神经生长因子脂质体大鼠鼻腔给药的药效学研究

神经生长因子脂质体大鼠鼻腔给药的药效学研究 谢英，杜熠，耿兴超，侯新朴。(北京大学药学院药剂系，北京100083) 摘要：目的对神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)和NGF脂质体(NGF-SsL)鼻腔给药的药效学进行研究，并与NGF静脉给 药相比较。方法鹅膏蕈氨酸(ibotenicacid，IBO)大鼠Meynert核注射制造阿尔茨海默氏病(alzheimer’Sdisease，AD)模型，以生 理盐水Meynert核注射作为假手术对照组，通过水迷宫试验，跳台实验和乙酰胆碱酯酶(AchE)组织化学染色来评价AD模型。 并应用此模型采用同样方法研究NGF静脉给药，NGF和NGF-SSL鼻腔给药后的药效。结果AD模型经鉴定能够应用于药效 研究。NGF鼻腔给药药效优于NGF静脉注射，NGF经脂质体包载后药效进一步提高。NGF-SSL鼻腔给药后能明显保护胆碱能 神经元免受损伤，动物游泳时间缩短，跳台潜伏期延长，AchE染色积分光密度接近正常大鼠。结论鼻腔给药能够实现药物 给药途径上的脑靶向，药物经脂质体包载后能明显增加其脑摄入，提高药效。 关键词：神经生长因子；脂质体；鼻腔给药；药效 中图分类号：R969．4 文献标识码：A 文章编号：1001—2494(2005)10—0742—05 StudyontrealmentofADbyNGFliposomesvianasaladministration XIEYing，DUYi，GENGXing-chao，HOUXin—pu+(DepartmentofPharm,叫，SchoolofPharmaceuticalSciences，PekingUniversity， 8e访愕100083，Ch／nal ABSTRACI"：OBJECllVETostudythephannacedynamicparametersofNGFandNGFstericallystabilizedhposomes(NGF—SSL)vianasal administrationandcomparewithNGFintravenousinject．METHODSAlzheimer’sdisease(AD)modelwasmadebyMeynertnucleusinject— ed访thibotenicacid(IBO)．andwasevaluatedbytllewatermaze，footshockavoidanceandAchEHistochemistrystainingtests．1hepharma— cedynamieparametersofNGF(iv)andNGF，NGF-SSL(na)werestudiedbyusingtheADmodel．RE吼Ⅱ门暇ADmodelWasappraisedtobe suitableforstudyingthepharmacologyefficacyofNGF．r11lepharmacedynamicsofNGFvianasaladministrationwasbetterthanthatofNGFin· travenousinject，andthatofNGF-SSLvianasaladministrationWasfu血erimproved．Nasaladministrationprotectedthecholinergicneuronfrom beingdamagedbyIBO，theswimtimeoftheratsWasshorten，andthefootshockavoidancelatencyWasextended，theintegralspectr(卜density ofAchEstainingwasneartothatofcontrolrats．CONCLUSIONNasaladministrationisabetterwaytotargetthebrain，andthebrainup— takeofdmgmodifiedwithlioposomeswouldbeincreased，thephannacodynamicswouldbeimproved． KEYWORDS：nervegrowthfactor(NGF)；liposome；nasaladministration；pharmacedynamics 血脑屏障(blood—brainbarrier，BBB)的存在使得 常规给药途径脑内药物浓度都比较低，限制了脑部 疾病的治疗。