冬凌草甲素纳米粒制备及其体外抗肿瘤作用

·864· 生鱼空垦院药学杂志2008年第28卷第11期ChinHospPharmJ，2008Jun．Vol28，No．11 3结构鉴定 化合物I：无色针状结晶(甲醇)，熔点18()～ 182℃，溴酚兰显黄色，显示有羧基存在。1H—NMR (500MHz，DMSo文)8：7．48(1H，d，J= 16．0Hz)，6．41(1H，d，J=16．0Hz)，显示有反式 双键，3．80(6H，s)，为两甲氧基信号，6．98(2H，s) 是1，3，4，5一四取代苯环上对称两氢，8。90(1H，s) 是酚羟基信号；13&NMR(125MHz，DMSO-文)8： 167．7，147．9x2，144．6，137．9，124．5，116．0，106．0 ×2，56．0。其1HNMRl3CNMR数据与文献中反 式芥子酸对照基本一致[31，故鉴定为反式芥子酸。 化合物Ⅱ：无色针状结晶(丙酮)，熔点213～ 214℃，溴酚蓝显黄色，提示有羧基存在；FeCl。显黄 色，说明分子中可能含有酚羟基。1H—NMR(500 MHz，DMS()_86)只显示一组对二取代苯环氢信号， 8：7．80(2H，d，J=8．8Hz)，6．83(2H，d，J= 8．8Hz)；由”C-NMR(125MHz，DMSO-d6)8： 167．2为羰基信号，161．6是苯环连氧碳信号，苯环上 其他碳信号为131．6×2，121．4，115．2x2。其1H NMR、”CNMR数据与文献中对羟基苯甲酸对照 基本一致[4]，故鉴定为对羟基苯甲酸。 化合物Ⅲ：无色针状结晶(丙酮)，熔点80--一83 ℃，溴酚蓝显黄色，显示有羧基存在。1H—NMR(5(Jo MHz，CDCl3)8：7．10(2H，d，J=8．5Hz)，6．75 (2H，d，J=8．5Hz)，3．96(3H，s)，3．55(2H，s)；13 C_NMR(125MHz，CDCl3)艿：173．0，155．1，130．4X 2，125．6，115．6×2，52．2，40．3。其1HNMR、13C NMR数据与文献中对甲氧基苯醋酸对照基本一 致[s]，故鉴定为对甲氧基苯醋酸。 化合物Ⅳ：黄色油状，FeCl3显黄色。1H—NMR (500MHz，CDCl3)8：7．10(2H，d，J=8．5Hz)， 6．75(2H，d，J=8．5Hz)，4．09(2H，t，J=6．5Hz)， 3．54(2H，s)。1．60(2H，m)。1．34(2H，m)，0．91 (3H，t，J=7．()Hz)；BGNMR(125MHz，CDCl3) 6：172．7，155．0，130．4，125．9，115．5，65．()，40．6， 30．6，19．1，13．7。其1H—NMR、”C—NMR数据与文 献中对羟基苯醋酸正丁醇酯对照基本一致‘6|，故鉴 定为对羟基苯醋酸正丁醇酯，经查阅文献，此化合物 为一新天然产物。 化合物V：白色针状结晶(氯仿)。熔点146"-- 147℃，Libermann—Burchard反应显紫红色。1H— NMR(500MHz，CDCl3)8：5．35(1H，brs，)，3．51 (1H，m)，1．01，0．80，0．84，0．62，0．86，0．89(各 3H，6xCH3)013C-NMR(125MHz，CDC|3)8： 140．7，121．7，71．8，56．8，56．2，50．1，45．8，42．3， 39．8，37．2，36．5，36．1，33．9，31．9×2，31．6，29．7， 29．11，28．3，26。0，24．3，21。1，19．8，19．4，19．0， 18．8，12．0，11．9。与对照品共薄层，在3种溶剂系 统下品值一致。其1H—NMR、13C—NMR数据与文 献中p谷甾醇对照基本一致[7]，故鉴定为p谷甾醇。 参考文献： [1]潘洪乎．三子养亲汤研究进展[J]．中成药，1995。17(10)：42。 [23梁文波，赵红，张学梅，等．三子养亲汤镇咳、祛痰、平喘作用的 药理研究[J]．中药药理与临床，2003，19(2)：11． [33SUNKai，LIXian，LIUJian-Min，etal．Anovelsulphurglyco— sidefromtheseedsofDeseurainiasophia[J]．JournalofAsian NatProdRes，2005，7(6)：853． [4]李军，姜勇，屠鹏飞．密花远志的化学成分研究(1I)I-J]．中国中 药杂志，2006，1(31)：45． ／-5]JoachimR06secke。WilfriedA，Koenig．Constituentsofvarious wood-rottingbasidiomycetes[J]．Phytoehemistry，2000，54(6)： 603． [6]BevinakattiHS，BanerjiAA．Lipasecatalysisinorganicsol— vents．Applicationtothesynthesisof(R)-and(S)-atenolol [J]．JOrgChem，1992，57(6)：6003． [7]PadhyePM，DanielM，SabnisSD．Chemistryandtaxonomyof genuspaulownia[J]．IndianBotRep，1983，2(2)：137． [收稿日期]2007—10—15 冬凌草甲素纳米粒制备及其体外抗肿瘤作用 赵永星1’3，华海婴2，梁文权3(1．郑州大学药学院，河南郑州450001；2．