己烯雌酚对染镉草鱼GSH_Px_SOD和MDA影响的研究_李瑷伶

农业环境科学学报 2008,27(1):0350-0353 JournalofAgro-EnvironmentScience 摘 要:通过鱼缸染毒实验,研究了己烯雌酚(DES)对染镉(Cd)草鱼(Ctenopharyngodonidellus)抗氧化能力的影响。将实验草鱼 (体长(6.0±1.0)cm,体重(3.0±0.5)g)随机分为 5组,Ⅰ为空白组(0.00mg·L-1Cd+0.00mg·L-1DES),Ⅱ为单独 Cd处理组 (1.46mg·L-1Cd+0.00mg·L-1DES),Ⅲ(1.46mg·L-1Cd+1.00mg·L-1DES)、Ⅳ(1.46mg·L-1Cd+2.00mg·L-1DES)、Ⅴ(1.46mg· L-1Cd+3.00mg·L-1DES)为联合处理组。在染毒 24、72和 120h时测定草鱼肝胰脏谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性、超氧化 物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)的含量。结果明,Ⅲ组的抗氧化酶活性(GSH-Px,SOD)和抗氧化指数(GSH-Px/MDA)高 于Ⅱ组,其中 GSH-Px活性达显著(P<0.05),SOD活性在染毒 120h时具显著性(P<0.05),抗氧化指数在 72h和 120h时达极 显著(P<0.01);其MDA含量低于Ⅱ组,在72h和120h时差异显著(P<0.05)。表明 DES在 1.00mg·L-1浓度时对 Cd具有显著 的拮抗效应,增强了草鱼的抗氧化能力。Ⅳ、Ⅴ组与第Ⅲ组相比,抗氧化酶活性呈下降趋势,GSH-Px/MDA显著降低(P<0.05), MDA含量有所上升。说明随着DES浓度的增加,拮抗效应降低,抗氧化能力减弱。另外,随着染毒时间的延长,Ⅱ组的GSH-Px活 性和抗氧化指数下降,MDA含量上升;Ⅲ组的抗氧化酶活性(GSH-Px,SOD)在120h时增强,抗氧化指数上升,MDA含量降低。 关键词:草鱼;镉;己烯雌酚;谷胱甘肽过氧化物酶;超氧化物歧化酶;丙二醛 中图分类号:X503.225 文献标识码:A 文章编号:1672-2043(2008)01-0350-04 收稿日期:2007-03-16 基金项目:国家自然科学基金资助(30470320) 作者简介:李瑷伶(1984—),女,重庆万州人,硕士研究生,从事环境毒理学研究工作。 通讯联系人:张迎梅 E-mail:ymzhang@lzu.edu.cn 己烯雌酚对染镉草鱼GSH-Px、SOD和MDA 影响的研究 李瑷伶,蓝 昕,司万童,邴志桐,黄德军,张迎梅 (兰州大学生命科学学院,甘肃 兰州 730000) EffectofDiethylstilbestrolonGSH-Px,SODandMDAofGrassCarpExposedtoCadmium LIAi-ling,LANXin,SIWan-tong,BINGZhi-tong,HUANGDe-jun,ZHANGYing-mei (SchoolofLifeSciences,LanzhouUniversity,Lanzhou730000,China) Abstract:Theeffectofdiethylstilbestrol(DES)onantioxidationinhepatocyteofgrasscarp(Ctenopharyngodonidellus)exposedtocadmium (1.46mg·L-1)wasinvestigated.Grasscarps(6.0±1.0cmlong,3.0±0.5gweight)wererandomlydividedinto5groups,ascontrolgroupⅠ(0.00 mg·L-1Cd+0.00mg·L-1DES),singleCdgroupⅡ(1.46mg·L-1Cd+0.00mg·L-1DES),experimentalgroupsⅢ(1.46mg·L-1Cd+1.00mg·L-1 DES),Ⅳ(1.46mg·L-1Cd+2.00mg·L-1DES)andⅤ(1.46mg·L-1Cd+3.00mg·L-1DES).Theactivitiesofglutathioneperoxidase(GSH-Px) andsuperoxidedismutase(SOD)andthecontentofmalondialdehyde(MDA)inhepatocyteofgrasscarpweremeasuredafter24h,72hand 120hexposure.Boththeactivitiesofantioxidativeenzymes(GSH-Px,SOD)andtheantioxidationindex(GSH-Px/MDA)oftheexperimental