鼻腔与颅腔在解剖生理上的独特联系 使得将鼻腔给药作为脑内递药途径成为可能。药物 经鼻黏膜吸收入血，同时也能从外鼻孔向后到达鼻 腔与颅腔的筛孔，此处组织屏障作用最弱，有利于难 以透过BBB的药物直接进入颅内。这种给药方式 方便，患者易接受，是药物绕过BBB进入脑组织的 一条有效途径。 神经生长因子(nervegrowthfactor，NGF)对损伤 的神经元具有保护和修复作用，是预防和治疗阿尔 茨海默氏病(Alzheimer’Sdisease，AD)的理想蛋白多 肽类药物。但由于其难以透过BBB，因此目前给药 方式仅限于脑室注射和植入埋植剂。Frey等llj最早 研究过NGF通过鼻腔给药后脑组织的摄入，结果发 现125I标记的NGF在鼻腔给药后20min即在嗅球中 出现，脑内其他部位也有分布，但量少。为避免蛋白 多肽类药物被鼻黏膜上的蛋白酶水解和氨肽酶降 解，常使用酶抑制剂、对药物进行化学结构修饰或应 用大分子载体等方法来增加肽类及蛋白质药物在鼻 腔内的稳定性心J。本实验将对NGF鼻腔给药在大 鼠体内药效学进行研究，并考察用脂质体包载NGF， 对NGF脑摄人的影响。 目前有多种AD动物模型引3，如外科手术切段 穹隆．海马伞造成胆碱传递障碍，应用衰老加速小 鼠SAMP系列，采用化学神经毒素如鹅膏蕈氨酸、 基金项目：国家自然科学基金资助项目(30171114) 作者简介：谢英，女，硕士，讲师 +通讯作者：侯新朴，女，教授Tel：(010)82801508 ·742·ChinPharmJ，2005May，V01．40No．10 Fax：(010)62015584E．mail：houxinpu@bjmu．edu．∞ 万方数据万方数据 红藻氨酸、AF64A及使君子酸等进行基底核注射， 损害神经元，导致学习记忆功能障碍和胆碱能功能 丧失。NGF生物效应是能够使受损的神经元恢复 或保护神经元免受损伤，利用神经毒素鹅膏蕈氨 酸[40]进行Meynert核团注射制造的病理模型和 NGF的生物学效应相对应，是研究NGF药效最为 合适的模型。 胆碱能神经元受损后在行为上表现为认知记忆 能力障碍，在病理学上表现为胆碱能神经数目减少， 乙酰胆碱酯酶(AchE)含量降低L6J。本实验通过行 为学实验如水迷宫实验，跳台实验和AcllE的组织 化学来评价NGF脂质体的药效。 1材料和方法 1．1材料和仪器 NGF(Mr=26×103，浙江永宁制药厂)；豆磷脂 (SPC，德国LucasMeyerGmbH公司)；胆固醇(Chol， 北京化学试剂公司)；二硬脂酰磷脂酰乙醇胺一聚乙 二醇(DSPE—PEG-2000，日本NOF公司)；水合氯醛 (天津华东试剂厂)；鹅膏蕈氨酸(ibotenicacidIBO， Acms公司)；碘化乙酰硫代胆碱Acros公司)。 SD大鼠(200±12)g(北京大学医学部)。大鼠 脑立体定位仪(北京江湾Ⅱ号)。SLEICA&550CW 图像分析系统(德国)。 1．2鼻腔给NGF脂质体[NGF．SSL(na)]的制备 采用逆相蒸发法制备NGF脂质体。按SPC— Chol一(DSPE—PEG)=24：16：1比例取适量的SPC，Chol 和DSPE—PEG-2000，用二氯甲烷一正己烷=1：1溶解， 加入适量NGF，涡旋振荡后超声1min使其形成均 匀的W／O型乳液，减压蒸发至形成凝胶态物质后， 继续旋转蒸发10min。然后补充一定量的生理盐水 使其水化，分散成均匀的脂质体混悬液。 1．3 AD模型的制造 取sD雄性大鼠20只，腹腔注射10％水合氯醛 麻醉(0．4mL·1009。1)。头部固定在大鼠脑立体定 位仪上，剪去大鼠头顶部被毛，酒精棉球消毒，沿大 鼠头顶部皮肤正中线用眼科剪剪一约0．5cm切口， 再用单面刀片沿切口轻划至头骨清晰可见，用10％ 的双氧水擦洗切口及周围，以前囟门为基点，根据大 鼠脑立体定位图谱一J，确定Meynert核位置，坐标为 脑正中线旁侧2．0lnln，前囟前一1．4mln，硬脑膜下 7．0Bin。用电钻在坐标处垂直颅骨钻孔后，用10皿 微量注射器沿钻孔轻轻插入至靶点，缓慢注射5腭· mLo的鹅膏蕈氨酸，两侧各2皿，注射后留针1 min，用强力胶粘合伤El皮肤。假手术组注射2皿 的生理盐水。单笼饲养，动物2d后恢复行动自由。 饲养7d后，进行模型评价。 1．4 AD模型的评价旧J 1．4．1水迷宫实验水迷宫泳箱由聚乙烯塑料制 成，110cm×115cm×35cm，泳道宽15cm。水深20 cm，水温(25±1)℃。训练期：首先将大鼠在安全台 上放置10S适应环境，然后分别将大鼠依次放入第 二、第三、第四盲端，由近至远，逐渐加长路程。