野油菜黄单胞菌野油菜致病变种致病相关基因的鉴定及分析

野油菜黄单胞菌野油菜致病变种致病相关基因的鉴定及分析 浙江大学 博士学位论文野油菜黄单胞菌野油菜致病变种致病相关基因的鉴定及分析 姓名:韦珂 申请学位级别:博士 专业:植物病理学 指导教师:唐纪良 20051201 浙,大掌博士论文 摘 要 野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(石,腑,，，,,,?;?咿,,护括,, ;口,印,,伊括;简称胎;)是十字花科植物重要的病原细曲，能广泛的引起十字花科作物的黑腐病。,，;;侵染寄主植物的过程是非常复杂的，一般经过吸附(识别(侵入(繁殖(定殖(扩展(显症,个过程，而且每一个过程都有相应的基因参与;,,,,,,,预测人约有,,,,,,个基因参与,七;的致病过程，而目前已经实验证实的致病相关基因大约有,,多个。可是根据野油菜黄单胞菌野油菜致病变种,,,,菌株基因组数据，预测的致病相关基因有,,,多个。由此可见在该病原菌中，尚有许多未知的致病相关基因有待人们去鉴定。目前，寻找致病相关新基因的主要有,种:一是构建突变体的方法，该方法是通过构建病原菌基因组中每一个基因的突变体，然后进行致病性检测:二是基因差别表达的方法，该方法是通过,,,系统或通过,,,芯片杂交检测在丰富培养基中和寄主体内或模仿寄主体内环境条件的培养基的基因表达差异，一般将那些受寄主诱导的基因作为致病相关基因的候选基因;三是生物信息学分析法，该方法通过在病原菌基因组中寻找和已报道的其他病原菌的致病相关基因的同源基因作为该病原菌的致病相关基因的候选基因。本研究采用了第一和第三种方法进行航致病相关新基因的鉴定。首先，在本实验已经构建了,七;,,,,的,,堙,,,插入突变体库并对所有突变体进行了致病性检测的前提下，我们利用标记置换(,,,,,, ,,;,,,,,)的方法对,,个致病力,降的,,,黔,,插入突变体重新构建突变体，证实,个与肋;致病相关的插入位点，通过进一步的非极性突变体的构建及互补证明了堙“和,,烈基因与该病原菌的致病相关。另外，通过检查,?;,,,,基因组注释结果，我们发现垃;中存在一个与植物病原菌欧文氏菌致病因子调控基因?,一高度同源的基因(?州，我们通过定点整合突变的方法获得了该基因的非极性突变体，致病性检测表明该突变体不能在寄主植物满身红萝,上引起症状。 ，,叫基因编码产物为,,,,家族转录调控子(,,氓,,,,,, ,,,,,,;,,,,,,,,, ,,,,,,;,,)。,,,,转录调控子在大肠杆菌中最先是作为非特异抗生素抗性抑制子，翼式双螺旋的结构是该家族成员的共同特征。已经证明欧文氏菌，沙门氏菌，耶尔森氏菌中,,,,家族转录调控子在致病过程中发挥重要作用。而皿;的垤叫基因突变以后，突变体的致病力也明显减弱。用,,,,,,, ,的接种浓度用剪叶法接种满身红萝,，接种,,天后，接种突变体的叶片病斑长度为,(,, ,,，而接种野生型菌株,,,,的叶片的病斑长度为,,(,,,，而且突变体的致病缺陷能被，删基因反式互补，这一结果证明坛叫基因是病原菌致病所需要的。叶内同收菌体试验结果表明坛胡突变体在寄主叶内的生睦量比野生型菌株显著减少，说明堙叫基因是病原菌叶内生长所必需的。我们在,个不同栽培品种的十字花科植物上检测了坛刮突变体的致病力，结果发现在健春(大白菜)(胁，，,?;硎,,,,睹,,,(,,,，,,,,，,,)、中自,,(,瑚,缸口阳唧枷船,,,(,,,,,,,,,,)和京丰，号(卷心菜)(占,?,把口;口?卵,仃打,,,?,,,盯,,,,,,)上完全没有致病力，而在花叶白萝,(萝 卜) (尺印而铆淞,,,,,搬,(,,,(,,,,;,,,, ,,,,,)、板叶红袍(萝卜) (,嘶 鲫船,,玎,凇,,,,(,,,,;,,,,,,,,,,,,,,,,)、晚丰(甘蓝)(,惴,;口。据,?,口,,,,,,,,,,,)、鲜红小金钟樱桃(萝卜)(脚厅硎埘,口,,,, ,?,,,(,,,,;,,,, ,，,,,,,,,,,,,,,,,,,,)和秋王,,(花椰菜)(,,,,,,;, ,,,,,;,, ,,, ,,,,,,酊,)的致病力为野生型菌株的,,,,,,。