甘草酸二胺对继发性胆汁淤积性肝纤维化大鼠模型肝细胞向肌成纤维细胞转分化的影响

收稿日期:2012 － 11 － 18 基金项目:浙江省教育厅科研资助项目(Y200908063) ;浙江省卫生 厅科技计划资助项目(2010kyb086) 作者简介:郗健伟(1953 －) ，男，浙江舟山人，副主任医师，学士，研 究方向:肝硬化诊治发病机制及中西医诊疗。 通讯作者:邱冰峰(1971 －) ，男，福建永泰人，副主任医师，博士，研 究方向:肝纤维化发病机制。 参考文献 ［1］ Yamashita M，Yamashita M，Ando Y． A long － term follow － up of lung function in survivors of paraquat poisoning［J］． Hum Exp Toxicol，2000，19(2) :99 － 103． ［2］ Zhi Q，Sun H，Qian X，Yang L． Edaravone，a novel antidote a- gainst lung injury and pulmonary fibrosis induced by paraquat ［J］． Int Immunopharmacol，2011，11(1) :96 － 102． ［3］ 于晟，时圣武，薛晓东，等．复方红景天对大鼠高原严重烧伤 后早期肺脏损伤的保护作用［J］． 中国中医急症，2004，l3 (11) :760 － 761． ［4］ 金明姬，玄美燕，朴海峰，等．红景天提取物对油酸致豚鼠急 性肺损伤预防作用的研究［J］．中国医院药学杂志，2009，29 (18) :1563 － 1566． ［5］ 李莺，武蕾，赵辉，赵澎涛．红景天苷对脂多糖所致急性肺损 伤治疗作用的研究［J］． 心脏杂志，2011，23(3) :322 － 325， 330． ［6］ 孔庆福，张华，王丽，急性百草枯中毒早期器官损害与细胞因 子的变化［J］．中国中西医结合急救杂志，2010，17(3) :159 － 162． ［7］ 高渝峰，史晶，刘青，等．大剂量氨溴索对急性百草枯中毒致 肺损伤患者血清 TNF － α和 IL － 6 的影响［J］．新医学，2010， 41(6) :369 － 371． ［8］ 齐洛生，杨宏富，孙荣青，张少雷． 血液灌流治疗百草枯中毒 的临床总结［J］． 中国中西医结合急救杂志，2010，17(5) : 311 － 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01) ，肝功能显著改善( P ＜ 0． 01) ，肝组织纤维增生程度、Hyp 含量及 α － SMA 蛋白表达量显著下降( P ＜ 0． 01) ，HepPar蛋白表达显著升高( P ＜ 0． 01) 。结论:甘草酸二铵可有效地抑制 BDL大 鼠肝纤维化模型肝组织肝细胞向肌成纤维细胞转分化，这可能也是甘草酸二铵干预胆汁淤积性肝纤维化的主要 效应机制之一。 关键词:继发性胆汁淤积;肝纤维化; BDL; EMT;甘草酸二铵 中图分类号:R285． 5 文献标识码:A 文章编号:1673 － 7717( 2012) 04 － 0824 － 04 Experimental Research of the Diammonium Glycyrrhizinate Intervention for Hepatocytes Transdifferentiate to Myofibroblaston Secondary Cholestatic Hepatic Fibrosis Rats XI Jianwei，QIU Bingfeng，XU Fangming，XU Qi，XU Tangzhou (Zhoushan Hospital in Zhejiang，Zhoushan 316000，Zhejiang，China) Abstract:Objective:To investigate the influence of diammonium glycyrrhizinate for hepatocytes transdifferentiate to 428 第 31 卷 第 4 期 2 0 1 3 年 4 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 31 No． 4 Apr． 