郑州大学医药科学研究所，河南郑州450052； 3．浙江大学药学院，浙江杭州310058) [摘要]目的：制备冬凌草甲素纳@@-(()RI-Nps)，考察其体外抗肿瘤作用。方法：采用界面沉淀法制备ORI-Nps，并对其形 态、粒径、g电位、包封率、载药量、体外释药特征和抗肿瘤作用进行研究。结果：制备的ORI-Nps为类球形，粒径分布均匀，平 均粒径为101．5眦；{电位为一29．8mV；载药量和包封率分别为6．84％@92．25％；体外释药缓慢；对Eca-109细胞具有较强 的毒性作用。结论：制备的ORI-Nps包封率和栽药量高，粒径均匀，体外释药具有缓释特点，体外抗肿瘤作用强。 [关键词]冬凌草甲素；纳米粒；体外释药；细胞毒性 [基金项目]国家自然科学基金资助项目(编号：30672553)[作者简介]赵永星，男。博士，副教授，电话：0371—67781908，E-mail：zhaoyx@zzu． edu．cn[通讯作者]梁文权，男，博士生导师，教授。电话：0571—88208436，E-mail：wqliang@zju，edu．cn 中国医院药学杂志2008年第28卷第11期ChinHospPharmJ，2008Jun．Vol28，No．11 [中图分类号]R917[文献标识码]A [文章编号]1001—5213(2008)11-0864—03 Preparationandinvitroanticancereffectoforidoninnanoparticles ·865· ZHAOYong-xin91”，HUAHai—yingr2，LIANGWen—quan3(1．Collegeofpharmaceuticalscience，ZhengzhouUniversi— ty，HenanZhengzhou450001，China；2．MedicalandPharmaceuticalScienceAcadmyofZhengzhouUniversity，HenanZheng— zhou450052，China；3．Collegeofpharmaceuticalscience，ZhejiangUniversity，ZhejiangHangzhou310058，China) ABSTRACT：0丑JECn、mToprepareoridoninnanoparticles(ORI-Nps)andstudytheanticancereffectinvitro．METHODS 0Rl-Npswerepreparedbytheinterfacialdepositionmethod．Itsmorphology，particlesizeand∈potentialwereexaminedby transmissionelectronmicroscopeandlasergranularityequipment．Entrapmentefficiency，drugloading，releaseandanticancer effectofORI-NDsi行vitrowerestudied．RESULTSORI-Npsassumedsphericalshape．Itsdistributionofdiameterwaseven withaverageparticlesizeof101．5nlTl，drugloadingwas6．84％，entrapmentefficiencywas92．25％，∈potentialwas 一29．8mV；ORI-Npscouldretarddrugreleaseinvitroanditseytotoxicitywassignificantlyhigherthanthatoforidoninsolu— tiontoEca-109cells．CONCLUSIONORI-Npshashighentrapmentefficiencyanddrugloading，uniformparticlesize，andcan retarddrugreleaseinvitroandenhanceanticancereffect． KEYWORDS：oridonin；nanoparticle；drugreleaseinvitro；cytotoxicity 冬凌草甲素(oRI)是从唇形科(Labtea)香茶菜 属(Rabdosia)植物中分离出的一种贝壳杉烯二萜类 天然有机化合物。研究发现，ORI具有明显的抗肿 瘤活性，临床上多用于肝癌、食管癌及胰腺癌的治 疗[1’3]。由于ORI水溶性差，生物半衰期短，到目前 为止尚未研制出理想的靶向制剂。本研究采用生物 相容性好且可生物降解的材料乳酸一乙醇酸共聚物 (PLGA)为载体材料制备冬凌草甲素纳米粒(ORI- Nps)，并对其理化性质、体外释药特性和体外抗肿 瘤作用进行探讨。 1材料 Agilent1100高效液相色谱仪(Agilen公司)； DiamonsilTMC18色谱柱(4。6mmX150mm，5“m)； 纳米粒度和Zeta电位分析仪3000HS(英国Malv— erninstrumentsLtd)；酶标仪(BIpRADModel 550，美国)；ORI原料药(浙江大学药学院，含量> 98％，批号20050317)；泊洛沙姆188(药用规格，德 国BASF公司，批号050501)；PLGA[PLA—PGA (50：50)，相对分子质量为15000，山东医疗器械研 究所，批号20040312]；其余试剂均为分析纯。 2方法 2．1 ORI-Nps的制备采用界面沉淀法制备OR卜 Nps[4]。