冬瓜仁美白霜美白功效的动物实验研究

冬瓜仁美白霜美白功效的动物实验研究 孙晓庭 黄掣曌 张喆 张旭 曹燕霞 指导老师:张建华 上海中医药大学2005级中西医结合、中医临床七年制，201203 [摘要] 目的:冬瓜仁美白霜剂在动物实验研究的美白效果评价。方法:用水提醇沉法提取冬瓜仁萃取液，做成不同浓度的冬瓜仁霜剂、熊果苷霜剂、辅料霜剂和空白对照组。将豚鼠背部备皮，进行紫外灯照射造模后，分成六个区域，每天两次涂抹各霜剂，持续一个月。每周用Q-2000皮肤色素测试仪测试每个区域的色素变化，数据，最后用SPSS统计软件统计数据。结果:由于实验遇到种种问题，故实验结果为阴性，原因分析见讨论。 [关键词] 冬瓜仁;美白;熊果苷 随着中国走进国际市场，人们对生活的要求也渐渐趋于国际化，已经不仅仅是停留在吃得饱穿得暖的层面上，而是考虑如何让自己的生活多姿多彩，更加出众。 近年来，中药美白的研究正不断地取得成果，如白芷美白众所周知，茯苓美白家喻户晓，白术美白世人皆知。中药之所以能在美白领域不断取得进展，是出于对化学美白祛斑产品毒性、刺激性的疑虑，越来越多的科学研究者倾向于从天然植物中寻找安全高效的美白活性物质。中药美白祛斑实验研究可以从细胞生物学、整体动物、组织器官水平去考虑。结合美白祛斑原理，研究者可以做黑素细 [1]胞生物学、抗氧化、抗衰老、清除氧自由基等实验研究。 我们所要研究的美白霜剂的主要成分为冬瓜仁，是《普济方》记载的“七白膏”的主要药材。“七白膏”是一个经典美容名方，明代《普济方》中“七白膏”组成:香白芷、白敛、桃仁各一两(36.3g)，辛夷、冬瓜仁、白附子、细辛各三钱(10.8g)。对此方中几味药进行黑素细胞(MC)增殖、黑素合成影响做实验研究，研究表明白附子、白敛、冬瓜仁、桃仁、辛夷在高浓度时对黑素细胞增殖抑制作用明显。冬瓜仁抑制黑素细胞内黑素合成作用最明显，其余各中药大部 分不同浓度提取物对细胞内黑素合成的影响与熊果苷作用相当，无显著性差异。七白膏对黑素合成抑制作用中，冬瓜仁在其中是最好的。冬瓜仁的三种不同浓度中，对黑素合成抑制作用效果，由低浓度、中浓度、高浓度依次递减;但对黑素细胞增殖抑制作用，由低浓度、中浓度、高浓度依次递增。由此可见“七白膏” [2] 。中冬瓜仁的美白功效值得关注 此次实验选用豚鼠作为动物实验对象，因为豚鼠皮肤含有黑色素细胞。有人曾采用多巴氧化酶法、硫酸亚铁吸收法、亚铁氰化钾法和银浸染色法4种组织化 [3]学染色方法对豚鼠皮肤黑色素细胞进行染色。为了对比各霜剂组的效果，我们 [4] 将豚鼠皮肤分区，在每只豚鼠身上均涂以5种霜剂。 实验选用熊果苷霜剂作为阳性对照组，是因为熊果苷，具有安全性高、美白效果明显等特点，是重要的酪氨酸酶抑制剂，能够在不具备黑素细胞毒性的浓度 [5] 范围内抑制酪氨酸酶的活性，阻断多巴及多巴醌的合成，从而遏制黑素的生成。 实验豚鼠需进行紫外线造模，对于紫外线造模的波长选择有实验表明:波长300,435nm 的紫外线具有色素沉着作用。最大色素沉着强度位于355nm，为100%个色素沉着强度相对单位，小于300nm 或大于435nm 时，紫外线色素沉着作用为零。实验同样表明，不同波长紫外线的色素沉着量不同，现统一以功率为lW 的297nm 波长的紫外线灯的辐射强度为一个色素沉着剂量。不同波长紫外线照射的色素沉着效果相差很大，色素沉着作用最强的紫外线波长为294nm，最弱的波长是320nm，波长大于320nm 时，色素沉着作用为零，相对作用最强的波段位于 [6]~[10] 290, 310nm 之间。所以，我们选用355nm对豚鼠的背部进行紫外灯照射。1 材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 动物 豚鼠，26只，体重，250g左右，雌雄不分。由上海中医药大学物实验中心提供。 