利用转基因植物合成生物可降解材料聚羟基脂肪酸酯_cropped

利用转基因植物合成生物可降解材料聚羟基脂肪酸酯_cropped Ξ 利用转基因植物合成生物可降解材料聚羟基脂肪酸酯 ΞΞ11 ,21122 王玉华吴忠义李文滨黄丛林孙环星杨庆凯 1 2 ( ) 北京市农林科学院北京农业生物技术研究中心 ,北京 100089 ; 东北农业大学大豆研究所 ,哈尔滨 150030 () 摘 要 : 聚羟基脂肪酸酯 polyhydro xyal kanoates , P HAs因其完全的生物可降解性 、良好的物理加工特性以及 生物相容性使其应用前途十分广泛 。本文综述了利用转基因植物合成 P HAs 的研究概况和存在问题 ,进一步探讨 了其解决方法 。 关键词 : 转基因植物 生物可降解材料 P HAs Production of Polyhydroxyal kanoates in Transgen ic Plants 1 ,211212 Sun Huanxing Wang Yuhua Wu Zho ngyi Li Wenbin Huang Co nglin Yang Qingkai 1 ( Center f or B iotech nology Resea rch Bei ji n g A ca de m y of A g ricul t u re S cience , Beiji n g 100089 ; 2 )I nst i t ute of S oybea n N ort heast A g ricul t u re U ni verci t y , Haerbi n 150030 () Ab stract : P HAs polyhydro xyal kanoatesare bacterial polyesters having t he p roperties of co mplete biodegradabilit y and bioco mpatibilit y , as well as t he satisfying p hysical p roperties for manufact ure , which decide t heir p ro mising applica2 tio n. In t his article ,research advancement o n t he p roductio n of P HAs in t ransgenic plant s and it s p roblems were reviewed , and t he solutio ns were discussed f urt her . Ke y wo rds : Transgenic plant Biodegradable material P HAs ( 生 物 可 降 解 材 料 —聚 羟 基 脂 肪 酸 酯 poly2 ,利用 CO为碳源 、太阳能为能源合成 引入植物后 2 ) hydro xyalkanoates , P HAs是某些微生物处于非帄衡 目的产物 ,可以大大降低生产成本 。1992 年 Poirier () 生长状态下 如缺乏氮 、磷 、镁等胞内合成的一种贮 等首次将 P HB 合成的关键调控基因转入拟南芥中 , 1 藏性聚酯 。P HAs 因其具有优良的生物可降解性 、 打开了利用转基因植物合成 P HAs 的新篇章。 相容性 、压电性 、光活性 、结构多样性 ,以及由结构变 调控 PHAs 合成的关键酶及其编码基因1 化所带来的新材料性能等特点 ,使其应用前途十分 () P HAs 的 基 本 骨 架 为 R222羟 基 脂 肪 酸 单 体广泛 。 () 图 1,随 X 数目 、R 基的不同而形成不同的类型 。 人们在 P HAs 的微生物学 、生物化学及分子生 物学等多方面研究中已经积累了丰富的资料 ,并通 过微生物发酵法实现某些 P HAs 的小规模生产 。但 由于需要发酵底物且发酵工艺和产物提取工艺复 杂 ,通过微生物发酵法生产的 P HAs 价格昂贵 ,难于 与化学合成塑料竞争 ,使 P HAs 的使用 ,受到很大限 制 。 随着植物转基因技术的日趋成熟 ,研究者们逐 图 1 PHAs 的结构通式 渐将目光转向转基因植物 ,将细菌 P HAs 合成途径 ( )Ξ 国家科技部 863 项目 批准号 :2002AA213051 ΞΞ 联系人 , E - mail : huangco nglin @hot mail . co m 电话 :010 - 51503290 王玉华 ,南京农业大学生命科学院博士研究生 P HB 聚合酶参与 P HB 的合成 ; P HA 聚合酶 、脂酰酰 由于 P HAs 种类复杂 ,合成途径不止一条 ,因而 A 转酰酶参与 mcl2P HAs 的合成 。 