精密称取处方量的ORI(10rag)和PLGA (100mg)，加入适量丙酮使之溶解。在200r· minl的搅拌速度下，将上述溶液加人到10mL Poloxamer188(2．5g·L叫)水溶液中，继续搅拌15 min，后以35℃水浴减压旋转蒸发挥尽有机溶剂。 得到的纳米悬液用0．8“m滤膜过滤后4℃、 50000r·min。1超速离心1h，弃去含有游离药物的 上清液，冷冻干燥24h后得到ORI—Nps。 2．2 ORI—Nps形态观察、粒径分布和∈电位测定 取0RI—Nps悬液适量，稀释，滴加在覆盖碳膜的铜 网上，室温(25℃)下以2．0％的磷钨酸钠液负染， 透射电镜下观察粒径大小和形态。取ORFNps悬 液适量，稀释，采用粒度／Zeta电位测定仪测定其粒 径和∈电位。 2．3 0RI含量测定方法[63 2．3．1 色谱条件色谱柱：DiamonsilCl。不锈钢柱 (250mnl×4．6nⅡn，5tan)；流动相：甲醇一水(5()：50)； 流速：1．0mL·min。1；柱温：3()℃；检测波长：237Ilia。 2．3．2曲线制备精密称取ORI适量，加入甲 醇溶解成1g·L。1的标准贮备液。分别精密量取一定 量的ORI贮备液，用甲醇稀释并定容至1．25，2．5， 5．0，10，20，40，80mg·L～，20弘L进样，以峰面积(聊 对对照品溶液质量浓度(X)回归得标准曲线。 2．3．3回收率测定依处方量制备PLGA空白纳 米粒，取适量空白纳米粒，加1．0mL二氯甲烷使溶 解，精密量取0RI贮备液适量，用甲醇稀释使分别 配成1．25，10，80mg·L。1的样品。HPLC测定，计 算回收率。 2．3．4精密度考察取质量浓度分别为1．25，10， 80mg·L叫的样品同上法处理后用HPLC测定，一 日内重复操作5次，考察其日内精密度。在以后的 5d内，重复操作5次，考察其日问精密度。 2．4 ORI-Nps包封率和载药量测定0RI—Nps悬 液以50000r·min叫超速离心1h，弃去含有游离药 物的上清液，重复上述操作2次，将未包裹的游离药 物洗尽，之后将ORI-Nps沉淀冷冻干燥24h得到 ·866· 生垦堕堕堑堂垄查垫塑堡笙垫卷第11期ChinHospPharmJ·2008Jun·Vol28尘!生卫 ORI—Nps。精密称取干燥后的纳米粒10mg于5 mL离心管中，加入1．0mL--氯甲烷，超声使纳米粒 溶解，再加入20mI。甲醇，漩涡10min，8()()I)r· min。1离心10rain，取上清液进样2()“I。。i见4定峰面 积，代人标准曲线计算包裹于纳米粒中ORI含量。 载药量=(纳米粒中ORI含量／纳米粒质量)X 100％；包封率=(纳米粒中ORI含量／ORI投药量) X100％。 2．5()RI—Nps体外释药[4]采用pH7．4的PBS 释放介质，精密量取适量0RI—Nps悬液，加入释放 介质至20mL，置振荡器(37oc，70r·min。1)。定时 取样，50000r·rain。1超速离心，弃去上清液，沉淀 用注射用水洗2次后冷冻干燥。纳米粒中残留ORI 含量按“2．4”项下方法测定。 2．6细胞培养将人体食管癌细胞株109(Eca- 109)接种于含1()％灭活胎牛血清的DMEM(高糖) 培养液中，在37℃、5％二氧化碳，饱和湿度下培养， 1"--2d换液一次。 2．7 细胞毒试验 MTT测定方法根据Mos- mann[6]研究方法稍作修改。Eca一109细胞种植在 96孔板中(每孔5X103个细胞)，经过24h培养，细 胞培养液更换为含不同药物浓度的培养液，调零组 和对照组加相应体积的培养液。培养72h后，每孑L 加MTT溶液(5g·L‘1)20肚L(调零组除外)，继续 孵育4h。小心移去培养液，蓝色的甲瓒晶体溶解 在150肚L二甲基亚砜中，振摇均匀后，在波长570 nm处记录每个孔的吸收度。以不加药的细胞组为 对照，求给药组肿瘤细胞存活率和ICs。，值。 2．8孵育时间对肿瘤细胞增殖的影响[7]含ORI— Nps和ORI溶液(ORI终质量浓度为1．0mg·L叫) 的细胞培养液与细胞共同孵育，经24，48，72，120h 后，以下操作同“2．7”。 2．9统计学处理SPSS12．o统计软件包进行t检 验。 3结果 3．1 ORI—Nps的形态及粒径分布透射电镜观察 结果表明，制得的ORI-Nps形态为类球形，大小均 匀，纳米粒之间基本无黏连(图1A)。纳米粒粒径测 定结果表明，0RI—Nps粒径分布较窄(粒径范围为 87．7"-139．0nm)，且基本呈正态分布，平均粒径为 101．5nm，多分散性指数为0．211(图1B)。 3．2 ORI—Nps的≮电位《电位与纳米粒体系的 稳定性密切相关。测定℃电位可以预测纳米粒的储 藏稳定性。本研究制得的纳米粒≮电位为(一29．8 (3．6)mV，属于热力学稳定体系。 图1 ORI—Nps透射电镜图 八原放大倍数x50000；B．粒度分布图 Fig1 Transmissionelectronmicroscopephotograph A．originalmagnification：×50000；18．particlesizedistributionsof Oridoninloadednanopartieles 3．3()RI含量测定结果表明，ORI的保留时间 为10．46min，处方中的辅料和溶剂对ORI的色谱 峰没有任何干扰。以ORI浓度为横坐标，峰面积为 纵坐标进行线性回归，所得标准曲线：Y=24．863X +17．591。