当大 鼠游到台处，并爬上台后，进行下一盲端训练。训练 结束第2天同一时间进行记忆测验：首先将大鼠在 安全台上放置10S，然后将大鼠放置安全台附近处 水中，使其自动爬上台1次。实验时将大鼠放置第 五盲端，同时启动秒表，记录到达终点的时间和错误 次数。设定实验时间为180S，超过180S不能游出 者按180S计。第3天重复记忆实验。 1．4．2 跳台实验该装置为20cm×20cm×60cm 的被动回避条件反射箱，用黑色塑料隔板分隔成2 间，底部栅板(间距0．5em)可以通电。第1天学习 成绩测定：将大鼠放入跳台仪中，适应环境1min，然 后立即通以36V交流电，大鼠受电击后蹦窜，记录 大鼠第1次找到安全台的时间，以及此后跳下台的 错误次数作为学习成绩，记录时间为180S。24h记 忆成绩测定：将大鼠放入同前一次的测定箱中适应 环境1min，然后将大鼠放在安全台上，通电计时3 min，记录大鼠第1次跳下安全台的时间为潜伏期， 以及此后跳下台的错误次数。记录时间为3min。 48h重复记忆成绩测量。 1．4．3 AchE的组织化学恻9①脑组织的固定：大 鼠腹腔注射10％水合氯醛(40mg·1009-1)麻醉，固 定大鼠，暴露心脏，通过左心室依次灌注生理盐水和 4％多聚甲醛。2h后取脑，在4％多聚甲醛溶液中 固定4h，置30％蔗糖溶液4℃饱和至沉底，做冰冻 冠状切片，厚度为20tan。②AchE染色：切片先用 0．1mol·L。1醋酸钠缓冲液(pH6．0)浸洗2次，然后 在反应液[32．5mL0．1mol·L。1醋酸钠缓冲液(pH 6．O)，2mL0．1mol·L一枸橼酸三钠，5mL0．03mol· L～CuS04，9．5mLn20，1mL0．005mol-L一1 K3FecN6，25IIlg碘化乙酰硫代胆碱]中反应30min。 切片经0．1mol·L。1醋酸钠缓冲液(pH6．0)浸洗后 依次用1％NH4S04和0．1％AgN03处理。最后切片 经乙醇梯度脱水，二甲苯中透明处理，中性树胶封 片。③积分光密度测定；用图像分析系统测量单位 面积内AchE的积分光密度，定量参数为每 5949412．00心内AchE阳性细胞覆盖的面积与光 Ch／nPharmJ，2005May，V01．40No．10‘743。 万方数据万方数据 密度的乘积。测量纹状体尾壳核CPU和海马CA 区，每组实验取相同部位3张切片，以AchE阳性细 胞积分光密度的平均值做统计分析。所有结果按 SPSS8．0统计软件包做t检验处理。 1．5 NGF及NGF脂质体药效学研究步骤 1．5．1取SD雄性大鼠40只，饲养2d后，用水迷宫 实验筛选均匀分组。将大鼠分为4组，分别为生理 盐水(iv)，NGF(iv)，NGF(na)，NGF．SSL(na)组。尾静 脉注射和用乙醚微麻后鼻腔给药，给药部位为鼻孔 内0．4cm。给药剂量均为NGF：10ttg·100g‘。，每13 1次给药，连续给药7d。 1．5．2按照“1．3”实验方法制造AD动物模型。造 模后2d，动物基本恢复自由活动，继续给药7d，每 日1次。 1．5．3采用前述水迷宫实验和跳台实验方法。 1．5．4每组选择2只动物做AchE染色，方法同 “1．4．3”项下。 2结果 2．1鼻腔给NGF脂质体的性质 用逆向蒸发法制备的NGF—SSL(na)具有蓝色乳 光，清亮透明。其包封率为(27．05±1．78)％。 粒径<100Hill。 2．2 AD模型建立及评价 2．2．1 学习记忆障碍水迷宫结果和跳台结果见 表1，2。 表1鹅膏蕈氨酸(IBO)Meynert核注射对大鼠水迷宫成绩 的影响．n=4～6，x±5 Tab1 EffectonthelearningandmemorydeficitsinducedbyIBO inratsbywatermaze．n=4～6．露±s 注：1)P<0_ol Note：1)P<0．01 表2鹅膏蕈氨酸(IBO)Meynert核注射对大鼠跳台成绩的 影响．n=4～6，元-4-s Tab2 EffectonthememorydeficitsinducedbyIBOinratswith footshockavoidanceasindex．n=4～6．贾±s 注：1)P<0．01 Note：1)P<0Ol 从表1和2的水迷宫实验和跳台试验可以看 ·744·ChinPharmJ，2005May，V01．40No．10 出，IBO造模组游泳时间显著延长，错误次数增多， 跳台记忆实验潜伏期缩短，错误次数增加。而生理 盐水假手术组与正常大鼠学习记忆能力无显著差 异。 2．2．