基载体蛋白2辅酶 在自然界中存在多种与合成相关的酶 。大量的研究 目前已经从多种微生物中克隆得到这些酶的编码基 () 明 ,调控 P HAs 合成的关键酶有 5 种 表 1,其中 , 2 () 因 表 1,并进行了详细的功能研究。β2酮脂 酰 辅 酶 A 硫 解 酶 、乙 酰 乙 酰 CoA 还 原 酶 和 公司的科研人员用和拟南 [ 2 ]表 1 调控 PHAs 合成的关键酶及其编码基因 1 芥同样的方法获得转基 酶 与酶相应的编码基因 参与合成 P HAs 的种类 因油菜 ,得到类似的结果 : β(βP HB 2酮 脂 酰 辅 酶 A 硫 解 酶 2ketoacyle2 p hbA 当将 P HB 的合 成 定 位 于)CoA t hiolase ( 乙酰 乙 酰 CoA 还 原 酶 Acetoacyl2CoA 细胞质时 , 植株的生长发 P HB p hbB )reductase 3 育受到很大影响。 ( ) P HB 聚合酶 P HB polymerasep hbC P HB 由于马铃薯块茎产量( )P HA 聚合酶 P HA polymerase p haC mcl2P HAs 脂酰 酰 基 载 体 蛋 白2辅 酶 A 转 酰 酶很高 , 具有丰富的碳源用 mcl2P HAs p ha G ( ) Acyl2ACP : CoA t ransacylase 于 P HAs 的 合 成 ; 马 铃 薯 块茎的主要功能是贮存碳源物质 ,基因在块茎中表 利用转基因植物合成 PHAs2 达对植物生长发育影响不大 ;另外 ,马铃薯具有广泛 随着分子生物学的发展 ,植物转基因技术日趋的生长范围 、良好的无性繁殖方式 、成熟的转化 系 成熟 ,这 为 利 用 植 物 生 产 P HAs 提 供 了 新 的 机 遇 。 统 。因此 ,部分研究者也在尝试利用马铃薯块茎合 利用植物合成 P HAs 经历了 3 个阶段 : 植物中 P HB 成 P HB 。中科院植物所的研究人员利用马铃薯全长 合成的尝试 、P HB 的细胞器定位合成 、植物中新型 的 Patatin ?启动子构建了分别含有 p hbB 、p hbC 及 P HAs 的合成尝试 。 同时含有 p hbB 、p hbC 的马铃薯表达载体 ,利用农杆 2 . 1 植物中 P HB 合成的尝试菌介导法转化马铃薯获得转基因植株 ,分析表明块 1992 年 Poirier 等率先尝试利用模式植物拟南 茎细胞中合成了 P HB ,但含量低 。他们认为马铃薯 芥生产 P HB 。他 们 从 罗 氏 真 氧 菌 中 克 隆 了 p hbB 、 块茎细胞中 P HB 合成底物 ———乙酰 CoA 含量过低 p hbC ,利用 CaMV 35 S 启动子分别构建了其植物表4 ,5 是造成块茎中 P HB 产率低的主要原因 。我们认 ( ) 达载体转化拟南芥 A rabi dopsis t hal i a n a , 分别得 为马铃薯块茎中 p hbA 未过量表达 , 也可能是造成到转基因植株 。分析表明 : 两种外源基因已整合于 P HB 产率低的原因之一 。植物基因组中并实现转录 。成熟叶片 、子叶 、根 、茎 和种子中均有电子透明体 P HB 颗粒 , 含量为 20 , 2001 年 Metabolix 公 司 制 定 了 一 个“五 年 ”计 μ100gΠg 鲜重 ;在植物细胞内 P HB 颗粒在液泡 、细胞 ( ) 划 ,选择生物量高的一种草 - 柳枝稷 switchgrass为 6 核和细胞质等部位均有分布 ,细胞质和液泡中颗粒 试材 ,探讨合成 P HAs 。 μμ最大直径达 0 . 5m ,核中最大直径为 0 . 2m ;质体和 2 . 2 P HB 的细胞器定位合成 大量研究者以拟南芥 、油菜 、马铃薯 、棉花等为 线粒体中均未发现 P HB 颗粒 。同时他们发现转基 因植株生长受到严重抑制 ,仅 p hbB 在细胞质中高水 试材 ,证实了在植物体内生产 P HB 的可行性 。同时 帄表达 ,就已导致拟南芥植株生长迟缓 ,种子产量下 也发现存在一些问题 : P HB 产率过低 ; P HB 在植物降 45 % , 种 子 发 芽 22 天 后 , 植 株 生 长 量 比 对 照 少 体内的积累对植物生长发育产生很大的危害 。