1.1.2 药品与试剂 冬瓜仁250g 购自上海雷允上药业有限公司;冬瓜仁萃取液利用上海中医药大学实验室自制;熊果苷10g，由上海中医药大学后勤部代购;75g/L、150g/L、300g/L的冬瓜仁美白霜剂，熊果苷美白霜剂和空白组霜剂由上海科曼化工有限公司加工制作。 1.1.3 主要仪器 紫外线灯，RUIYA公司;Q-2000皮肤色素测试仪，广州佳美专 业美容公司。 1.2 冬瓜仁萃取液的提取 中药传统提取常用的方法有煎煮法、浸渍法、渗漉法、回流法、水蒸气蒸馏法等。中药提取液一般体积较大、有效成分含量低、杂质多。为了提高疗效，减少药物服用量，增加制剂的稳定性，常需要进一步精制。传统精制的方法有水醇 [11]。而我们所用的是水提醇沉法进行提取冬瓜仁萃取液，法、醇水法、透析法等 其方法如下: ?取250g药材+2500ml水煎煮1h，倒出药液;?药渣再加2000ml水煎煮1h，倒出药液。以?+?药液共同浓缩至250ml，加入X1ml95%醇沉;静置隔夜。待第2天，以双层滤纸真空过滤，旋转蒸发回收乙醇后，第1次提取液为250ml，加X2ml95%乙醇(第2次醇沉)。待第3天，将第2次醇沉液以双层滤纸真空过滤;旋转蒸发回收乙醇后，所剩提取药液以纯水稀释至250ml。提取药液相当于生药材1g/ml。X1换算式为:50%(A+x)=95%x;X2换算式为:75%(B+x)=95%x。 1.3 冬瓜仁、熊果苷和空白组霜剂的加工制作 霜剂由上海科曼化工有限公司加工制作，其配方见表1: 表1:霜剂配方表(100g中含量) A25 单甘白油 十六、二棕氮甘汉生去离子防腐冬瓜仁提取液 酯 十八甲榈酮 油 胶 水 剂 醇 基酸组别 硅异 油 丙 酯 1 3.5 1 4 5 2 2 0.5 6 0.3 加至适量 冬瓜仁7.5 100 2 3.5 1 4 5 2 2 0.5 6 0.3 加至适量 冬瓜仁15 100 3 3.5 1 4 5 2 2 0.5 6 0.3 加至适量 冬瓜仁30 100 4 3.5 1 4 5 2 2 0.5 6 不加 加至适量 熊果苷5.0 100 辅料3.5 1 4 5 2 2 0.5 6 不加 加至适量 无 组 100 1.4 造模 1.4.1 动物测试部位和备皮 将豚鼠背部的毛剔除，进行备皮，区域大小定为:4cm×6cm。再用龙胆紫将该区域平均划分为六个区域，分别待涂75g/L、150g/L、300g/L的冬瓜仁美白霜剂，熊果苷美白霜剂和辅料组霜剂，剩余一块区域不涂抹霜剂，作为空白对照。 1.4.2 紫外线造模 对备好皮的豚鼠背部进行紫外线造模，每天照射15分钟，连续照射一周。对豚鼠进行紫外线造模所用的波长为300,435nm。使受试部位的皮肤颜色加深，紫外线灯照射前用Q-2000皮肤色素测试仪测试记录数据，照射后再次记录数据。 1.5 给药 将75g/L、150g/L、300g/L的冬瓜仁美白霜剂，熊果苷美白霜剂和辅料组霜剂涂抹在豚鼠背部的五个区域，分别是:左上为75g/L冬瓜仁美白霜剂，左中为150g/L冬瓜仁美白霜剂，左下为300g/L冬瓜仁美白霜剂，右上为熊果苷美白霜剂，右中为辅料组霜剂，右下不涂抹任何霜剂。 上述涂抹法每天早晚各两次，为期一个月。 1.6 疗效评判的方法 使用Q-2000皮肤色素测试仪对豚鼠背部每个区域每周进行测试，并且记录数据进行分析。测试仪所测出的数值0对应的RGB通道为(0，0，0)，即为黑色，100对应的RGB通道为(255，255，255)，即为白色。其测出的数值越接近100则表示越接近白色。 1.7 统计学方法 所有数据均使用SPSS统计软件统计。 2 结果(见表2) 表2:各实验组结果比较(?s) x 冬瓜仁组 空白对照 300g/L 150g/L 75g/L 熊果苷组 辅料组 组 19 19 19 19 19 19 样本量 86.84?84.79?83.00?82.63?81.11?81.21? 值 5.68 5.06 4.07 4.96 3.40 3.29 注:各个实验组与空白对照组比较，由于差值均不呈正态性分布，运用Wilcoxon检验。