乳头状瘤病毒的免疫学特性03

乳头状瘤病毒的免疫学特性03 人乳头状瘤病毒的免疫学特性 人乳头瘤病毒(Human Papillomavirus , HPV) 是一类高度异质的双链环状小分子DNA 病毒,具有严格的种属和组织特异性,主要感染人类和多种高等脊椎动物皮肤和粘膜组织,引起相应部位上皮组织的增生性病变。人乳头瘤病毒(human papillomavirus ,HPV) 可分为引起良性增生病变的低危型和与人类多种组织恶性肿瘤(如宫颈癌、口腔癌、食管癌等) 密切相关的高危型。根据核酸序列同源性,HPV 可分为80 多型,不同型别的HPV 引起不同的疾病。HPV 1、2、3、4、7、10 、26,29 在正常或免疫缺损个体中引起良性疣,HPV 5、8、9、12 、14 、15 、17 、19,25 、36 、46,50 在免疫缺损个体中引起扁平状损伤,HPV 6、11 、34 、41,44 、51,55 引起生殖道或呼吸道粘膜发生非恶性湿疣,HPV 16 和18 与宫颈癌的发生高度相关。HPV 6 和11 是90%以上生殖器疣和喉乳头瘤的致病因子。长期以来,因HPV 天然来源非常有限,有严格的种属特异性,目前尚无有效的体外细胞培养扩增病毒体系,以及难以进行人体模型试验等因素,人们对HPV 的研究受到很大限制。人们对动物PV 的研究具有直接、方便、易于评估的特点,并且动物PV 与HPV 在病理学及免疫学方面又具有极大的相似性。近二十年来,随着分子生物学技术的发展与应用,结合人们对动物PV 的研究结果,人们对HPV 有了更加深入的认识。本综述在PV 感染、复制的基础上着重探讨病毒感染的免疫学特性。 1 PV的病毒学特征 完整的HPV颗粒直径约55nm,由病毒基因组DNA与衣壳两部分组成,无包膜,衣壳呈二十面体。病毒基因组是双链环状DNA,约8kb,动物乳头瘤病毒和HPV具有相似的基因组结构。基因组含至少8个开放阅读框(ORF),分为3个功能区:早期区,编码6个非结构蛋( E1,E6),参与病毒的复制转录调控及对宿主细胞的转化;晚期区,含L1、L2两具ORFS,编码主要衣壳蛋白L1和次要衣壳蛋白L2 两个结构蛋白,参与病毒粒子的组装;上游调控区(URR),不编码任何蛋白,但含有多种调控元件,影响病毒的复制和转录。 2 PV 的传播与复制周期 HPV 由被感染的复层鳞状上皮的层脱屑角化细胞释放。嗜皮肤性HPV通过与自体或异体感染组织的直接接触而传播,也可以通过污染物品间接传播。生殖道HPV多通过性接触而直接传播,同样也可以通过被污染的器械等发生间接传播。新生儿原发性喉乳头瘤病变则被认为是产道感染而来。 PV的复制周期对于理解病毒的病理和免疫机制非常关键。主要因为现在还不能通过病毒体外感染培养细胞来完成感染全过程,人们对于PV复制周期的大部分信息来自于PV对动物的自然感染过程的研究。普遍接受下述PV复制过程。首先HPV通过上皮组织的破损处进行鳞状上皮的基底细胞层,由此可造成潜伏、亚临床或临床感染。早期,HPV基因组于基底细胞层内以多拷贝(少于20,50拷贝)核外附体的形式与细胞S期同步复制合成。此期,E1、E2两种磷酸化核蛋白调控病毒DNA 的复制和低水平转录,而E6、E7 和E5蛋白诱导宿主细胞发生增殖性病变。后期,随着角质形成细胞的分化和向表层移行,早期基因的转录与明显增加,同时分化依赖性地激活E4、L1、L2基因的转录和翻译,并完成核内病毒颗粒成功组装。