2 0 1 3 中 华 中 医 药 825 学 刊 myofibroblast on secondary cholestatic hepatic fibrosis rats． Methods:Cholestatic hepatic fibrosis in seventy SD male rats were induced by ligation of bile duct，and sham control group(n = 15)was only made choledochus segregated． 1 week af- ter BDL，rats were divided into model control group(M，n = 30)and drugs intervention group randomly(Y，n = 30)． The diammonium glycyrrhizinate intervention was lasted for 4 weeks by caudal vein injection，then rats of M group were NS． All of rats were sacrificed 5 weeks after operation for determining liver histology，hepatic function and hepatic hydroxypro- line content(Hyp)． Co － immunofluorescence staining of the myofibroblast marker α － SMA and the hepatocyte specific antigen Hep par were detected by laser confocal microscopy，while protein expression of Hep par and α － SMA were meas- ured by Western blot analysis． Result:Compared with that of sham control group，mortality of model control group rats was 33． 3% and ascites frequency was 90． 0%，while hepatic function was abnormal significantly，Hyp content of liver tissue and protein expression of α － SMA were increased obviously in model control group，but protein expression of Hep par was decreasely obviously，and many positive cells of Hep Par /α － SMA were observed． Compared with that of model control group，mortality and ascites frequency were decreased significantly and weight of spleen were lessened obviously，while he- patic function was improved significantly． Hyp content of liver tissue and protein expression of α － SMA were both de- creased(P ＜ 0． 01) ，while protein expression of Hep par was increasely obviously． Conclusions:Diammonium glycyrrhiz- inate can restrain the hepatocytes transdifferentiate to myofibroblast，which may be a key step in the process of interventing and treating cholestasis fibrosis． Key words:secondary cholestasis;hepatic fibrosis;BDL;EMTdiammonium glycyrrhizinate 星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)的活化是各种病 因引起肝纤维化的中心事件，但对大鼠胆管结扎(bile duct ligation，BDL)模型中肝脏 α － SMA 阳性的肌成纤维细胞 (myofibroblast，MF)来源的研究仍是目前肝纤维化领域的 热点问之一［1］。