结果表明，ORI在1．25～80mg·L叫范 围内，浓度与峰面积具有良好的线性关系(，-=1)。 低、中、高3个质量浓度的回收率分别为 98．76％，102．35％和100．03％，见表1；Et内精密度为 1．52％～2．64％，日间精密度为2．30％"--4．02％，见 表2。 表1冬凌草甲素的回收率测定结果(王±s。／-／=5) Tab1 Recoveryoforidonininnanoparticles(±s-n=5) 表2冬凌草甲素的精密度测定结果(j±5，n=5) Tab2 Precisionoforidonininnanoparticles(±s-以=5) 3．4 包封率、载药量 测得包封率为(92．2± 2．8)％，RSD为3．06％(行=3)；载药量为(6．84± 0．18)％，RSD为2．63％(以=3)。 3．5体外释药体外药物释放结果见图2。纳米 粒中的药物释放规律呈两相过程，在刚开始的48h 内释放药物较快，ORI累积释放量达到62％，随后 缓慢持续释放，216h时累积释放量约为92％。 3．6体外抗肿瘤活性不同浓度的ORI-Nps和 ORI溶液对Eca-109细胞增殖抑制作用见图3A。 结果表明，ORI-Nps抑制细胞增殖作用显著高于 ORI溶液(P<0．01)。相同药物质量浓度(I．0mg· L叫)的ORI—Nps和ORI溶液随孵育时间延长， 皇国医院药学杂志20塑笙笙!!鲞箜!!塑堡垒!呈旦!塑里坠望里』：垫!!!!璺：塑!垫：型垒!! ·867· 蓉100 鑫鲫 藿60 鬣40 20 0 0 50 100150 200250 t／h 图2载药纳米粒中冬凌草甲素的体外释放曲线 Fig2 Releaseprofileoforidoninfromoridoninloadednanoparticles ORI-Nps抑制细胞增殖作用均显著高于ORI溶液 (P<0．01)(图3B)。ORI溶液抑制细胞增殖的IC5。 为1．38mg·L～，ORI-Nps为0．095mg·L～，ORI- Nps的细胞毒性作用为ORI溶液的14．5倍。 0 24 48 72 96 120 抽 B 图3冬凌草甲素纳米粒和溶液对Ee．丑-109细胞的细胞毒性量一效关 系曲线图(A)和时一效关系曲线图(B) 一廿一空白纳米粒；一口～冬凌草甲素溶液；一△一冬凌草甲素纳米粒 Fig3 ViabilityofEca-109cellsincubatedwithdrug-freenanoparti— eles，oridoninsolutionandoridoninloadedrmnoparticles．Dose-re- sponsecurves(A)andtime-responsecurves(B) 一口—一drug—freenanoparticles；--O--oridoninsolution；一△一oddo— ninloadednanoparticles 4讨论 冬凌草甲素具有较强的抗肿瘤活性，对多种移 植性肿瘤有效，但其临床应用制剂仅有癌得宁注射 液一种。因癌得宁注射液主要采用有机溶剂加表面 活性剂来增加冬凌草甲素的溶解度，长期静脉滴注 可引起血管发炎、疼痛等不良反应，从而限制了冬凌 草甲素注射液的应用[8]。本研究以生物相容性好且 可生物可降解的PLGA为载体材料，采用界面沉淀 法制备了载药量高、具有缓释作用、抗肿瘤作用强的 ORI-Nps。 胶体给药系统(纳米粒、脂质体等)的粒径、表面 电荷等理化特征影响着其物理稳定性、药物的释放 以及与细胞的相互作用[9]，因此粒径小、粒度分布均 匀、∈电位绝对值大等理化特性是保证纳米粒稳定 的必要条件。本研究制备的ORI-Nps平均粒径为 101．5nm，粒度分布均匀，g电位为一29．8mV，所 以ORI-Nps具有较高的物理稳定性。 ORI从纳米粒的释放曲线包括两相：48h前的 “突释相”，可能是由于吸附在纳米粒表面或存在于 纳米粒浅层的ORI快速释放造成；48h后的“缓释 相”，可能是存在于纳米粒内部的ORI通过缓慢扩 散释放的结果。因此，ORI-Nps具有较好的缓释作 用。孵育时间和药物浓度对冬凌草甲素体外抗肿瘤 作用起着重要作用。随着孵育时间的延长和药物浓 度的增加，细胞毒性增加。相同条件下，ORI-Nps 抑制肿瘤细胞增殖作用显著强于0RI溶液。药物 质量浓度为0．05mg·L。1时，ORI—Nps组肿瘤细胞 存活率为32．1％，而ORI溶液对肿瘤细胞影响较小 (肿瘤细胞存活率为95．8％)；药物质量浓度为5．0 mg·L叫时，ORI—Nps组几乎无细胞存活，0RI溶液 组仍有27．3％的细胞存活。相同药物浓度时，24h 内ORI溶液的作用略强于ORI-Nps；随着孵育时间 延长，ORI—Nps的作用显著强于ORI溶液，120h时 0RI—Nps组几乎无细胞存活，而ORI溶液组仍有 45．45％的细胞存活。 本研究结果显示，ORI-Nps的体外释药与其细 胞毒性之间存在有一定的相关性。肿瘤细胞与 ORI-Nps孵育24h后，大量的0RI从纳米粒中释 放出来。因此，增强了细胞毒性作用，随着孵育时间 的延长，抑制细胞增殖作用也随之增加。 参考文献： [13刘晨江，赵志鸿．冬凌草的研究进展EJ3．中国药学杂志，1998， 33(10)：577-581． [2]吴孔明，张覃沐，王庆端，等．冬凌草甲素对肿瘤细胞钠泵活性 的影响[J]．肿瘤防治研究，1994，21(4)：208—209． [3]张典瑞，任天池，娄红祥等．冬凌草甲素硬脂酸固态类脂纳米粒 的实验研究[J]．