这一感染复制循环中的有关免疫识别的问题值得思考。 首先,病毒的感染和复制成熟完成依赖于角质形成细胞的分化过程。病毒感染原始的基底角度形成细胞,很可能是干细胞,但是病毒蛋白的高水平表达和病毒装配仅发生在鳞状上皮颗粒层和棘层的顶层细胞。病毒基因表达仅限于角质形成细胞,无证据表明在其它细胞中有表达。其次,病毒复制周期需要很长时间,即使在最好的情况下,从感染到病毒释放也得3 周,因为角质形成细胞经历完全分化直到脱落需要3周。事实上,从病毒感染到出现损伤的时间会有很大不同,从几周到几个月,这表明病毒可以有效的逃避免疫系统。第三,病毒复制和组装并不引起细胞裂解和细胞病理死亡。这些事件发生在处于分化并最终死亡脱落的角质形成细胞中,远离免疫活性部位。HPV感染延缓了分化的角质形成细胞的核固缩,细胞发生病理 改变,形成凹空细胞。E6 和E7 蛋白可能联合作用,阻止角质形成细胞凋亡直到病毒复制完成,然后负载病毒的细胞继续其分化死亡脱落过程。正因为如此,HPV感染并没有明显信号刺激免疫系统,不引起炎症反应。病毒就是采取这种策略使机体长时间感受不到病原的存在,达到持续慢性感染。所以,核心的问题是HPV自然感染是否刺激机体发生反应,反应的本质是什么,何时并如何发生以及在HPV 相关疾病的自然过程中体液免疫和细胞免疫的作用是什么。 3 PV 感染的免疫学特性 3.1 HPV 感染的细胞免疫 大群体研究生殖器HPV 感染女性的自然过程表明, ?生殖器HPV在年轻的性活跃女性当中瞬时感染相当普遍; ?大多数感染是亚临床的,可以自动清除; ?大多数病损是自律性增生,可以自愈; ?一小部分妇女发展成持续感染,病灶含有高水平DNA; ?一些高危型HPV持续感染发展成高度鳞状上皮损伤(HSIL); ?一些HGSIL发展成侵润性癌。这显示机体存在针对这类病毒的有效防御机制。在免疫抑制个体中HPV感染的高发和高进行性显示了细胞免疫反应对HPV感染的清除和控制具有关键作用。HPV 感染在HIV患者中具有多复发性 ,并且生殖器疣的发生率增加,这似乎反映了从亚临床感染向临床感染行进的危险性增高。来自于同种异体移植患者和HIV 感染者的证据显示CD4+T细胞的绝对缺乏是免疫缺损个体中HPV诱发疾病及相关肿瘤发生的重要危险因素。这提示,CD4+T 细胞对HPV感染的清除和控制具有中心作用。 对自发恢复的生殖器疣的免疫组织化学研究有助于理解HPV感染引发的细胞免疫反应本质。未处于恢复状态的生殖器疣缺乏免疫细胞,为数很少的上皮内淋巴细胞是CD8+T细胞,单核细胞主要存在于间质。当疣体恢复时,大量单核细胞侵入到间质和上皮,其中主要是CD4+T细胞,也有许多CD8+T细胞。这些侵润的淋巴细胞被激活并表达IL-2受体,它们“接触过抗原”,表达CD45 RO标记。疣体角质形成细胞表达并上调HLA2DR和ICAM21 ,这些粘附分子是淋巴细胞在疣体毛细血管内皮迁移所需要的。这些现象具有Th1倾向的迟发型超敏反应(DTH)的 特点。 3.2 犬口腔乳头瘤病毒(COPV) 感染恢复过程中的免疫学反应 通过粘膜PV感染的动物模型可以追踪从感染到恢复的全过程。COPV为研究嗜粘膜PV感染提供了很好的动物模型8 ,其损伤非常类似于生殖器嗜粘膜PV诱导的损伤,并含有大量的感染性病毒。