其中熊果苷(P=0.007)和300g/L冬瓜仁霜剂组(P=0.024)P<0.05，150g/L冬瓜仁霜剂组(P=0.079)、75g/L冬瓜仁霜剂组(P=0.265)和纯辅料实验组(P=0.694)P>0.05。 由上述数据可以看出，熊果苷和高浓度(300g/L)冬瓜仁霜剂组与空白对照组的差别具有统计学意义，可以认为实验结果呈阳性。其余实验组，即中浓度(150g/L)冬瓜仁霜剂组、低浓度(75g/L)冬瓜仁霜剂组和纯辅料实验组与空白对照组的差别无统计学意义，实验结果为阴性。 3 讨论 本次实验存在一些问题。由于没有科学研究方面的，对于实验用豚鼠的种类缺乏一定的了解。在实验进行两周后，我们才得知实验豚鼠预先经过白化处理，体内黑素细胞几乎不存在，所以可能导致实验完全失败。指导老师也说实验基本会失败。但是本着探索研究的目的，我们继续将实验完成，最终的实验结果是熊果苷和高浓度(300g/L)冬瓜仁霜剂组均显示阳性结果。 另外，中浓度(150g/L)冬瓜仁霜剂组和低浓度(75g/L)冬瓜仁霜剂组阴性结果的产生可能基于以下两种原因:第一，实验产生阳性结果需要霜剂浓度达到某一“阈值”，此两种浓度未达到该“阈值”，由于浓度不够而引起实验结果阴性;第二，实验产生阳性结果需要持续一定的作用时间，熊果苷和高浓度(300g/L)冬瓜仁霜剂组由于浓度高、作用明显，所需时间较短，故可在一个月的实验时间内产生阳性结果，而中浓度(150g/L)冬瓜仁霜剂组和低浓度(75g/L)冬瓜仁霜剂组由于浓度较低，可能所需实验周期较长(一般美容霜剂的实验周期为2个月)，由于时间不足，未能产生阳性结果，有待继续实验进行论证。 我们对两个阳性结果进行分析，认为存在两种可能性: 一方面，豚鼠虽然经过白化，但是体内黑素细胞仍然少量存在，实验的阳性结果为真实可信的。在此结果之上，熊果苷作为阳性对照组，与高浓度(300g/L)冬瓜仁霜剂组的阳性结果比较，运用Mann-Whitney检验，P>0.05,两者差别无统计学意义，即可以认为熊果苷和高浓度(300g/L)冬瓜仁霜剂组对于豚鼠皮肤的 美白效果达到相同的，该浓度下的冬瓜仁美白霜剂的效用是值得信赖的。 另一方面，由于实验方法和实验各环节的操作问题，我们认为可能由于以下几点原因导致实验结果呈假阳性: 第一， Q-2000皮肤色度测试仪，该仪器取值区间为0-100，其测试精度不够。且在未经过改装前，仪器的误差达到(?5)，在加光圈改造之后，仪器误差仍在(?3)范围内。在此等误差条件下，所测数值波动范围较大，对于结果的影响也较大。 第二，测试环境。虽然我们尽力保证每次测试环境差别最小，但是由于仪器敏感度高，光线的强弱、测试部位不同、力量大小不等以及豚鼠的运动挣扎等，均可对测试结果产生影响，我们已经采用多次测量取平均值的方法，尽量减少这方面原因造成的误差，但是误差的存在是不可避免的。 第三，实验方法。由于成本问题，我们为了利用有限的实验资金，同时保证多组实验的样本量达到要求，我们采取了在同一只老鼠背部分区域进行实验的方法。此方法优点在于可以在同一只老鼠背部进行多组实验，可减少实验动物数量、皮肤试验条件一致;其不足之处在于，由于分区域，会导致每组的实验部位不完全相同，虽然老鼠背部皮肤色泽一致，但是针对不同组别进行比较时，还是会存在一定的差异，造成结果的不准确性。 第四，老鼠皮毛的生长。老鼠皮毛的生长速度较快，在实验过程中无法及时剃毛，霜剂无法及时透过表皮到达深层皮肤，对实验结果也存在一定影响。 为了将来进一步探索实验是否能产生阳性结果，我们提出几点改进方法: [12]第一，改豚鼠为美白实验用的裸鼠。 第二，改进实验方法，争取对于每只老鼠只做一组对比试验。 第三，寻找精度和适用度更高的仪器。 参考文献 [1]邵秋莲,钟晓明.中药美白祛斑药效实验研究进展.中国美容医学，2007，16(9):1315-1317. 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