中国药学杂志，2(1)4，39(2)：123—126． [4]FonsecaC，SimoesS。GasparRPaclitaxeMoadedPLGAllano— particles：preparation，physicoehemiealcharacterizationandin vitroanti-tumoralactivity口]．JControlRelease，2002，83(2)： 273—286． [5]张典瑞，任天池，娄红祥等．冬凌草甲素固态类脂纳米粒在小鼠 体内的组织分布及兔体内的药代动力学EJ]．药学学报，2005， 40(6)：573—576． [6]ZhaoYX。GaoJQ，SunXY，eta1．Enhanced11．tlcle．ardelivery andcytotoxicactivityofhydroxycamptotheeinusingo／wemul— sions[J]．JPharmSci，2007，10(1)：61—70． [73LiuJ，XuWF，CuiSX，eta1．Inhibitionofhumangastriccard— 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冬凌草甲素固态类脂纳米粒在小鼠体内的组织分布及兔体内的药代动力学[期刊论文]-药 学学报 2005(06) 6.Zhao YX.Gao JQ.Sun XY Enhanced nuclear delivery and cytotoxic activity of hydroxycamptotheein using o/w emulsions 2007(01) 7.Liu J.Xu WF.Cui SX Inhibition of human gastric carcinoma cell growth by atofludiug derivative N3- o-toluyl-fluorou-racil[期刊论文]-World Journal of Gastroenterology 2006(42) 8.张典瑞.任天池 冬凌草甲素的药学研究进展[期刊论文]-中国药学杂志 2003(11) 9.Maaβen S.Fattal E.Muller RH Cell cultures for the assessment of toxicity and uptake of polymeric particulate drug carriers 1993(01) 相似文献(10条) 1.期刊论文 张典瑞.任天池.娄红祥.邢洁.ZHANG Dian-Rui.REN Tian-chi.LOU Hong-xiang.Xing JIe 冬凌草甲素 固态类脂纳米粒在小鼠体内的组织分布及兔体内的药代动力学 -药学学报2005,40(6) 目的考察冬凌草甲素固态类脂纳米粒在动物体内的组织分布及药代动力学特性.方法建立生物样品中冬凌草甲素的HPLC测定法,比较冬凌草甲素普通 注射液和固态类脂纳米粒注射液的体内分布特点与药代动力学参数.结果冬凌草甲素固态类脂纳米粒在肝、脾、肺、心及肾中的相对摄取率分别为 4.25%,3.44%,1.19%,0.52%和0.60%.静脉注射后的药-时曲线表明体内过程符合三室模型,其各相半衰期分别为T1/2π=0.087 h,T1/2α=1.65 h,T1/2β=32.36 h,中心分布容积VC=0.66 mL·kg -1.结论冬凌草甲素固态类脂纳米粒能够增强药物的肝脾靶向性,提高药物生物利用度,并在一定程度上 延长药物在动物体内的循环时间.固态类脂纳米粒可能成为冬凌草甲素的一种新型药物载体. 2.学位论文 许洁 RGD修饰冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒的研究 2009 冬凌草甲素是我国首先从中药冬凌草(Rabdosia rubescens(Hemsl.)S.Y Wuet Hsuen)中分离的抗癌活性成分，具有抑制肿瘤细胞的增殖、抑制癌细 胞DNA、RNA和蛋白质的合成、诱导细胞凋亡、抗突变和β受体阻断作用。但冬凌草甲素水溶性差，口服代谢快，限制了其在肿瘤治疗领域的应用。本文 制备了RGDfK修饰的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒(ORI-NP-RGDfK)，期望达到主动靶向、提高抗肿瘤疗效的目的，对ORI-NP-RGDfK的制备、表征、体外释 药规律、小鼠体内药代动力学和组织分布行为、靶向性评价以及初步抗肿瘤药效等进行了较系统的研究。
　　 建立了冬凌草甲素的测定方法，对ORI的稳定性和溶解性进行了考察。其水溶液在高温度和强酸性和碱性环境中不稳定，属于酸碱催化降解，pHm为 5.0；ORI在水溶液中降解反应符合二级动力学方程，ORI在水中的降解随温度升高而加快。ORI在水中的溶解度随盐的加入而下降；含10％NaCl时，ORI的 溶解度仅为341.58mg·L-1，下降一倍。