groups(Ⅲ)werehigherthanthoseofthesingleCdgroup(Ⅱ):theactivityofGSH-Pxincreasedremarkably(P<0.05),andthatofSOD reachedsignificantlevelafter120hexposure(P<0.05),thesameasGSH-Px/MDAafter72hand120hexposure(P<0.01).Thecontentof MDAwaslower,showingsignificantdifferenceafter72hand120hexposure(P<0.05).SuchresultssuggestedthatDES(1.00mg·L-1)hadan evidentantagonisticeffectonCd,thusimprovedantioxidationingrasscarp(Ctenopharyngodonidellus)effectively.Comparedwithexperi- mentalgroup(Ⅲ),intheexperimentalgroups(Ⅳ,Ⅴ),theactivitiesofantioxidativeenzymes(GSH-Px,SOD)decreased,andGSH-Px/MDA droppedprominently(P<0.05)andthecontentofMDAincreased,indicatingthattheantagonisticeffectandantioxidationdescendedasthe concentrationofDESincreased.Andastheexposuretimeextending,theactivityofGSH-PxandGSH-Px/MDAofthesingleCdgroup(Ⅱ) decreasedwithrisingcontentofMDA,andintheexperimentalgroup(Ⅲ),theactivitiesofantioxidativeenzymes(GSH-Px,SOD)increased after120hexposurewithincreasingofGSH-Px/MDAanddecreasingofMDA. Keywords:grasscarp(Ctenopharyngodonidellus);cadmium(Cd);diethylstilbestrol(DES);glutathioneperoxidase(GSH-Px);superoxidedis- mutase(SOD);malondialdehyde(MDA) 第27卷第1期 农 业 环 境 科 学 学 报 工业废水和城市废水的肆意排放,造成了水体和 土壤中含有大量的镉(Cd)。Cd是一种通过食物链进 行转移蓄积的重金属污染物。越来越多的实验表明, Cd的毒性和氧化损伤有关。一方面Cd可以通过增强 细胞膜系统的脂质过氧化反应,产生大量自由基,造 成细胞氧化损伤;另一方面Cd可以抑制主要抗氧化 酶的活性,降低内源性抗氧化物谷胱甘肽(GSH)的 水平,使自由基不能及时清除,造成机体氧化损伤[1]。 Cd还可以造成DNA的损伤[2],具有明显的免疫毒性[3] 和雌激素样作用[4]。 己烯雌酚(diethylstilbestrol,DES)属人工合成的 雌激素类药物。有报道表明不合适剂量的DES可以 引起细胞的凋亡[5、6],而一些研究发现 DES对体外培 养的脑神经元具有保护作用,并具有浓度依赖性[7]。关 于DES对氧化损伤的作用的报道不多,张亚卓[8]等发 现DES可以使小鼠脑MDA含量显著降低,SOD活性 明显提高。王树元等[9]发现DES可以使大鼠失血性休 克脏器脂质过氧化物含量明显的降低。也有很多报道 表明与DES结构相似的雌性激素雌二醇具有抗氧化 作用[10、11]。而DES常被用作药物及饲料添加剂,常与 Cd共存于水体中。研究表明,当两种或两种以上的化 学物质共同作用于生物体时,往往会引起与单一毒物 作用完全不同的毒性效应[12]。已有报道表明在某些矿 区的水体中镉浓度可高达到1.40mg·L-1左右[13],因此 与实际情况相结合,本实验选择研究在 Cd(1.46mg· L-1,120hLC50/2)存在条件下,不同浓度 DES(1.00、 2.00、3.00mg·L-1)在草鱼抗Cd诱导的氧化损伤过程 中的作用,为更好地保护渔业资源提供依据。 1 实验 1.1实验动物 实验用草鱼 (Ctenopharyngodonidellus),体长 (6.0±1.0)cm,体重(3.0±0.5)g,购于兰州市雁滩花 鸟鱼市场。