明，pET-lic β - 葡聚糖酶的酶活较出发菌有很大的提高，分泌性也较好。但热稳定性和 pH稳定性还不能满足饲料工业对酶的要求，所以，可暂选定 pET-lic 为酶活高的基因，作为构建耐热性好、酶活高的基因工程菌的材料。图 3.温度对 pET-licβ -葡聚糖酶活性的影响 Fig.3. Effect of temperature on β -glucanase pET-lic activity 448 PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建 www.fineprint.cn 第 4 期吕文平等:地衣芽孢杆菌 β -1,3-1,4葡聚糖酶基因的克隆和表达图 4. pET-licβ -葡聚糖酶的耐热性 Fig.4.Termostability of β -glucanase pET-lic activity 图 5. pH对 pET-licβ -葡聚糖酶活性的影响 Fig.5. Effect of pH on β -glucanase pET-lic activity 图 6. pET-licβ -葡聚糖酶对 pH的稳定性 Fig.6. pH stability of β -glucanase pET-lic activity 3 讨论大麦中含有较多的 β -葡聚糖，它是一种抗营养因子，极大地限制了大麦作为能量饲料和酿酒原料的应用[2]。添加 β -葡聚糖酶可以有效地消除 β - 葡聚糖的抗营养特性，提高大麦的利用价值。作为工业化生产 β -葡聚糖酶对酶特性要求：产酶量高、耐热性好、pH稳定，培养条件不复杂等，而耐热性和产酶量是酶工业化生产和应用的主要问题。我们课题组成功地从堆肥中筛选了一株产 β -葡聚糖酶的嗜热厌氧古细菌（ .sp）,并得到耐热性好的基因工程菌（最适温度为 80 ℃），但该酶在动物生理温度 40℃时的酶活较低，因而需要进一步改造。从原始产酶工程菌的产酶量看，地衣芽孢杆菌酶活仅次于淀粉液化芽孢杆菌，而该酶的动物的生理温度酶活较高，40℃时的酶活是 sp的 7.2 倍，分泌性也较好。大肠杆菌的表达系统分泌到培养基里的酶很少，但我们用 pET-30a为载体，以 BL21为宿主菌的表达系统时，发现有 80%β -葡聚糖酶基因能分泌表达，这可能是与该基因的信号肽以及基因的结构、培养基和诱导时间有关。值得一提的是作者在构建既耐热又酶活好的基因时，用不同的基因结构域杂合，杂合基因工程菌的分泌性也得到一定的改善。从获得 pET-lic基因工程菌酶特性来看，该工程菌是原产酶菌的 60 倍，这可能是 pET-lic在 T7强启动子的调控下，使基因达到较高的表达量，而原菌种的调控序列只是适应生存的需要来产酶的。另外，pET-30a系列表达系统的质粒是一种松驰型的，可以大量复制质粒也使酶基因的拷贝数大幅提高，从而使表达量达到较高的水平。但是该酶的耐热性较差，需要进一步改造以适应工业化生产的要求。该工程菌暂选定 pET-lic为酶活高的基因，是构建耐热性好和酶活高的杂合基因工程菌的材料。参考文献 1 Henry R J. A comparison of the non-starch carbohydrates in cereal grains. J Sci Food Agric，1985，36：1243~1253 2 Annison G，Choct M. Anti-nutritive activities of cereal non-starch polysaccharides in broiler diets and stratages for minimizing their effects. J Poultry Sci，1991，47：32~42 3 Flint H J， Mcpherson E C， Bisset J. Molecular cloning of genes from encoding xylanase and β (1,3-1,4) glucanase activities. J Appl Environ Microboil，1989，55：1230~1233 4 Henrissat B，Bairoch A. New families in the classification of glycosyl hydrolases based on amino acid sequence similarities .J Biochem J，1993，293：781~788 5 Antoni P. Bacterial 1,3-1,4-β -glucanases:structure,function and protein engineering.J Biochimi Biophysica Acta,2000, (1543):361~382. 6 Li W-F(李卫芬)，Sun J-Y(孙建义)，Gu S-H(顾赛红). Studies on stability ofβ -glucanase form strain GXC. J Southwest Agric Univ(西南农业大学学报)，2001， 23（2）：97~99(in Chinese with English abstract) 7 Sambrook J, Maniatis E F T. Molecular Cloning（version 2），Beijing: Science Press, 1996.(in Chinese) 8 Li W-F (李卫芬)，Sun J-Y (孙建义 )，Gu S-H ( 顾赛红). Purification and properties of β -glucanase produced form strain GXC of J Mycosystema(菌物系统 ) 2001,20（2）178~183(in Chinese with English abstract) 9 Borriss R，Buettner K， Maentsaelae P. Structure of the beta-1,3-1,4-glucanase gene of : homologies to other beta-glucanases . J Mol Gen Genet， 1990，222：278~283 449 PDF 文件使用 "pdfFactory Pro" 试用版本创建 www.fineprint.cn

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