　　 用改良自乳化溶剂扩散法制备了冬凌草甲素聚乳酸纳米粒(ORI-NP)。以包封率、载药量、粒径为考察指标，分别对影响纳米粒形成的10个主要因素进行 了考察，初步确定了纳米粒的制备工艺和处方。在单因素考察的基础上，以包封率、载药量、粒径和综合评分OD值为评价指标，采用三因素五水平星点 -效应面法优化ORI-NP的处方。用Statistica6.0软件进行非线性拟合，根据拟合方程和效应面图，确定了最优工艺参数。优化后的处方和工艺为:冬 凌草甲素12mg、PLA-15K50mg共溶于20mL丙酮-乙醇3:2的混合液中，在磁力搅拌下倒入到30mL的1％F-68水溶液中，持续搅拌5min，40℃减压除去有机溶 剂，0.8μm微孔滤膜滤过，即得。制得的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒呈球形，颗粒圆整，分散均匀；包封率28.86％，载药量8.23％；平均粒径 95.8nm，多分散系数0.075，pH3.82±0.23； Zeta电位-10.19mV。
　　 采用两步缩合反应，选择复合多肽缩合剂EDC-HC1和NHS-sulfo，制备了RGDfK修饰的聚乳酸载药纳米粒(ORI-NP-RGDfK)。对多肽缩合剂的活化时间、活 化温度、RGDfK反应时间、RGDfK的加入量等影响偶联效率的因素进行了考察。确定最终RGDfK修饰ORI-NP的制备工艺:ORI-NP溶液加入10倍PLA摩尔浓度的 EDC-HCI和sulfo-NHS，加MES调pH5.0～6.0，室温搅拌12h，过凝胶柱，收集纳米粒，加入RGDfK(RGDfK: PLA摩尔比为0.5:1)，冰浴搅拌24h，过凝胶柱 ，分离得ORI-NP-RGDfK胶体溶液。ORI-NP-RGDfK平均粒径105.2nm，多分散系数0.142；zeta电位-21.95mV；pH3.96±0.16；加盐酸后茚三酮显色反应呈 淡紫色；经元素分析，N元素为0.31％，C元素下降到42.76％；RGDfK偶联浓度为4.096±0.0943μg.mg-1NP。
　　 制备了ORI-NP-RGDfK冻干粉针剂，并对其进行了质量评价。冻干前后，纳米粒的性状、载药量、游离药物含量没有明显变化，pH值和粒径略有增加 ，Zeta电位有所降低。避光冷藏放置三个月，冻干剂的各项指标均无明显变化，稳定性良好。ORI-NP和ORI-NP-RGDfK冻干剂的体外释药规律基本相同 :4h释放25％，72h释放85％，具明显的缓释特征；体外释放符合Weibull方程，分别为1nln(1/(1-Q))=1.31781nt-2.2537(r=0.9971)和1n1n(1/(1- Q))=1.41601nt-2.4541(r=0.9952)。
　　 研究了小鼠尾静脉注射ORI、ORI-NP和ORI-NP-RGDfK的体内药代动力学和组织分布特征。结果表明:ORI和ORI-NP在小鼠体内符合二室模型，t1/2β分别 为3.55h和13.78h；ORI-NP-RGDfK以三室模型拟和最好，t1/2p为16.37h，具明显的缓释特征。ORI-NP和ORI-NP-RGDfK的AUC比ORI提高了一倍，相对生物 利用度分别为205.10％、210.86％。ORI-NP中ORI在肿瘤中相对摄取率re较高3.95，在脾中分布非常明显，re为3.40，对肺选择性分布较明显；ORI-NP- RGDfK对肿瘤的选择性分布非常显著，相对摄取率re达9.63，其肝、脾、肺的re比ORI-NP降低，表明对其的选择性降低；对肿瘤的靶向效率te为0.54，是 ORI的6倍，是ORI-NP的2.7倍，具有良好的肿瘤靶向性。
　　 建立小鼠移植性肝癌模型，通过观察小鼠肝肿瘤体积和重量的变化、肿瘤坏死程度、小鼠生存质量、脏器变化和生存期变化，研究了ORI-NP-RGDfK对小 鼠移植性肝癌的治疗作用。结果表明:ORI组、ORI-NP组和ORI-NP-RGDfK组相对生理盐水组的抑瘤率分别为27.22％、56.69％、77.49％；生命延长率分别 为40.88％、90.87％和187.43％。ORI-NP-RGDfK组的小鼠肝肿瘤严重坏死，肿瘤生长受到抑制；肿瘤病理切片显示出大量肿瘤细胞破碎、细胞核游离、 细胞质损坏现象；小鼠生存期明显延长，生命延长率为187.43％；生存质量得到改善，对其他脏器的病理改变较弱，对小鼠移植性H22型肝肿瘤有明显的 抗肿瘤的作用，显著优于ORI-NP(P<0.05)。
　　 本文成功制备了RGDfK修饰的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒，并对其进行了表征，研究了其体外释药规律和体内药代动力学，对组织分布和靶向性进行 了评价；以小鼠移植性肝肿瘤为模型，考察其抗肿瘤作用，证实RGDfK修饰的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒具有良好的主动靶向性。本文的研究为探讨 RGD介导的肿瘤靶向聚乳酸纳米粒给药系统的制备方法、体内过程和靶向特征等奠定了实践基础，可为设计和研制新型整合素-RGD介导的肿瘤靶向给药系 统提供借鉴和参考。RGD修饰的冬凌草甲素聚乳酸载药纳米粒给药系统在国内外尚未见报道，故本文的研究具有较强的新颖性和创新性。 3.期刊论文 张典瑞.任天池.娄红祥.张君华 冬凌草甲素硬脂酸固态类脂纳米粒的实验研究 -中国药学杂志 2004,39(2) 目的以冬凌草甲素为模型药物,以硬脂酸为载体材料制备冬凌草甲素固态类脂纳米粒,并考察其质量和性质.方法用乳化蒸发-低温固化技术制得了冬 凌草甲素固态类脂纳米粒,并对其形态、粒径、表面电位、包封率、结构和质量、体外释药特性等进行了研究.结果得到的硬脂酸固态类脂纳米粒为类球 形实体,粒径分布比较均匀,平均粒径dav=(22.22±15.5)nm;ζ电位-45.07mV;包封率为(44.83±1.504)%;药物体外释放符合Higuchi方程.用DSC和X-射线 衍射分析证明纳米粒确已形成.结论冬凌草甲素可以制成硬脂酸纳米粒,各项物理指标稳定. 