通过擦破粘膜表面感染,COPV 可以在6,8周内诱发口腔乳头瘤,在12,16 周可以自发恢复,之后, 动物就会对感染性病毒攻击免疫。Ni-cholls 等用一系列犬淋巴细胞表面单克隆抗体和免疫组化的方法分析了COPV诱导的疣恢复过程。恢复开始于感染后7,8周,Langerhans 细胞从损伤处迁出,CD4+T细胞迁入到间质,其中主要是αβT 细胞,随后是较少量的CD8+T细胞,γδT 细胞似乎并不多,CD8+T细胞在感染后9,10周病变部位完全恢复 时达到最高。在恢复的病损组织中出现了很多凋亡的角质形成细胞,因为角质形成细胞凋亡与淋巴细胞浸润和疣恢复在时空上相关,所以推测角质形成细胞凋亡在病损组织恢复中起重要作用。COPV L1衣壳蛋白在第7周可以检测到,8周时达到最高,抗COPV L1血清IgG在第8周检测到,在第11,12 周时滴度明显升高。在COPV 诱发的疣恢复过程中的免疫组化事件与退行性生殖器疣临床标本中观察到的现象非常一致。 3.3 CD4+T细胞 免疫组织学研究清楚表明动物和人PV诱发的损伤恢复与Th1反应相联系,但刺激这一反应的病毒抗原仍然未知。来自于动物和人的实验证据表明病毒蛋白是免疫靶标。在鼠模型中,病毒抗原表达于角质形成细胞中并模拟自然感染过程,可以看到针对E6和E7的DTH反应。这一引发免疫系统诱导DTH反应的能力依赖于抗原剂量。低水平的抗原诱发免疫无应答,这一现象与淋巴结中CD8+T细胞亚群的Th12Th2细胞因子表达转换相联系,提示存在抑制效应。De Gruijl等在表皮轻微中或中等核异常妇女人群对HPV216 E7的T细胞增殖反应的研究表明,有HPV持续性感染和进行性疾病的妇女(99 %阳性)T细胞反应最强,而在已经清除感染的人群中 41 %阳性。 关于侵润HPV感染损伤部位的淋巴细胞抗原特异性研究较少。有报道从HPV 6感染的肛周生殖器疣分离到的疣浸润性淋巴细胞(WIL)在淋巴细胞增殖试验中对HPV26 E7和L1蛋白有反应。HPV 6 E7 或L1特异性的WIL可以从多于75%的患者分离到(n=24)。有趣的是,不同患者的WIL表面标记(CD4 ,CD8 ,TCRαβ或TCRγδ) 有很大的变异,而WIL 识别的HPV26 E7 和L1 肽与外周T细胞不同。研究中并未发现针对L1或E7的CTL活性,因为所用的是被切除的疣组织,所以不知道疣损部位处于持续感染还是恢复状态。 棉尾兔乳头瘤病毒(CRPV) 感染兔模型有利于研究肿瘤的发生。Selvakumar等在用该模型研究中发现诱发针对E2蛋白和T细胞增殖反应是疣损伤恢复的很好指标,而且病毒攻击前免疫E1或E2蛋白可以加快损伤恢复。用E2免疫牛对BPV造成的病损恢复无效果,但E7免疫可以加快恢复。这些结果提示,尽管在自然感染过程中,HPV早期蛋白未必诱导强烈的免疫反应，但巧妙的利用它们有可能是有效的免疫策略。 3(4 细胞毒T细胞反应 当前研究的一个热点是CTL在HPV感染中的作用。HPV特异性的CTL可以在曾感染过和正感染HPV的患者检测到。Naka gawa等的报道基于小样本患者,9人是已清除HPV感染,11人刚刚诊断为HPV 16阳性CIN。在这两组中都鉴定出CTL反应,但已清除感染的人具有更高的反应(63%) ,而处于CIN的人为14% ,暗示有效的CTL反应对清除感染很重要。CD4+T和CD8+T细胞毒效应因子参与这些反应。