近有学者研究发现，大鼠 BDL后肝纤维 化形成过程中，存在肝细胞向肌成纤维细胞转分化的病理 现象，并认为肝细胞向肌成纤维细胞转分化为 BDL 胆汁淤 积肝纤维化形成的关键病理环节［2］。甘草酸二胺为中药 甘草有效成分的提取物，目前临床已广泛用于各种肝纤维 化的治疗［3］，因甘草酸二胺具有抑制 EMT过程中关键细胞 因子 TGF － β1 的表达的作用［4 － 5］，故我们认为甘草酸二胺 抗胆汁淤积性肝纤维化的作用可能与抑制肝细胞 EMT 有 关。为此，本文采用胆总管结扎制备继发性胆汁淤积肝纤 维化大鼠模型，从肝细胞向胆管上皮细胞转分化的角度出 发，深入探讨甘草酸二胺治疗胆汁淤积性肝纤维化的作用 机制。 1 和方法 1． 1 动物 SD雄性大鼠 75 只，SPF级，体重 180 ～ 220 g，购自中国 科学院上海实验动物中心，许可证号:SCXK(沪)2005 － 0006，舟山医院动物实验中心饲养、造模和观察，自由饮食。 1． 2 药物 甘草酸二胺购自浙江中医药大学中药研究所。 1． 3 主要试剂 肝功能测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，羟 脯氨酸品购自日本ナカティテスク株式会社，蛋白定 量试剂盒购自 Bio － Rad公司，小鼠抗大鼠 α平滑肌肌动蛋 白(α － smooth muscle actin，α － SMA)抗体购自 Abcam 公 司，小鼠抗大鼠单克隆抗 Hep Par抗体购自 Dako Cytomation 公司;单克隆抗甘油醛三磷酸脱氢酶抗体(GADPH)购自康 成公司，辣根过氧化物酶(HRP)标记山羊抗小鼠抗体购自 晶美生物技术公司，western blot分析 marker购自 New Eng- land Biolabs 公司，ECL 发光试剂盒购自 Pierce 公司，生物 素，生物素结合链霉素、Alexa Fluor 633 goat anti － mouse IgG2a、CY3 山羊抗小鼠荧光二抗均购自 Jackson公司。 1． 4 模型制备 75 只大鼠标号后，随机分为 15 只假手术对照组 (Sham)与 60 只胆管结扎(bile duct ligation，BDL)组;大鼠 予戊巴比妥钠(50 mg·kg)腹腔注射后，常规腹部皮肤消 毒，沿腹正中线切开，暴露胆总管，假手术对照组仅分离胆 总管后关腹;胆总管结扎组参照以往报道的方法进行［6］， 即将胆总管远近两端作双重结扎后自中间剪断胆总管，关 腹。 1． 5 分组与用药 大鼠胆总管结扎手术后 1 周，随机分为模型对照组 (M，n = 30)与药物干预组(Y，n = 30) ，药物干预组大鼠于 术后 1 周开始予甘草酸二胺(300 mg /2 mL /kg 大鼠体重) 经尾静脉注射治疗，假手术对照组与模型对照组大鼠给生 理盐水注射(2 mL /kg大鼠体重) ，1 日 1 次，共 4 周。 1． 6 标本的采集和处理 术后 5 周，所有大鼠麻醉(同前)条件下打开腹腔，观 察肝脏的大体形态及腹水情况，用注射器抽取腹水、称量; 下腔静脉采血、分离血清;摘取肝、脾并称重，留取肝组织。 1． 7 观察项目与方法 1． 7． 1 一般情况 包括大鼠的皮肤黏膜颜色及形态，死亡 情况，肝脏形态，肝脾质地、重量以及腹水形成情况等。 1． 7． 2 肝功能 按照南京建成生物工程研究所试剂盒的 方法检测血清白蛋白(Alb)与总胆红素(TBil)含量、丙氨酸 氨基转移酶(ALT)、门冬氨酸氨基转移酶(AST)、谷氨酰转 移酶(GGT)及碱性磷酸酶(ALP)活性。 1． 7． 3 肝组织羟脯氨酸( Hyp) 含量测定 用 Jamall 氏等 人的方法［7］。 1． 7． 