为解 45 % ; p hbB 和 p hbC 同 时 表 达 , 这 种 现 象 就 更 为 严决上述问题 ,研究者们又开始探索 P HB 的细胞器定 位合成 。 1 2 . 2 . 1 质体 重。 ( Naw rat h 等利用豌豆 Rubisco 1 , 5222磷 酸 核 酮 油菜作为世界第一大油料作物 , 其体内脂肪酸 ) 糖羧化Π加氧酶小亚基的转运肽 ,将 P HB 合成的 3 合成旺盛 ,因而成为合成 P HB 的选择目标 。Zeneca ( ) t pss相连 ,再将这 3 个基因连入同 叶绿体导肽基因 个关键酶基因 p hbA 、p hbB 、p hbC 的表达定位于质 体 。分 别 构 建 CaMV 35 S 启 动 子 控 制 下 的 p hbA 、 一个质粒 ,在根癌农杆菌介导下转化拟南芥 。快速 p hbB 、p hbC 表达载体 , 分别转化拟南芥后 , 经连续 GC2M S 分析表明 ,植物叶片 P HB 含量达 40 mgΠg 鲜 杂交得到同时表达 3 个基因的植株 。透射电镜观察 重 ,含量最高株系达 42 mgΠg 鲜重 ,为植株鲜重 4 % μ到 P HB 仅积累于质体 ,颗粒大小为 0 . 2,0 . 7m ,其 ) (( ) 干重 40 %,较已报道的最大值 10 mgΠg 鲜重提高 它细胞器没有 P HB 积累 。P HB 的含量随植物生长 逐渐增加 ,充分伸展老叶中含量为帅叶 10 倍 , 最高 了 4 倍 ,向人们展示了植物生产可降解聚合物的潜 11可达 10 mgΠg 鲜重 ,占叶片干重 14 % , P HB 产量提高 力。 近 100 倍 。尤其是植物生长发育未受明显影响 ,只 2 . 2 . 2 过氧化物酶体 ( ) 在积累很高时 每克新鲜细胞中 P HB 为 3 mg 以上7 Hahn 等 在 基 因 产 物 羧 基 端 连 接 6 个 氨 基 酸老叶有轻微黄化现象。 ( ) RAVA RL ,将罗氏真氧菌中 3 步合成 P HB 所需的 油料作物种子中含有白色体 ,它是质体的一种 , 酶定位于植物细胞过氧化物酶体 。通过基因枪转化 用于合成并储存脂肪酸 。P HB 颗粒不会穿透质体的 墨西哥黑色甜玉米细胞 ,转化细胞系经悬浮培养后 , 双层膜 ,因此在油料作物种子白色体内合成 P HB ,可 通过气相色谱测得 P HB 含量最高达 2 mgΠg 细胞鲜 以最大限度地减少它的合成对植物生长发育的影响 重 。酶活测定结果表明 : 所有产量超过 0 . 1 mgΠg 细 并提高 产 量 。Zeneca 公 司 的 研 究 人 员 利 用 拟 南 芥 胞鲜重的细胞培养物中 P HB 合成的 3 个关键酶活 12 S 种子储存蛋白编码基因 C RB 的启动子 ,连接叶 性与其产量呈正相关 。同时还观察到仅 P HB 聚合 绿体导肽 ,将 P HB 的合成定位于油菜种子的胚中 , 酶定位于过氧化物酶体就可合成 P HB 约 0 . 4 mgΠg 3 细胞鲜重 。电镜观测到 P HB 颗粒仅在过氧化物酶 P HB 最终含量达种子鲜重的 1 %。Ho umiel 等从 12 体存在 ,细胞质中无 P HB 积累。 罗氏真氧菌中分离了 P HB 合成的 3 个关键酶基因 , Arai 等将来源于 A e r . cav i ae 的 p hbC 基因的碳 分别与 L esque rel l a f en dle ri 油酸 122羟化酶种子特 ( 末端连上菠菜的乙二醇酸氧化酶基因部分片段 编 异性启动子和叶绿体导肽 ct p 相连 , 构建表达载体 码 10 个氨基酸 ,其中 3 个氨基酸为定位于过氧化物并转化油菜 , 将目的基因产物定位于种子白色 体 。 ) 酶体的信号肽序列,再加上 N P T ?选择标记 ,构建 转基因 油 菜 白 色 体 中 P HB 含 量 达 成 熟 种 子 鲜 重 成载体转化拟南芥 ,在转基因拟南芥过氧化物酶体 7 . 7 % 。电镜观察表明 ,转基因植株白色体虽由于大13 8 () 里合成了 scl2P HAs 单体包括 3 HB 、3 HV 、3 H H。 量 P HB 积累而体积增大 ,但还保持完整。 2 . 3 植物中新型 P HAs 的合成尝试Lo ssl 等将编码 P HB 合成途径的多顺反子 p hb 人们在探讨提高 P HB 产率和尽量减轻 P HB 的 (操纵子克隆到质体专一性转化载体 plasto me t rans2 合成对 植 物 生 长 发 育 影 响 的 同 时 , 也 在 探 讨 新 型 ) fo r matio n vecto r上 ,转化烟草质体基因组 ,获得转基 P HAs 的合成 。 