尽管该突变体的致病力明显下降，但是我们发现它的致病因子如胞外多糖的产餐，胞外蛋白酶、胞外淀粉酶和胞外纤维素酶的活性与野生型菌株比较没有明显差异:而且突变体在丰富培养基和,,,基本培养基中与野生型菌株,,,,的生长状况也没有差异。为了研究该基因 浙,大掌俘士论文的表达调控(我们构建了该基因的启动子与,,,基因的转录融合报告质粒，并导入不同的遗传背景的肠;菌株中并在不同的生长条件,检测,,,活性，结果发现堙谢基因在丰富培养基上的表达受到抑制，而在植物受到诱导，而且这种诱导表达依赖于，巾基因簇的调控基因，伊,和，僻,。 印枷编码一个以,,,(,)为辅酶的,一磷酸甘油脱氢酶(,,,?一,,,;,,,,,,,,,,,,,,,, ,;,,,,,,,,,,，,,,,:,; ,(,,(,,)，该酶利用,,,(,)为辅酶催化磷酸二羟丙酮生成,(磷酸甘油，其氨基酸序列与大肠杆菌的,,,(,)为辅酶的,一磷酸甘油脱氢酶(由,,叫基因编码)的一致性和相似性分别为,,(,,和,,(,,,。舱;的印以基因突变以后，突变体的致病力严重下降。用?铮模叮埃埃剑希钡慕又峙ǘ炔捎眉粢斗ㄔ诩闹髦参锫埽瑁ㄆ访砗欤?辖兄虏?约觳猓?纸又值阂裕赐槐涮宓囊镀牟“叱ざ任保福?,,，接种野生型菌株的叶片的病斑长度为,,(,,,,，而且突变体的致病力能够被印吐,基因反式互补(接种互补菌株的叶片的病斑长度,,(,, ,,)。这就证明,弘拍基因是该病原菌致病所需要的。为了进一步研究突变体的致病力下降原因，我们检测了突变体的致病因子，结果发现突变体的胞外多糖和胞外酶(胞外蛋白酶，胞外淀粉酶和胞外纤维素酶)的产生不受影响。对辱也,突变体在细菌培养基上的生长情况检测发现，虽然舻幽突变体和野生型菌株在丰富培养基,,,中的生长状况一致，但在基本培养基,,,中，舒，出突变体的生长速度比野生型菌株显著下降。舒吐,突变体在基本培养基中的生长缺陷能被印出基因反式互补。这一结果说明印出基因是(驻;在基本培养基中的生长所需要的，这预示着印出突变体在基本培养基中的生长缺陷可能是其致病力下降的原因之一。由于挈以基因缺失突变体仍然能够在以葡萄糖作为唯一碳源的培养基上生长(尽管生长量很少)，而在大肠杆菌中即出基因的同源基因,,叫的突变体却不能够在以葡萄糖作为唯一碳源的培养基上生长，因此我们推测在,;,,,,中存在另一个编码以,,,为辅酶的,一磷酸甘油脱氢酶的同工酶的基因。 ;,,,是一个多功能的转录后调控子，它首先在大肠杆菌中被鉴定为一个正向调控糖酵解、负向调控糖原合成及糖异生的调控因子:随后又发现它广泛存在于不同种类的细菌中并参与碳代谢、生物膜形成、细胞的运动性及群体感应系统的调控。进一步研究还发现;,,,蛋白参与胡萝,软腐欧文氏菌、流感嗜血菌、幽门嫘杆菌、伤寒沙门氏菌和鼠疫耶尔森氏菌等动植物病原细菌的致病过程。爿曲,,,,的?一基因突变以后，突变体表型发生巨大的改变，首先是突变体在寄主植物满身红萝,上完全丧失了致病力，在非寄主植物辣椒,,,(,,,上丧失引起高敏反应(,,)的能力，另外，突变体的胞外淀粉酶与胞外纤维素酶的活 性比野生型菌株显著降低，在圃体培养基上胞外多糖产量比野生型菌株显著下降。我们还进一步发现该突变体的糖原累积增加、丧失运动性，能在,,培养基中形成生物膜。这些改变的表型除生物膜形成外均能被;,一基因反式互补。这说明;,叫基因参与了舱;的致病过程、糖代谢、致病因子产生及运动性的调控。因此，和其他细菌相似，;,以在托;中也具有全局调控功能。关键词:野油菜黄单胞菌野油菜致病变种，致病相关新基因，，班,基因，即正,基因，,叫基因。 , 浙江大掌博士论文 ,,,,,,;, 炀胛,向。栅。门珊;疗彬,,,护括,, ;口，疆,,,,,血(,,,, ,,,,肠;),, ,,,, ;,,,,, ,,,,, ,, ,,, ,，,;, ,,,,,,,,,, ,, ;,;,,,,,,, ,,,,,,(,,, ,,,,,,,,,,,, ,,拖; 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