4 肝组织学观察 肝组织经 10%中性甲醛固定，石 蜡切片，按常规方法行 HE及天狼猩红染色，光镜下观察肝 528 第 31 卷 第 4 期 2 0 1 3 年 4 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 31 No． 4 Apr． 2 0 1 3 中 华 中 医 药 826 学 刊 组织的病理变化;采用 IPP软件分析天狼星红染色结果:即 每例组织切片随机观察 5 个视野(200 ×) ，采用 IPP分析软 件检测分析，即将图像中阳性染色区域作为 AOI(area of in- terest) ，检测其平均光密度(累积光密度(integrated optical density，IOD)除以同一视野积总面积)。 1． 7． 5 肝组织 CK 7 及 Hep Par 蛋白表达 采用 Western blot方法检测。提取总蛋白，95 ℃ ～ 100 ℃变性 5 min→ 10% SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 2． 5 h→转膜(半干转) ，封闭 →加入一抗工作液(CK 7 与 Hep Par，均为 1 ∶ 1500) ，4 ℃孵 育过夜，洗涤后与辣根过氧化物酶(HRP)偶联的二抗室温 孵育 2 h，再洗涤→ECL显影、曝光→同一张膜重新封闭，加 入 GAPDH抗体稀释液(1 ∶ 5000)作为内参照→应用复日 FR － 980 生物电泳图像分析系统分析底片中的目的条带， 计算机自动读取并每个条带的积分值，以样品积分值 / 内参照积分值比值进行统计学分析。 1． 7． 6 肝组织 a － SMA 及 Hep Par 免疫荧光共定位 肝 组织冰冻切片(8 μm) ，室温下复温 30 min后予 4%多聚甲 醛固定，PBS洗 5 min × 3 次，3% H2O2孵育 3 min以消除内 源性过氧化物酶，5%小牛血清封闭 30 min，单克隆抗 Hep Par抗体(1:25)37 ℃孵育 120 min，PBS 洗 5 min × 3 次， CY3 荧光二抗(1 ∶ 200)37 ℃孵育 60 min，PBS 洗 5 min × 3 次;多克隆抗 SMA抗体(1 ∶ 200)37 ℃孵育 120 min，PBS洗 5 min × 3 次，Fitc荧光二抗 37℃孵育 60 min，PBS 洗 5 min × 3 次，50%硝酸甘油封片，激光共聚焦显微镜下观测。采 用 IPP软件分析阳性染色区域，方法同上。 1． 8 统计学处理 采用统计分析软件 SPSS 13． 0，计量资料采用珋x ± s 表示， 多组数据比较采用单因素方差分析(One － Way ANOVA);计 数资料采用 X2检验;两变量之间的相关关系采用直线回归方 程进行相关分析，P ＜0． 05为差异具有统计学意义。 2 结 果 2． 1 一般情况 Sham对照组大鼠无死亡，M 组死亡 10 只(33． 3%) ，Y 组死亡 3 只(10． 0%)。与 Sham 大鼠比较，M 组大鼠腹部 膨隆，黏膜及巩膜黄染，大鼠肝脏表面粗糙，呈橘皮样，质地 坚韧，肝脏、脾脏重量显著增加(P ＜ 0． 01) ，见表 1;与 M 组 比较，Y组大鼠的腹部膨隆、黏膜黄染程度较轻，肝脏表面 较为光滑，质地较软，脾脏重量显著下降(P ＜ 0． 01) ;Sham 组无腹水生成，M组 20 只中 18 只出现腹水(90． 0%) ，Y组 27 只中 15 只出现腹水(55． 6%) ，显著低于 M 组(P ＜ 0． 05) ，见表 2。 表 1 各组大鼠肝脏、脾脏重量及腹水发生状况 组别 n 肝脏重量(g) (珋x ± s) 脾脏重量(g) (珋x ± s) 腹水 无 少量 (1 ～ 5 g) 中量 (5 ～ 10 g) 大量 (＞ 10 g) Sham 15 11． 32 ± 1． 16 1． 00 ± 0． 18 15 0 0 0 M 20 20． 37 ± 3． 65* 2． 57 ± 0． 43* 2* 1 4 13 Y 27 18． 52 ± 3． 83# 1． 62 ± 0． 38# 12# 8 4 3 注:Sham:假手术组，M:模型对照组，Y:甘草酸二铵;与 Sham 组比较，* P ＜ 0． 01;与 M比较，#P ＜ 0． 01。 2． 2 肝功能及 Hyp含量变化 与 Sham组比较，M组血清 ALT、AST、ALP 活性及 TBil 含量均显著增高(P ＜ 0． 