因植株 , P HB 含量为干重的 1 . 7 % 。但在该研究中 , (β) Valentin 等将 bk tB 2酮脂酰 CoA 硫解酶、p h2 p hb 操纵子在转录时被分割成 2 个转录子 : p hbB 转 bA 、p hbB 、p hbC 基因和一个提高 22酮丁酸含量的调 录子 、p hbC + p hbA 转录子 , 转录水帄的不一致 , 也 9 控基因 i l v A 转入拟南芥中 ,定位在质体中表达 , 在 可能影响 P HB 产率。 纯合的转基因植株中 P HBV 的含量达干重的 12 % Menzel 等也从罗氏真氧菌中分离了 P HB 合成 ,13 % ;他们又将 i l v A 、bk tB 、p hbA 、p hbB 、p hbC 基 的 3 个关键酶基因 ,分别与豌豆 Rubisco 的质体定向 因转入油菜中 ,定位在种子中合成 P HBV ,纯合的转 序列相连 ,再将这 3 个基因连入同一质粒 ,导入甜菜 14 基因植株种子中 P HBV 的积累量约达 7 %。( 发根白色体 ,获得 20 个转基因发根克隆 t ransgenic 10 Mit tendo rf 等 将 源 于 Pseu dom on as ae r u gi nos a ) hairy2root clo ne, P HB 含量占干重的 5 . 5 %。 的 p haC1 基因的碳末端连接上 CaMV 35 S 启动子和 Bo hmert 等将 P HB 合成的 3 个关键酶基因分别 过氧化物酶体导肽序列后转入拟南芥中 。免疫学检 ( ) 与编码豌豆 Pis u m s at i v u m L i n n Rubisco 小亚基的 测证实 :修饰后的 P HA 聚合酶有活性 。植物在光下 生长时 mcl2P HAs 在叶型过氧化物酶体中合成 ,在无 P HAs 的种子难以顺利萌发的问题 , 为解决含 光的 条 件 下 mcl2P HAs 在 乙 羧 酸 循 环 体 中 合 成 。中科院植物所的研究人员提出了如下解决策略 : 分 mcl2P HAs 在叶型过氧化物酶体 、乙羧酸循环体和液 别转化油菜的不育系 、保持系和恢复系 ,利用 3 系保 泡中积累 。快速 GC2M S 分析显示 mcl2P HAs 在植物 持 P HA 合成相关酶基因表达的遗传稳定性 ,通过 3 15 中的积累量最高达 4 mgΠg 干重。 系杂交的方法 ,使 P HA 只在杂交种中积累 , 并得到 我们实验室与清华大学生物系陈国强实验室合了大量的转基因油菜 。但同时也存在 3 个基因翻译 16 作 ,从微生物中克隆了 6 个调控 mcl2P HAs 合成的关 水帄不一致的问题。 键基因 p haC 和 p ha G , 正在探索 mcl2P HAs 在马铃 合成关键基因在转基因植物中的转化效 P HAs 3 . 2 薯和烟草中合成的可能性及其产率 。 率低 转化率低也是利用转基因植物合成 P HB 遇到利用转基因植物合成 PHAs 存在的问题与3 β的一 个 问 题 。Bo hmert 等 通 过 研 究 指 出2酮 脂 酰 对策 CoA 硫解酶在转基因植株中的组成型表达是转化率 在植物体内的合成 、积累影响转基因植 3 . 1 P HAs 低的一个首要原因 。他们的解决办法是在启动子与 物的正常生长发育 从第一 代 转 基 因 植 物 开 始 , 人 们 就 发 现 P HAs β2酮脂酰 CoA 硫解酶之间加入玉米转座子或是利用 在植物体内的合成对转基因植物生长 、发育会造成 β诱导型启动子来调控2酮脂酰 CoA 硫解酶的表达 , 不良影响 。主要表现在 :植物生长迟缓 、种子产量下 18 转化率有所提高 。 116 3 . 3 P HAs 在转基因植物中的合成产率低 美国孟山 、转基因植物种子萌发力降低等 。分析原因降 都公司提出 , 只有 P HAs 在植物中的 () 有以下几点 : 1植物细胞中乙酰 CoA 的主要代谢使 积累量超过 20 %时 ,利用植物合成的 P HAs 才具有 命是作为前体合成甲羟戊酸 , 实验表明 : 异源 P HB19 商业价值 。但迄今为止 ,只有 Bo hmert 等报道在 合成消耗细胞质中约 50 %的乙酰 CoA 。