4.学位论文 梅映昊 冬凌草甲素载药纳米粒的制备及其初步药效学和药代动力学研究 2007 冬凌草甲素(oridonin，ORI)是从我国首先从民间草药冬凌草(Rabaosia rubescens Hara)中发现的一种二萜类有机化合物，是一种高效低毒的抗肿 瘤成分，临床上主要用于肝癌、食道癌、胰腺癌等。但由于冬凌草甲素水溶性差，生物半衰期短，极大的限制了冬凌草甲素的临床疗效。 本论文采用两亲三嵌段共聚物聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯(PCL-PEO-PCL)作为载体材料，冬凌草甲素做为模型药物，采用沉淀法制备了冬凌草甲素 载药纳米粒，优选了白组装条件，并对其理化性质、药剂学特性、对小鼠肿瘤的治疗作用和在兔体内药代动力学特征进行了初步研究。 本研究分为以下三部分： 一．0RI载药纳米粒及其冻干粉针的制备 测定了ORI的油水分配系数(LogP=1.3±0.03)，表明ORI脂溶性强；设计了四因素三水平的正交实验对ORI载药纳米粒自组装条件进行了优化，得出最 佳工艺条件为药物加入量10mg，有机相一水相(体积比)为2：5，磁力搅拌速度30rpm，微孔滤膜孔径0.45μm；制备了冬凌草甲素载药纳米粒，并对其外 观、纳米粒形态、粒径分布、包封率和载药量进行了测定，结果表明，纳米粒各项质量指标都达到设计要求，其中载药纳米粒平均粒径为118.2 nm，载 药量约8.5％，包封率约76％；将载药纳米粒制成冻干制剂，冻干粉的外观、色泽、复溶性及吸湿性都达到设计要求；运用DSC与X-射线衍射分析方法证 明纳米粒确已形成。 二．ORI载药纳米粒对小鼠肝癌的药效学初步研究 以小鼠为模型动物，采用抑瘤率、生命延长率、肿瘤坏死程度为指标，考察冬凌草甲素载药纳米粒静脉注射给药后对小鼠肝癌细胞的影响，结果表 明载药纳米粒的抑瘤率达到66.7％，与其它各组比较有极显著性差异(P<0.01)；生存期实验结果表明， ORI-PCL-PEO-PCL组与生理盐水组比较，生存时 间延长至原来的2.7倍(P<0.01)；病理结果显示ORI-PCL-PEO-PCL组肿瘤以重度坏死为主，肿瘤坏死程度极显著于其它各组(P<0.01)。 三．ORI载药纳米粒在兔体内的药代动力学研究 以兔为模型动物，建立了兔体内ORI含量的HPLC内标分析法并考察了兔耳缘静脉注射OR工溶液剂(参比制剂)和ORI-PCL-PEO-PCL冻干剂后ORI在兔体内 的药动学特征，用药动学处理软件DAS2.0进行统计分析，结果表明，静注ORI溶液剂和ORI-PCL-PEO-PCL冻干剂后，兔血液中的药动学规律符合二室模型 。对主要的药动学参数进行统计学检验，结果表明两种剂型α t<,1/2>、βt<,1/2>、CL 均有显著性差异(P<0.05)，AUC无显著性差异(P<0.05)。与参比 制剂相比较，冻干剂的消除半衰期由2.3h延长到5.7h，分布半衰期由0.515h缩短到0.073h，冻干剂的AUC值变小，与载药纳米粒更快速的进入肝靶区有关 ，血浆清除率由1.805Lh<'-1>kg<'-1>叫降为 0.609 Lh<'-1>kg<'-1>，说明制成载药纳米粒后，分布变快，消除变慢，血浆清除率变小，表明ORI-PCL- PEO-PCL改变了ORI的分布与消除过程，具有明显的体内延效和缓释作用。 5.期刊论文 邢洁.张典瑞.张学顺.高磊.XING Jie.ZHANG Dian-rui.ZHANG Xue-shun.GAO Lei 冬凌草甲素聚乳酸纳 米粒的制备和体外性质研究 -中国药学杂志2007,42(13) 目的 优化冬凌草甲素聚乳酸纳米粒的制备工艺,并对其理化性质和体外释药特性进行考察.方法 以改良的自乳化溶剂扩散法制备冬凌草甲素聚乳酸 纳米粒,采用均匀设计法优化处方工艺,对优化工艺所得产品通过透射电镜、激光粒度分布与Zeta电位分析仪、pH计、黏度计、差示扫描量热法和X-射线 衍射法分析理化性质,并用超速离心法对其体外释药特性进行研究.结果 分析结果证明,纳米粒确已形成,并测得所制备纳米粒的包封率为 (91.88±1.83)%,载药量为(2.32±0.05)%,粒径为(125.3±11.2)nm,粒径跨距为(0.82±0.03),Zeta电位为(-15.88±0.41)mV,pH值为(5.57±0.04),黏度 为(1.231±0.002)×10-3 Ns·m-2.体外释药符合Higuchi方程:Q=8.944t1/2+11.246.结论 实验建立的制备工艺可行,所得纳米粒的包封率高,理化性质稳 定,体外释药具有缓释制剂特征. 6.学位论文 施水萍 冬凌草甲素载药纳米粒的制备研究 2005 本论文分为两部分。第一部分首先合成了聚己内酯-聚乙二醇-聚己内酯(PCL-PEO-PCL)两亲性嵌段共聚物。基于在辛酸亚锡催化下，聚乙二醇 (PEG)端羟基引发e-CL单体开环聚合反应而成。在设计共聚物总分子量为50KDa的条件下，分别合成了两种不同PEG含量的共聚物(即 PEG2000，PEG6000)；同时对这两种聚合物采用凝胶渗透色谱(GPC)、差示扫描量热法(DSC)、傅立叶红外分光光度法(FTIR)、核磁共振-氢谱(1H-NMR)等 方法进行对比表征。GPC测定两种聚合物重均分子量Mw均在50KDa左右，分子量分布窄，多分散性PD值均小于1.65。DSC测定结果显示：PCL-PEO6000- PCL的熔点为64.7℃；PCL-PEO2000-PCL的熔点为61.4℃；由此可看到这样的趋势：随着聚乙二醇含量的增加，聚合物的熔点升高，即结晶能力增强。