在PBMC,引流淋巴结和宫颈癌患者肿瘤中用同样系统检测到HPV特异性的CTL。用限量稀释分析确定这些部位的HPV特异性CTL频率,发现在淋巴结和肿瘤中的数量比在外周血中的多。最近研究表明,在恶性肿瘤和高度CIN 患者中HPV E7特异的高亲和性CTL非 常少,但可以用高敏感度的荧光标记HLA 肽复合物(四聚体)技术检测到。 3(5 体液免疫 体液免疫反应在HPV 感染中的作用近来已被澄清。已经清楚抗体对于感染的维持没 有作用,因为体液免疫紊乱并不会导致HPV感染增加。但在兔、牛等动物自然感染中,针对主要衣壳蛋白L1的抗体具有保护作用。由于天然病毒来源非常有限,大量的血清流行病学调查是以HPV重组VLP做抗原通过ELISA 方法进行。关于高危型和低危型生殖器HPV的研究总体上证明,生殖器HPV感染期间和感染后普通存在针对L1衣壳蛋白的特异性抗体反应。但是,由于这一检测方法的低敏感性和感染与血清逆转间隔期不同,血清抗体反应对于单个患者诊断没有用处,但在群体研究时做为HPV曾经和正在感染的标记有一定价值。对HPV 偶发感染的588 名学校女性跟踪调查表明,从生殖器粘膜检出HPV 16 ,18 或6型DNA的后来18个月内,对应的血清型转变分别为59.5%,54.1%和68.8%,HPV偶发感染后一过性HPV检出与血清不能转阳相关,HPV DNA持续存在的一些女性中,血清始终不能转阳。 有几项研究对早期蛋白的抗体活性进行了检测。有足够证据表明在宫颈癌患者存在针对早期蛋白E6和E7的抗体活性,但无证据表明这一点具有诊断意义。De Gruijl等用基于多肽的ELISA在HPV阳性有轻微和中度核异常的女性群体跟踪检测了针对HPV 16 E7免疫显性区域的血清的反应活性。在跟踪过程中,群体被分成清除感染、反复感染和持续感染3个部分。在清除感染的人群中,滴度最高而且反应人数最多,而持续感染的人群基本血清阴性。IgG亚型分析表明清除感染的患者中IgG占优势,而明显侵润性宫颈癌患者中IgG和IgG持平,提示病毒212清除与细胞介导的或Th1反应有关,但感染行进经历了一个向Th2反应的转变过程。Stanley 等综述了针对高危型病毒E2蛋白反应的有关报道,这些研究大多是基于多肽,很难对其显著性进行评价。一项用杆状病毒来源的蛋白的RIPA研究表明血清中抗E2 IgA抗体与宫颈不典型增生的行进呈负相关。 综上所述,对HPV感染的免疫学特性做如下概括。在年轻的性活跃人群中HPV感染很普遍,其中绝大部分可以清除感染而无可见的临床病变。造成病损的个体在大多数情况下可以产生 有效的细胞免疫反应,损伤可以恢复。CD4+T细胞主导的Th1反应伴随肛周生殖器疣的恢复,动物实验支持这一点,并提供证据表明这一反应受CD4+T细胞依赖的机制调控。在器官移植或HIV感染造成的免疫抑制个体中,HPV感染的高发显示了CD4+T细胞群对控制HPV感染的特殊重要性。尽管CD4+T细胞亚群对诱导和调节宿主对HPV的反应很关键,但这一效应的本质仍然不清楚。不断有证据表明NK细胞和抗原特异的CTL是重要的效应细胞,但对于这些反应的认识还非常有限。对衣壳蛋白的体液免疫反应伴随诱导细胞免疫,这些反应在动物上对后续的病毒自然感染攻击具有确切的保护作用。基于重组衣壳蛋白装配成的VLP疫苗及融合早期蛋白的嵌合VLP疫苗非常有希望用于防治HPV感染。