可能因乙酰 拟南芥叶片中获得了 40 %的产率 ,而在其它植物中 CoA 分流过多 ,导致内源异戊二烯类和类黄酮类等 11 1 均未见有超过 20 %的积累量。因此 , P HAs 在植 重要物质合成底物不足 ,影响植株正常生长发育。 物体内的低产率是摆在科研工作者面前的又一大难 () 2P HBV 的合成竞争氨基酸代谢途径中的底物 ,导 题 。 致植物中必需氨基酸的含量不足 ,影响植株正常生17 欲提高 P HAs 产量 , 我们认为应该采取如下策长() 。3P HAs 在油料作物种子中的合成与积累 , 略 :既分流了脂肪酸的合成底物 ,使脂肪酸含量下降 ,令 种子在萌发过程中营养不足 ; 又由于种子在萌发过 () 1选择 P HAs 合成底物丰富的植物和部位 ,如 程中不断地积累 P HAs ,而使种子萌发力下降 ,影响 马铃薯的块茎 ,淀粉产量高 ,块茎中 P HAs 合成底物 () 了植株正常生长 。4P HAs 这种惰性物质在植物体 相对含量低 ,但绝对含量高 ; 且马铃薯可无性繁殖 , 内的积累可能对生长产生毒害作用 。一些科研工作 ( ) 可不受种子育性的影响 。2降低 P HAs 合成关键 者采取了将 P HAs 的合成定位于质体中的方法 , 希 望减少 P HAs 对植物体的毒害 , 但并未完全解决问 调控基因的底物专一性 , 即通过扩大合成 P HAs 底 题 。液泡是细胞中的小仓库 ,许多对植物体有害的 物的范围来增加植物体内合成 P HAs 的底物含量 。 物质都被储存于其中 ,以尽量减少有害物对植物体 () 3调控代谢途径 , 将植物体内的乙酰2CoA 引 的损害 ,如能将 P HAs 贮存在液泡中 ,可能会减少它 20 向 P HAs 合成,但修改植物体内的代谢途径可能 对细胞的毒害 。1998 年 Mit tendo rf 等将 P HAs 的合 21 会引起代谢紊乱,所以加强对植物体内代谢途径 成定位于过氧化物酶体中 , 发现 P HAs 不仅在过氧 化物酶体中积累 ,还在液泡中积累 ,这就让我们看到 的研究是十分必须的 。 了 ,以后在植物细胞液泡中大量积累 P HAs 的可能 () 4加强对转基因方法的研究 ,大胆利用新的转 22 基因方法 , 如叶绿体基因, 通过技术上的突 破 ,达到提高 P HAs 产率的目的 。中科院植物所的 15 性。 研究人员通过叶绿体基因工程在烟草中表达 P HB , ht tp :ΠΠmetabolix . co mΠ 6 实验结果表明叶绿体型转基因植株中目的基因在转 23 Nawrat h C , Poirier Y , So merville C. Proc Natl Acad Sci U SA , 7 录水帄的表达 ,明显高于核转化植株中相应基因。 1994 , 91 :12760,12764 . 我们实验室与中科院植物所目前正密切合作 ,进一 Ho umiel KL , Slater S , Broyles D , et al . Planta , 1999 , 209 : 547 , 8 550 . 步优化 植 物 叶 绿 体 基 因 工 程 技 术 , 希 望 找 到 生 产 ( ) Lo ssl A , Eibl C , Harloff HJ , et al . Plant Cell Rep , 2003 , 21 9: P HAs 的最经济途径 。9 891,899 . ( ) 5筛选在植物体内可以高效表达的 P HAs 合 Menzel G , Harloff HJ , J ung C. Appl Micro biol Biotechnol , 2003 , 10 ( ) 60 5: 571,576 成关键调控基因 。目前克隆得到的 P HAs 合成关键 Bo hmert K , Balbo I , Kop ka J , et al . Planta , 2000 , 211 : 841 , 调控基因很多 ,且均来源于微生物 。因此 ,筛选在植 11 845 . 物体内高效表达的基因至关重要 。 Hahn JJ , Eschenlauer AC , Sleyt r UB , et al . Biotechnol Prog , 利用转基因植物实现 P HAs 的商业化生产已成1999 , 15 :1053,1057 . 12 Arai Y , Nakashita H , Suzuki Y , et al . Plant Cell Physiology , 为生命科学 、材料科学以及环境科学共同关注的焦 ( ) 2002 ,43 5:555,562 . 