买回鱼苗驯养一周,选取行动活泼、表面无 损伤的健康草鱼,随机分为5组,每组15条,养于15L 的鱼缸中。水温为(16.0±1.0)℃,pH(7.3±0.5)。实 验期间每天换2/3染毒液以保持浓度稳定,染毒期间 不投喂饲料。 1.2实验药品 纯 CdCl2·2.5H2O(中国亭新化工厂);己烯 雌酚(DES)(石家庄协和药业有限公司)。 2 实验方法 2.1染毒质量浓度设计 镉和已烯雌酚的浓度设计见表1。 2.2氧化指标的测定 GSH-Px活性的测定方法参照董青等[14],略有改 动(增测了样品空白管,反应终止剂改用三氯乙酸); MDA含量的测定方法参照瞿执谦 [15](将过滤去杂质 的步骤改为了离心);SOD活性的测定方法参照蔡骏 等[16];蛋白质定量采用考马斯亮蓝法[17]。 2.3数据分析 差异显著性检验用方差分析进行,统计分析用 Excel2000软件。 3 实验结果 3.1GSH-Px活性、MDA含量和SOD活性的变化 如图 1所示,与空白组相比,染毒 24h时,Ⅱ和 Ⅲ组的 GSH-Px活性有所上升;染毒 72h和 120h 时,Ⅱ组始终低于空白组,联合处理组在72h低于空 白组,而在120h高于空白组。Ⅲ组三个染毒时段(24、 72、120h)的GSH-Px活性比Ⅱ组高,在120h具有显著性 表1镉和己烯雌酚的浓度设计 Table1Theconcentrationsofcadmiumanddiethylstilbestrol intheexperimentaltreatment 注:各组在染毒24、72、120h时取样测定。 80 70 60 50 40 30 20 10 0 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ 染毒24h 染毒72h 染毒120h 组别 U /m g· pr -1 *与Ⅱ组对应染毒时段相比差异显著(P<0.05); ▲与Ⅱ组染毒24h相比差异显著(P<0.05)。 图1己烯雌酚与镉对草鱼肝胰组织GSH-Px活力的联合作用 Figure1Combinedeffectofdiethylstilbestrolandcadmiumon GSH-Pxactivityinhepatocyteofgrasscarp 351 2008年1月 (P<0.05)。Ⅳ组和Ⅴ组与Ⅲ组相比,GSH-Px活性总 体呈下降趋势,但两者在染毒72h和120h时仍高于 Ⅱ组。Ⅱ组的活性在染毒72h和120h时与染毒24h 相比显著下降(P<0.05),Ⅲ组、Ⅳ组和Ⅴ组的活性 在120h时比72h高。 Ⅱ组的 MDA含量高于空白组,Ⅲ组低于空白 组,Ⅳ组和Ⅴ组变化不大(图2)。Ⅲ组在3个染毒时 段(24,72,120h)均低于Ⅱ组,且在染毒72h和120h 显著低于Ⅱ组(P<0.05);Ⅳ组和Ⅴ组的 MDA含量 与Ⅲ组相比呈上升趋势,但仍比Ⅱ组低。随着染毒时 间的延长,Ⅱ组的 MDA含量逐渐上升,Ⅲ组在染毒 72和120h的MDA含量都低于24h。 从图3可得:Ⅱ、Ⅳ组和Ⅴ组都低于空白组,而Ⅲ 组略高于空白组。Ⅲ组的SOD活性在24、72和120h 与Ⅱ组相比有所上升,并在染毒120h时具有显著性 差异(P<0.05);Ⅳ组和Ⅴ组的SOD活性呈下降趋势。 Ⅲ组的SOD活性随着时间的延长,在染毒120h时增 强。 3.2抗氧化指数(GSH-Px/MDA) GSH-Px/MDA(GSH-Px活性 /MDA含量)作为 抗氧化指数,是反映机体内潜在抗氧化能力的重要标 志,它可以准确反映组织细胞脂质过氧化的状态[18]。 从图4可以看出Ⅱ组的抗氧化指数低于空白组,Ⅲ组 明显高于于空白组,Ⅳ组和Ⅴ组变化不大。Ⅲ组在3 个染毒时段(24、72、120h)的抗氧化指数高于Ⅱ组, 在染毒72和120h时极显著(P<0.01);Ⅳ组和Ⅴ组 的抗氧化指数与Ⅲ组比显著下降(P<0.05)。随着染 毒时间的延长,Ⅱ组的抗氧化指数逐渐下降,Ⅲ组的 逐渐上升,而Ⅳ组和Ⅴ组的变化则不明显。 4 讨论 生物体内氧自由基的生成与清除一般处于动态 平衡,氧自由基生成过多或清除能力减弱时,过多的 氧自由基通过损伤生物大分子,破坏细胞的结构和功 能。而机体主要通过抗氧化酶 (酶系统) 和清除剂 (非酶系统)清除氧自由基。Cd可以通过多种途径破 坏体内自由基的平衡和抗氧化系统的功能,导致机体 氧化损伤[19]。雌激素DES是一种自由基清除剂[20],可 以降低MDA含量,提高抗氧化酶活性[8、9]。 