四川省1株输入性麻疹病毒基因特征分析

四川省1株输入性麻疹病毒基因特征 转载自中国科技信息网 分析四川省1麻疹病毒分离株的基因特征。方法 病毒分离和核苷酸测序后，与麻疹病毒基因型参考株编码核蛋白羧基末端的456个核苷酸序列做进化树分析。结果 该病毒分离株(MVi/Sichuan.CHN/7.09/1)与D9基因型参考株聚集在同一进化分枝上，bootstrap值为91%。与D9基因型参考株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为96.9%和96.6%；与其他22个基因型参考株的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为89.9%～96.2%和 90.7%～98.0%。结论 现有的麻疹实验室网络数据明，该病毒分离株为我国大陆首次分离到的D9基因型麻疹病毒，证实为输入性病毒。 麻疹病毒属于副粘病毒科麻疹病毒属，引起以发热、出疹为特征的急性传染病。尽管使用了安全有效的麻疹疫苗，但在许多发展中国家仍有麻疹流行。世界卫生组织根据病毒核蛋白基因和血凝素蛋白基因的核苷酸序列差异，将麻疹病毒分为8个组23个基因型，且基因 型有一定的地理分布特征[1,2]。通过基因型分析，可掌握病毒的基因特征，追踪传播源和传播途径，鉴别疫苗相关株、本土流行病毒株和输入性病毒株，评价麻疹控制工作取得的效果。2009-02四川省疾病预防控制中心麻疹实验室从1例成都市疑似麻疹病例的临床标本中分离出麻疹病毒，并对编码病毒核蛋白羧基末端的核苷酸片段进行序列分析。现有的我国麻疹实验室网络数据库资料表明，该病毒分离株是我国大陆首次分离到的D9基因型病毒株。对该病例进行流行病学调查，证实该病毒为输入性麻疹病毒。 1 材料与方法 1.1 病例基本情况 患者，女，37岁，成都市人，导游职业。发病前曾带团前往新加坡、马来西亚、泰国、香港和澳门旅游14d。回国后3d发病，出现发热、眼结膜充血、全身皮疹等症状。期间没有外出史。血清学检查麻疹IgM抗体阳性。 1.2 病毒分离 采集病例的咽拭子和尿液，用Vero/SLAM细胞进行病毒分离[3]。 1.3 病毒核酸RNA提取 使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Qiagen)按厂家从咽拭子、尿液标本及其细胞培养物中提取病毒核酸RNA。 1.4 逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR） RT-PCR在PTC-200(MJ)上进行，试剂为OneStep RT-PCR Kit(Qiagen)。使用2对引物MV60/MV63和NP3seq/MVN8分别进行扩增反应(MV60: GCT ATG CCA TGG GAG TAG GAG TGG/MV63: CCT CGG CCT CTC GCA CCT AGT；NP3seq: TTG CTG GTG AGT TAT CCA CAC TTG /MVN8: TTA TAA CAA TGA TGG AGG)[2,4]。RT-PCR条件为：50℃ 30min, 95℃ 15min；94℃ 30sec,50℃ 30sec，68℃ 1min，共35次循环；最后68℃ 10min延伸。扩增产物经1.5%凝胶电泳后，观察结果。 1.5 核苷酸测序和分析 取咽拭子细胞分离物的MV60/MV63和NP3seq/MVN8扩增产物，用Wizard SV Gel and PCR Cleanup System(Promega)按厂家说明书进行纯化。纯化产物分别用MV60引物和MVN8引物进行标记，标记试剂为DYEnamic ET dye Terminator Cycle Sequencing Kit (Amersham), 反应条件为：95℃ 20sec, 50℃ 20sec, 60℃ 1.5min, 共25次循环。标记产物用Sephadex G-50（Amersham）再次纯化后,在MegaBace500 DNA Analysis System (Amersham)上测序。 核苷酸序列校对后，与各基因型参考株苷酸进行多序列比对(编码核蛋白羧基末端的456个核苷酸)，用MEGA3.1软件作进化树分析（邻位-连接法， bootstrap检验，抽样次数500， Kimura 2 参数模型），根据分支聚集确定病毒基因型。 2 结果 2.1 RT-PCR产物检测 咽拭子、尿液及其细胞分离物用MV60/MV63和NP3seq/MVN8引物扩增后，均检测到594bp（base pair,碱基对）和768bp的特异性条带(图1)。 图1 患者咽拭子、尿液及其细胞分离物RT-PCR产物电泳图 2.2 核苷酸序列分析 与各基因型参考株作进化树分析，该分离株(国际标准命名MVi/Sichuan.CHN/7.09/1)与D9基因型参考株聚集在同一分支上， bootstrap值为91%(图2)。 与各基因型参考株比较，该分离株与D9基因型参考株的核苷酸序列同源性为96.9%，氨基酸序列同源性为96.6%；与其他22个基因型参考株的核苷酸序列同源性为89.9%～96.2%，氨基酸序列同源性为90.7%～98.0%。 GenBank数据库中搜索，有2例病毒分离株(临床标本)与该分离株的核苷酸序列完全一致，分别为泰国分离株(MVi/Phare.THA/27.08/1，GenBank录入号FJ356078)和荷兰临床标本(MVs/Maastricht.NLD/22.08，GenBank录入号EU878302)。 注：黑体字为该病例病毒分离株，其余的为各基因型参考株及GenBank录入号；≥60%的bootstrap值显示在分支上。 图2 编码病毒核蛋白羧基末端的456个核苷酸进化树分析图 3 讨论 Chibo等首先在澳大利亚输入性病例中发现新的D9基因型麻疹病毒后[5]，委内瑞拉、哥伦比亚、日本、马来西亚等国家相继出现D9基因型麻疹病毒引起的暴发和流行。从欧洲区国家和我国台湾、香港地区的麻疹病例中也分离出D9基因型麻疹病毒[6-9]。许文波、张燕等对中国麻疹病毒分离株进行分子流行病学研究[2,10,11]，表明H1基因型是我国大陆的绝对优势流行病毒株。除H1基因型、1例输入性H2基因型和4例A基因型病毒株外，我国大陆还未分离到其他基因型的麻疹病毒株。此次分离到的病毒株，做进化树分析，与D9基因型参考株聚集在同一分支上，bootstrap值为91%，高于70%的界值[12]，提示其为D9基因型病毒株。与D9基因型参考株比较，核苷酸和氨基酸序列同源性分别为96.9%和96.6%；与四川省以前的H1基因型病毒分离株比较，核苷酸和氨基酸序列同源性分别为90.1%～91.0%和90.0%～92.7%(数据未显示)。结合现有的我国麻疹实验室网络数据库资料，表明其为我国大陆首次分离到的D9基因型病毒株。对该病例进行流行病学调查，进一步证实其为输入性麻疹病毒)。 随着我国经济的高速发展，国际交往日益频繁，世界各地流行的其他基因型病毒随时都有传入我国的可能。 2005-09，包括中国在内的世界卫生组织西太平洋区国家承诺在2012年消除麻疹。我国在保持麻疹减毒活疫苗的接种率和人群免疫力大于95%的同时，也需加强实验室监测，提高监测的灵敏度，对病毒的基因特征进行分析，掌握病毒流行变化规律，证实无本土麻疹病毒引起的暴发和流行，及时鉴别诊断输入性病毒并阻止其传播，达到消除麻疹的目标。