01) ，Alb 含量显著下降(P ＜ 0． 01) ;肝组织 Hyp 含量显著增加(P ＜ 0． 01) ;与 M 组比 较，Y组血清 Alb含量显著升高(P ＜ 0． 01) ，血清 AST、ALP 活性及 TBil、肝组织 Hyp含量显著降低，见表 2。 表 2 各组大鼠血清肝功能及肝组织 Hyp含量变化(珋x ± s) 组别 n TBiL(mg /dL) Alb(g /L) ALT(U /L) AST(U /L) GGT(U /L) ALP(U /dL) Hyp (μg /g湿肝重) Sham 15 0． 83 ± 0． 24 26． 32 ± 3． 65 12． 51 ± 1． 17 28． 56 ± 1． 79 2． 38 ± 1． 07 33． 25 ± 13． 31 141． 5 ± 15． 7 M 20 5． 96 ± 0． 65* 14． 43 ± 2． 71* 78． 28 ± 15． 76* 127． 58 ± 15． 56* 112． 30 ± 21． 35* 79． 22 ± 7． 51* 1156． 2 ± 157． 36* Y 27 4． 62 ± 0． 38# 17． 47 ± 2． 95# 58． 31 ± 13． 25# 81． 48 ± 11． 82# 56． 57 ± 15． 72# 63． 27 ± 9． 12# 845． 2 ± 93． 22# 注:Sham:假手术组，M:模型对照组，Y:甘草酸二铵干预组;与 Sham组比较，* P ＜ 0． 01;与 M比较，#P ＜ 0． 01。 2． 3 肝脏组织学观察 HE染色:Sham 组肝小叶结构完整，肝索排列整齐，未 见炎症细胞浸润;M组大鼠肝细胞显著减少，其周围见少量 炎性细胞浸润;与 M 组比较，Y 组大鼠的肝细胞减少的程 度显著减轻，见插页Ⅳ图 1。 天狼星红染色:Sham组肝组织未见纤维增生，与 Sham 组比较，M组大鼠肝组织纤维增生显著增加(P ＜ 0． 01) ;与 M比较 Y组大鼠肝组织纤维增生显著减少，见插页Ⅳ图 2。 2． 4 肝组织 Hep Par蛋白表达变化 与 Sham组比较，M组大鼠 Hep Par蛋白表达显著低于 Sham组(P ＜ 0． 01) ;与 M组比较，Y组大鼠肝组织 Hep Par 蛋白表达显著升高(P ＜ 0． 01) ，见插页Ⅳ图 3。 2． 5 肝组织 α － SMA蛋白表达变化 与 Sham组比较，M 组大鼠 α － SMA 蛋白表达显著高 于 Sham组(P ＜ 0． 01) ;与 M 组比较，Y 组大鼠肝组织 α － SMA蛋白表达显著降低(P ＜ 0． 01) ，见插页Ⅴ图 4。 2． 6 肝组织 Hep Par /α － SMA免疫荧光共定位 采用激光共聚焦显微镜观察大鼠肝组织 Hep Par /α － SMA免疫荧光共定位情况，Sham组见大量的 Hep Par(红) 阳性及少量 α － SMA(蓝)阳性染色细胞，无 Hep Par与 α － SMA共染阳性细胞(紫色)。见插页Ⅴ图 5。与 Sham 组比 较，M组大鼠 Hep par阳染区域面积显著低于 Sham组(P ＜ 0． 01) ，而 α － SMA 阳染区域面积显著高于 Sham 组(P ＜ 0． 01) ，并出现大量 Hep par /α － SMA 共染阳性细胞(紫 色) ，见插页Ⅴ图 5 ～ 6，与 M 比较，Y 组大鼠虽然也出现大 量 Hep Par /α － SMA共染阳性细胞，但 Hep par阳染区域面 积显著升高(P ＜ 0． 01) ，而 α － SMA 阳染区域面积显著降 低(P ＜ 0． 01) ，见插页Ⅴ图 5、图 7。 3 讨 论 BDL［6］是研究胆汁淤积性肝纤维化病理机制广泛采用 628 第 31 卷 第 4 期 2 0 1 3 年 4 月 中 华 中 医 药 学 刊 CHINESE ARCHIVES OF TRADITIONAL CHINESE MEDICINE Vol． 31 No． 4 Apr． 2 0 1 3 中 华 中 医 药 827 学 刊 的模型。本文结果显示，大鼠 BDL 后，模型组 5 周内共有 30%大鼠死亡，肝组织 Hyp 含量逐渐增高，至第 5 周为 Sham组的 5 倍;肝组织 HE染色可见大量的胆管上皮细胞 增生，在增生的胆管上皮细胞周围见大量胶原纤维沉积、正 常肝细胞极度减少、炎症和坏死较轻，形成典型的胆汁淤积 性肝纤维化病变。 