2 AchE阳性细胞分布、定量分析⋯用生理 盐水造模和IBO造模后，脑组织切片染色后，显微镜 下从CPU区和CA区染色结果中可见生理盐水假手 术组AchE表达阳性，细胞呈红棕色，可见清晰神经 纤维，而IBO损伤造模组AcIlE表达阴性，细胞呈灰 色，表达AchE量很少。经图像分析后，发现IBO造 模组的积分光密度明显低于生理盐水假手术组，图 像分析结果见表3。 表3比较鹅膏蕈氨酸(IBO)和生理盐水Meynert核注射后 大鼠CPU和CA区的AchE积分光密度 Tab3 Comparisonoftheintegralspectro-densityofAchEinduced bvIBOorNS 注：1)P<0．01 Note：1)P<0．01 由上述结果可以看出，IBOMeynet核注射制造 的AD模型在行为学上表现出认知记忆障碍，在病 理学上表现AchE量显著减少，具有AD临床和病理 特征。 2．3 NGF及NGF脂质体鼻腔给药后药效学研究 2．3．1 NGF鼻腔给药后大鼠行为学研究结果sD 大鼠造模前后鼻腔给药，2周后进行水迷宫和跳台 实验，实验结果见表4和5。水迷宫结果显示，与生 理盐水尾静脉给药[Ns(iv)]组和NGF静脉给药组 [NGF(iv)]相比，NGF和NGF．SSL经鼻给药[NGF (Ha)，NGF．SSL(na)]大鼠游泳时间明显缩短，错误 次数减少。尤其NGF—SSL(ha)组的学习成绩具有显 著性增加，其游泳时问已经基本与正常大鼠相近。 由此可见，NGF经鼻给药具有很好的提高大鼠空间 学习记忆能力的效果。 各组大鼠跳台的学习成绩和记忆成绩见表5。 当跳台通电后，NGF—SSL(na)组大鼠受电击蹦窜能够 很快找到安全台，而且上台后犯错误次数较少，而生 理盐水组大鼠很难找到安全台，即使跳上也很快跳 下，表现紧张不安。24h后记忆成绩测量时将大鼠 先放在安全台上再通电，发现NGF—SSL鼻腔给药组 大鼠一般能够坚持3’min的测量时间呆在台上不 动，极少有试探动作，而其他组大鼠常因跳下台受到 电击。从跳台成绩可以明显看出NGF—SSL经鼻给药 万方数据万方数据 表4 NGF及NGF脂质体鼻腔给药后对大鼠IBO损伤后水 迷宫成绩的影响．凡=4～10，x±s Tab4 EffectofNGFliposomesfollowingnasaladministrationOil thelearningandmemorydeficitsinducedbyIBOinratsbywater maze．n=4～10．牙±S 注：1)PO．05)；EMS10．8 g·kg。1可延长大鼠颈动脉血栓形成时间(P<0．05)。结论EMS能降低血浆及血管壁中血栓素A2水平，具有调节TXA2与前 列环素平衡、抑制血栓形成的作用。 关键词：海洋贝类提取物；血栓形成；6-酮．前列腺素Fl。；血栓素赐 中图分类号：R282．77 文献标识码：A 文章编号：1001—2494(2005)lO一0746—03 StudiesoninfluenceofextractfrommarineshellfishEMSonPGFln／TXB2inratplasmaand剐臁wallandits anti．thromobosisaction L1USail，ZHONGWei—zhenl，WANGShou—lan2，LIUZhan—ta01，ZHANGJianl，SUNWei3(1．Depqnment旷劭彻啪∞如一 gY；2．NursingFaculty；3．Thea嘶ili,aeaHospital，MedicalCollege，QingdaoUniversity，Qingdao266001，Ch／na) ABSTRACT：oBlECⅡⅥ￡ToinvestigatetheinflHenceofthecomprehensiveextractfromⅡmrineshellfish(，EMS)onthecontentofthrom— boxaneB2(TXB2，metaboliteofthromboxaneA2)，6-Keto-PGFlainplasmaandaorticwall．Tostudytheeffectonthetimeofarterialthrombo- sisandinvestigatethemechanismofanti．atheroscleroticaction．METHODS1heconcentrationsof7Ⅸ赐and6-Keto-PGFtainplasmaand aorticwallweredeterminedbyradioimmunityanalyse(RIA)．