13 点 。其研究已从可行性探索阶段开始向商业化生产 Valentin HE , Broyles DL , Casagrande L A , et al . Int J Biol Macro2 阶段迈进 , 如何进一步提高 P HAs 在转基因植物中 ( ) mol ,1999 ,25 1,3:303,306 . 14 的合成产率 、降低对植株正常生长发育的副作用已 Mit tendo rf V , Ro bert so n E J , L eech R M , et al . Proc Natl Acad Sci U SA , 1998 , 95 :13397,13402 . 成为亟待解决的问题 。 15 ( ) 叶梁 , 李枞 ,等. 科学通报 , 2000 , 45 5:516,521 . 总之 ,随着对 P HAs 认识的不断深入和利用转 李枞 , 宋艳茹. 高技术通讯 ,1998 ,5 :52,57 . 16 基因植物生产 P HAs 经验的积累 , 利用转基因植物 Bo hmert K , Balbo I , Steinbuchel A , et al . Plant Physiology ,2002 , 17 128 :1282,1290 . 实现 P HAs 的商业化生产将为期不远 。 ( ) Gro ss RA , Kalra B. Science , 2002 , 297 2:803,807 . 18 Eldbo ro ugh KM , Simo n J W , Swinhoe R. Plant Mol Biol , 1994 , 24 :21,34 . 参 考 文 献 19 Rees T. T IB T ECH ,1995 ,13 :375,346 . 1 Poirier Y , Dennis D E , Klo mparens K. F EMS Micrbiol Rev , 1992 , 20 103 :237,246 . Zhang J Y , Zhang Y , So ng YR. Acta Botanica Sinica , 2003 , 45 ( ) 5:509 2 Prog Polym Sci , 2000 , 25 : 1503 , Sudesh K , Abe H , Doi Y. 21 ( ) 张景昱 ,苏宁 ,等. 科学通报 , 2002 , 47 11:845,848 1555 . 22 ( ) 3 叶梁 , 王焘 , 等. 科学通报 ,1999 ,4 12:1249,1257 . ( ) 谢安勇 ,崔晓江 ,等. 植物学报 ,1995 ,37 8:581,588 . 4 23 ( ) 雍伟东 ,梁铁冰 ,等. 植物学报 ,1998 ,40 7:615,621 . 5 农 业 出 版 社 生 物 类 图 书 目 录 序 号 名 称 定 价 序 号 名 称 定 价 1 食品微生物学实验技术 18 . 00 13 38 . 00 动物营养参数与饲养 2 18 . 00 14 47 . 50 药用真菌栽培实用技术 实验动物医学 3 沼气生态农业技术 9 . 80 15 120 . 00 鱼类分类学 4 动物药物提取制备实用技术 17 . 50 16 150 . 00 中国大型真菌原色图鉴 5 15 . 00 17 62 . 80 兽药制剂学 福建食用菌 6 医学动物实验实用手册 28 . 00 18 56 . 00 广东果树真菌病害志 7 7 . 20 19 28 . 50 对虾生态养殖技术 动物霉形体及研究方法 8 10 . 80 20 160 . 00 生物饵料培养技术 动物毒物学 (9 21 160 . 00 实用生物有机肥问答 九亿农民 动物传染病学 )22 70 . 00 致富丛书 5 . 00 病毒形态结构与结构参数 23 55 . 00 10 11 . 60 饲料添加剂应用技术问答 微生物培养基的制造与应用 24 47 . 50 11 植物生理学名词解释 10 . 00 食品物性学 12 动物生理学词典 25 分子植物病理学 48 . 00 11 . 80 ( ) 注 : 除上述书目外 ,还有其它书目 ,请来信来函索取 。欲购图书的读者 ,请您将书款和邮费 按书款的 30 %计算一并寄至 : 北京中关村南 ( ) 大街 12 号中国农科院文献中心图书馆楼 111 室陈跃英 收邮编 :100081 ,联系电话 : 010 - 68975040 ,汇款时请您注明书名 、数量 、详 细地址及邮编 。