肝星状细胞的活化是各种病因引起肝纤维化的中心事 件，但对胆总管结扎模型大鼠肝脏 α － SMA 阳性的肌成纤 维细胞的来源问题仍是目前研究的焦点之一。先前研究认 为，在胆总管结扎后的 72 h内主要源于细胆管周围既存的 成纤维细胞，此后则主要来自活化的星状细胞［8］;而新近 研究的研究表明，CCL4 诱导的肝硬化大鼠肝细胞具有部分 间充质细胞特征［9］，有学者将大鼠肝细胞置于 TGF － β 的 培养基中培养，肝细胞特征基因(如白蛋白)不断下降，而 纤维母细胞特征基因，如 α － SMA、胶原及 FSP － 1 不断上 升［10 － 12］，以上研究表明，一定病理条件下，肝细胞可向肌成 纤维细胞转分化［13］。本文研究表明，大鼠胆总管结扎后 5 周，肝组织肝细胞标志物 HepPar［14］较假手术组显著降低， 而肌成纤维细胞标志物 α － SMA［15］显著升高，且出现大量 HepPar与 α － SMA共染阳性细胞，表明 BDL大鼠肝纤维化 过程中存在明显的肝细胞向肌成纤维细胞转分化病理变 化，而且这可能即是胆汁淤积性肝纤维化形成的关键因素 之一。 甘草酸二铵为甘草酸的 18α体，甘草酸单铵为 β体，α 体亲脂性大于 β体，α 仅在体内易与受体蛋白及类固醇激 素的靶细胞受体结合，具有抗炎、抗氧化、保护细胞膜及改 善肝功能等作用［16］，目前临床已广泛应用于各种慢性肝病 治疗，近年来研究发现，本品还具有较好的抗脏器纤维化作 用［4，17］，本实验研究表明，与同期模型对照组大鼠相比，甘 草酸二铵干预组大鼠死亡率显著降低;肝组织 Hyp 含量显 著降低，肝细胞的减少及纤维组织的增生程度明显减轻，充 分地显示出甘草酸二铵具有良好的抗继发性胆汁淤积性肝 纤维化作用。而进一步的研究表明，与同期模型对照组比 较，药物干预组大鼠肝组织 α － SMA蛋白表达量显著降低， Hep par蛋白表达量显著升高，且 Hep par /α － SMA 共染阳 性细胞显著减少，表明甘草酸二铵具有保护肝细胞，抑制肝 细胞向肌成纤维细胞转分化的作用，而这可能也是甘草酸 二铵抗肝纤维化的关键机制。 4 结 论 根据我们的研究及相关文献报道，我们认为肝细胞向 肌成纤维细胞转分化可能是继发性胆汁淤积性大鼠肝纤维 化形成过程中关键病理环节，抑制肝细胞向肌成纤维细胞 转分化可能是甘草酸二胺有效干预继发性胆汁淤积性肝纤 维化的主要效应机制之一。 参考文献 ［1］ Parola M，Marra F，Pinzani M． Myofibroblast － like cells and liv- er fibrogenesis:Emerging concepts in a rapidly moving scenario ［J］． Mol Aspects Med，2008，29:58 － 66． ［2］ Nadja M，Meindl － Beinker，Steven Dooley． Transforming growth factor － b and hepatocyte transdifferentiation in liver fibrogenesis ［J］． Journal of Gastroenterology and Hepatology，2008，23:122 － 127． ［3］ 林志强，符春茹．甘草酸二铵治疗各类肝病 629 例疗效观察 ［J］．海南医学，2006，17(3) :64 － 66． ［4］ 马立彬，邓刚，王呜，等．甘草酸二胺抗大鼠肾间质纤维化作 用及其机制［J］． 华中科技大学学报(医学版) ，2007，36 (12) :756 － 759． ［5］ 张建中，景丽，侯绍章，等．甘草酸对糖尿病大鼠肾脏转化生 长因子表达的影响［J］．中国临床药理学杂志，2010，131(9) : 673 － 676． ［6］ Ezure T，Sakamoto T，Tsuji H，et al． The development and com- pensation of biliary cirrhosis in interleukin － 6 － deficient mice ［J］． Am J 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