用 FTIR测定得到的950cm-1及1295cm-1的吸收峰分别归属于PCL及PEO的结晶态的特征峰。1H-NMR谱图显示3.62ppm化学位移值的质子峰，此峰归属于PEO片段 的-CH2-的质子。谱图上其余四峰均归属于由e-CL开环而得的羰基-1，5-环戊烷片段的-CH2-的质子。通过以上表征，基本可以断定所合成的聚合物符合 设计要求。 第二部分选择具有抗肿瘤活性的天然成分冬凌草甲素作为模型药物，采用沉淀法制备了载药纳米粒。并考察了自组装过程中药物加入的量、丙酮/水 的体积比、磁力搅拌速率、旋蒸条件等因素，优化试验条件，获得了较高的纳米粒得率及载药量。 同时用多种手段对制备的冬凌草甲素载药纳米粒的理化性质进行了表征：在扫描电镜(SEM)观察下，纳米粒子呈规整的球形，表面光滑。动态光散射 (DLS)的数据表明纳米粒的平均粒径为200nm左右，粒径分布较窄(PD＜0.3)；对比两种聚合物，发现含PCL-PEG2000-PCL纳米粒的平均粒径比PCL- PEG6000-PCL大，这说明随着聚合物中疏水性组分比率的增加，粒径增大。载药纳米粒表面带负电荷，这是由于PCL嵌段的羧基电离所致；同时检测到 PEG2000的纳米粒Zeta电位绝对值较PEG6000大，空白纳米粒Zeta电位值比载药纳米粒大。用荧光的方法来验证胶束的结构，测定得含PEG2000的聚合物的 临界胶束浓度(CMC)是0.002g/L，而PEG6000为0.008g/L，说明疏水链越长，越容易形成胶束样纳米粒。 药物与胶束疏水内核的相容性被认为是影响载药量、包封率的最关键的因素。通过改善自组装条件，获得了14.9％的载药量，达到了68％以上的包 封率。这说明药物与胶束的亲和力较强。用透析法测定载药纳米粒的体外释放试验，显示载体对药物有明显的缓释效果，释药维持24h，且符合一级动力 学特征。对纳米粒在PBS液中的降解行为进行了初步的试验，发现室温条件下两个月内聚合物的分子量下降了约50％，初步显示了良好的生物降解性能。 7.期刊论文 张典瑞.任天池.娄红祥.邢洁.ZHANG Dian-Rui.REN Tian-chi.LOU Hong-xiang.Xing JIe HPLC测定冬 凌草甲素固态类脂纳米粒在小鼠肝脏中的药物浓度 -中国药学杂志2005,40(8) 目的建立冬凌草甲素固态类脂纳米粒在小鼠肝脏中药物浓度的HPLC.方法小鼠肝脏匀浆液用醋酸乙酯提取,氮气挥干,残渣用甲醇溶解后进样.采用 Phenomenex-0DS柱(150mm×4.60mm,5μm),以甲醇-水(60:40)为流动相,流速1.0 mL·min-1,检测波长为239 nm,外标法定量.结果冬凌草甲素的线性范围 为0.5～90μg·g-1(r=0.997 7);最低检测限为20ng;低、中、高3个浓度的萃取回收率为73.76%～79.08%,方法回收率为85.14%～90.58%,日内精密度 ≤7.30%,日间精密度≤13.63%,n=5.结论该方法简便、灵敏、准确,适用于冬凌草甲素肝靶向制剂的肝脏药物浓度测定及肝脏靶向性评价. 8.学位论文 邢洁 抗癌药冬凌草甲素聚乳酸纳米粒的实验研究 2006 冬凌草甲素(oridonin，ORI)为唇形科香茶菜属植物冬凌草(Rabdosia rubescens)的主要抗癌有效成分，分子中与环外亚甲基共轭的环戊酮结构是其 抗癌活性中心。体外研究表明ORI抗癌谱较广，可通过多种途径诱导癌细胞凋亡，对人肝癌BEI-7402细胞，非小细胞肺癌组织NCI-H520、NCI-H460、NCI- H1299，人白血病HL-60细胞，食管癌CaES-17细胞及结肠癌HCT8细胞等均有明显细胞毒作用，临床上也显示了一定疗效。 冬凌草甲素来源于天然植物，成分含量低，提取工艺复杂，原料的短缺已成为制约其深入研究的因素之一。同时，由于ORI的水溶性差，体内生物半 衰期短，目前有关制剂的抗癌疗效尚不理想，需进行深入研究。 针对上述问，本文首次将超临界CO<,2>萃取与柱层析分离技术联合应用于ORI的提取与分离，使ORI的制备工艺大大简化，对推动ORI向工业化生产 方向发展具有重要意义。本文以ORI的提取率为考察指标，对夹带剂的种类和萃取时间进行了单因素考察，确定以95％乙醇为夹带剂效果最理想，萃取时 间为3小时。通过正交实验对超临界CO<,2>的萃取工艺进行优化，确定最佳工艺条件为：压力38.5 MPa，温度40℃，夹带剂用量1.5 ml·g<'-1>。收集萃 取所得产物用硅胶柱层析技术进一步分离，将所得结晶利用红外光谱，紫外光谱和核磁共振波谱等手段进行鉴定，结果证实所得结晶为冬凌草甲素 ，HPLC面积归一化法测得样品纯度为(98.2±0.5)％，能够满足医药应用要求。 以冬凌草甲素为实验药物，以具有良好生物相容性和生物可降解性的聚乳酸(polylactic-acid，PLA)为载体材料，采用改良的自乳化溶剂扩散法制 备了冬凌草甲素聚乳酸纳米粒(ORI-PLA-NP)。实验以包封率为主要考察指标，通过均匀设计法对处方工艺进行了优化，确定最佳处方工艺为：Poloxamer 188％=1.0％，有机相： 水相=O.7，药物：有机相=0.5，PLA：药物=10，丙酮：乙醇=0.6，转速=400 rmin<'-1>。优化工艺操作简单，所制备的ORI-PLA-NP包封率稳定，平均包 封率为(91.884±1.83)％，载药量为(2.324±0.05)％，透射电镜下观察所得纳米粒为类球形实体，表面光滑不粘连