髓eexperimentalcarotidarterythromobosisinratmodelwasevaluatedbyelec— tricstimulationinjury．Thentheactivityofanti．thromobosisofEMswasinvestigated．RE双】I胚EMS(5．4，10．8g-ks“)significiantlyde— creasedtheamountofTXB2inaorticwall(P<0．05)anddecreasedthe1evelofTXB2inplasma(P<0．05)．EMS(2．7，5．4and10．8g· ks一)didn’tsignificantlyeffectontheconcentrationof6-Keto-PGFI。(P>O．05)．EMS(10．8g-ks’1)obviouslypmlongodthethromobesis timeinrats(P<0．05)．CONCLUSION喃eanti．atherscleroticmechanismofEMSmayberelatedtothereductionofTXB2inplasmaand aorticwallandtheinhibitionofthrombosis． KEYWa时】s：extractsfi'ommarineshellfish(EMS)；thrombosis；6-Keto-prostaglandinsFl。；thrombexaneB2 [1] [2] [3] [4] [5] FreyWH，“uJ，ChenX，eta／．Deliveryof1251一NGFtothebrainvia theoffactoryroute[JJ．DrugDe／hwy，1997，4(2)：87． GizurarsonS，ThorvaldssonT，SiguntssonP，eta／．Selectivedelivery ofinsulinintothebrain：intraolfactoryabsorption[J]．肪JPharm， 19916，140(1)：77． 魏小龙，张永祥．老年性痴呆动物模型研究进展[J]．中国药 理学通报，2000，16(4)：372． Pi=oDP．r11lalLJ．Intraparenchymalnervegrowthfactorimproves behavioraldeficitswhileminimizingtheadverseeffectsofintracere— broventriculardelivery[J]．Neurosc／ence，2004，124(4)：743． MorimotoK，YoshimiK，TonohiroT，eta1．Co-injectionofa—amyloid withibotenicacidinducessynergisticlossofrathippocampalnellEons 【J』．Neurosc／ence，1988，84(2)：479． 基金项目：山东省科技厅基金项目资助(981164805) 作者简介：刘赛，女，硕士，教授，硕士生导师Tel：(0532)2991202 ·746·Ch／n珊nMJ。2005May。V01．40No．10 WllitehoosePJ．PriceDL，StnthleRG，舀a／．Alzhcimer’sdisease andseniledementia：lossofBeuronsinthebasalforebrainlJJ．&i— er∽，1982，215(4537)：1237． GeorgeP，CharlesW．Theratbraininstereotaxiccoordinates【Mj． 3ed．NewYork：AcademicPress，1991． 徐叔云，卞如濂，陈修．药理学实验方法[M]．第三版，北京： 人民卫生出版社，北京，2003：826． HedreenJC．BaconSJ．PriceDL．Amod击edhistochemicaltech— niquetovisualizeacety|cholinesterase-containingaxonslJJ．J凰一 tochemC”ochem，1985，33(2)：134． 徐滨，陈俊抛，周光斗，等．去松果体对大鼠学习记忆及大脑 皮质胆碱能纤维的影响[J]．中华神经科杂志，2000，33(3)： 153． (收稿日期：2004-06-04) Fax：(0532)3801449E—mail：liusai5151@126．