SOD和GSH-Px是机体内最主要的抗氧化酶,其 活性的变化直接影响细胞内氧自由基和其终末产物 *与Ⅱ组对应染毒时段相比差异显著(P<0.05); ◆与Ⅲ组对应染毒时段相比差异显著(P<0.05) 图3己烯雌酚与镉对草鱼肝胰组织SOD活力的联合作用 Figure3Combinedeffectsofdiethylstilbestrolandcadmium onSODactivityinhepatocyteofgrasscarp Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ 染毒24h 染毒72h 染毒120h 组别 U /m g· pr -1 40 35 30 25 20 15 10 5 0 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ 染毒24h 染毒72h 染毒120h 组别 U g/ m g· pr -1 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 图2己烯雌酚与镉对草鱼肝胰组织MDA含量的联合作用 Figure2Combinedeffectsofdiethylstilbestrolandcadmiumonthe contentofMDAinhepatocyteofgrasscarp *与Ⅱ组对应染毒时段相比差异显著(P<0.05)。 图4肝胰组织中己烯雌酚与镉联合作用的抗氧化指数 Figure4Combinedeffectsofdiethylstilbestrolandcadmium onGSH-Px/MDAinhepatocyte *与Ⅱ组对应染毒时段相比差异显著(P<0.05),**差异极显著 (P<0.01);▲与Ⅱ组染毒 24h相比差异显著(P<0.05);◆与Ⅲ 组染毒 24h相比差异显著,◆◆差异极显著(P<0.01);#与Ⅲ 组染毒72h相比差异显著;#与Ⅲ组对应染毒时段相比差异显 著(P<0.05),##差异极显著(P<0.01);○与相应染毒时间空白 组相比差异显著(P<0.05),○○差异极显著(P<0.01)。 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅳ Ⅴ 染毒24h 染毒72h 染毒120h 组别 G SH -P x/ M D A 350 300 250 200 150 100 50 0 李瑷伶等:己烯雌酚对染镉草鱼GSH-Px、SOD和MDA影响的研究352 第27卷第1期 农 业 环 境 科 学 学 报 脂质过氧化物(LPO)的含量。MDA含量可以直接反 映动物细胞和亚细胞水平的脂质过氧化水平和机体 受损伤的程度。本实验的研究结果表明,与空白组相 比,随着染毒时间的延长,单独染 Cd组 (Ⅱ)的 GSH-Px活性和抗氧化指数下降,MDA含量上升, SOD的活性也低于空白组,说明染Cd草鱼的抗氧化 系统受到损伤,抗氧化能力降低。已有很多研究报道Cd 可以诱导机体产生自由基,抑制抗氧化酶的活性[1、12、19]。 加入 DES后,与单独染 Cd组(Ⅱ)相比,抗氧化指 数、GSH-Px和SOD活性上升,MDA含量下降,并且 在第Ⅲ组表现明显。这说明草鱼机体遭受的氧化损伤 有所缓解,DES可以提高草鱼的抗氧化能力,起保护 作用。这与其他学者的结果一致[8、9]。而DES的保护作 用可能是通过清除Cd诱导产生的活性氧,消除了活 性氧对抗氧化酶的抑制[20],从而使抗氧化酶的活性升 高,更进一步地清除活性氧。在本实验中,Ⅲ组的抗氧 化指数、GSH-Px和 SOD的活性高于空白组,并随着 染毒时间的延长而增强,而 MDA的含量降低,可能 是这种保护作用越来越明显或者机体自身的修复能 力也越来越强。另外本实验观察到第Ⅲ组与空白组相 比,抗氧化酶活性有所上升,MDA含量下降,抗氧化 指数明显升高。这有可能是1mg·L-1DES除了直接缓 解机体的氧化损伤,还通过其他途径间接提高机体 的自我修复能力[21、22]。Kusunoki等发现雌激素可以影 响抗氧化酶的产生[23]。随着DES浓度的增大,Ⅳ组和 Ⅴ组的 GSH-Px和 SOD的活性逐渐下降,MDA的含 量逐渐上升,说明DES的保护作用降低,机体的抗氧 化能力减弱。DES作为酚类抗氧化剂,兼具抗氧化和 促氧化作用,低浓度抗氧化,高浓度促氧化[20],这与本 实验结果一致。本研究中,当DES的浓度为1mg·L-1 时,抗氧化指数升高达极显著(P<0.01)水平,但当 DES浓度上升时(2、3mg·L-1),抗氧化指数显著下 降(见图4)。 综上所述,通过测定 Cd染毒草鱼肝胰脏组织的 GSH-Px、SOD活性和 MDA含量,以及对抗氧化指数 变化的分析,得出以下结论:低浓度(1mg·L-1)DES 与Cd之间存在明显拮抗作用,其可以提高机体的抗 氧化能力,但当DES浓度增大时,拮抗作用降低,机体 抗氧化能力降低。 参考文献: [1]朱善良,陈 龙.镉毒性损伤及其机制的研究进展[J].生物学教学, 2006,31(8):2-5. 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