cem 吲 m 剐 例 m 万方数据万方数据 神经生长因子脂质体大鼠鼻腔给药的药效学研究 作者： 谢英， 杜熠， 耿兴超， 侯新朴， XIE Ying， DU Yi， GENG Xing-chao， HOU Xin-Pu 作者单位： 北京大学药学院药剂系,北京,100083 刊名： 中国药学杂志 英文刊名： CHINESE PHARMACEUTICAL JOURNAL 年，卷(期)： 2005,40(10) 被引用次数： 7次 参考文献(10条) 1.Frey WH;Liu J;Chen X Delivery of 125I-NGF to the brain via the olfactory route[外文期刊] 1997(02) 2.Gizurarson S;Thorvaldsson T;Sigurdsson P Selective delivery of insulin into the brain: intraolfactory absorption[外文期刊] 1996(01) 3.魏小龙;张永祥 老年性痴呆动物模型研究进展[期刊论文]-中国药理学通报 2000(04) 4.Pizzo DP;Thal LJ Intraparenchymal nerve growth factor improves behavioral deficits while minimizing the adverse effects of intracerebroventricular delivery[外文期刊] 2004(04) 5.Morimoto K;Yoshimi K;Tonohiro T Co-injection of α-amyloid with ibotenic acid induces synergistic loss of rat hippocampal neurons[外文期刊] 1988(02) 6.Whitehouse PJ;Price DL;Struble RG Alzheimer's disease and senile dementia: loss of neurons in the basal forebrain[外文期刊] 1982(4537) 7.George P;Charles W The rat brain in stereotaxic coordinates 1991 8.徐叔云;卞如濂;陈修 药理学实验方法 2003 9.Hedreen JC;Bacon SJ;Price DL A modified histochemical technique to visualize acetylcholinesterase- containing axons 1985(02) 10.徐滨;陈俊抛;周光斗 去松果体对大鼠学习记忆及大脑皮质胆碱能纤维的影响[期刊论文]-中华神经科杂志 2000(03) 本文读者也读过(4条) 1. 王光明.潘艳.孔秋玲.田军.WANG Guang-ming.PAN Yan.KONG Qiu-ling.TIAN Jun 细辛脑羟丙基-β-环糊精溶液 剂鼻腔给药脑内释药可行性[期刊论文]-中国实验方剂学杂志2012,18(3) 2. 王林.李新平 鼻腔给药靶向于中枢神经系统的可行性[期刊论文]-中国高等医学教育2007(7) 3. 赵红梅.刘新峰 经鼻给药--有效避开血脑屏障的中枢用药途径[期刊论文]-中国临床神经科学2003,11(3) 4. 郑爱萍.李春平.郝睿.武凤兰 鼻腔给药靶向于中枢神经系统的研究进展[期刊论文]-中国药事2004,18(10) 引证文献(7条) 1.王林.李新平 鼻腔给药靶向于中枢神经系统的可行性[期刊论文]-中国高等医学教育 2007(7) 2.晏亦林.周莉玲 脂质体在鼻腔给药系统中的应用概述[期刊论文]-中药新药与临床药理 2006(4) 3.李魏娜.刘力.徐德生 药物经呼吸道递送研究进展[期刊论文]-上海医药 2007(4) 4.黄勇华.何艾 经鼻给药防治脑血管病的机理及给药剂型研究进展[期刊论文]-广西中医学院学报 2011(4) 5.高天曙 中药鼻腔给药系统治疗脑部疾病的应用现状[期刊论文]-中医研究 2011(10) 6.陈思源.肖农 跨血脑屏障给药的研究进展[期刊论文]-医学综述 2008(19) 7.梅妮 盐酸利多卡因鼻腔凝胶剂的研制及脑内递药特性研究[学位论文]硕士 2006 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgyxzz200510007.aspx