2-荧光分光光度法测定维生素B2的含量

2-荧光分光光度法测定维生素B2的含量 荧光分光光度法测定维生素B2的含量 实验目:荧光分光光度法测定维生素B2的含量 一、实验目的 1、掌握曲线法定量分析维生素B2的基本原理。 2、了解荧光分光光度计的基本原理、结构及性能，掌握其基本操作。 二、实验原理 维生素B2(又叫核黄素，VB2)是橘黄色无臭的针状结晶。其结构式为: 由于分子中有三个芳香环，具有平面刚性结构，因此它能够发射荧光。维生素B2易溶于水而不溶于乙醚等有机溶剂，在中性或酸性溶液中稳定，光照易分解，对热稳定。 维生素B2溶液在430~440nm蓝光的照射下，发出绿色荧光，荧光峰在535nm附近。维生素B2在pH,6~7的溶液中荧光强度最大，而且其荧光强度与维生素B2溶液浓度呈线性关系，因此可以用荧光光谱法测维生素B2的含量。维生素B2在碱性溶液中经光线照射会发生分解而转化为另一物质——光黄素，光黄素也是一个能发荧光的物质，其荧光比维生素B2的荧光强得多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。 在稀溶液中，荧光强度F与物质的浓度c有以下关系: F,2.303ФI0εbc 当实验条件一定时，荧光强度与荧光物质的浓度呈线性关系: F=Kc 这是荧光光语法定量分析的依据。 三、主要仪器与试剂 主要仪器:荧光分光光度计;1cm石英皿;25mL容量瓶;1mL、5mL移液管 试剂:维生素B2标准溶液:10.0μg/mL 待测样品溶液 四、实验步骤 1、系列标准溶液的制备 取维生素B2标准溶液(10.0μg/mL) 1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、5.00mL分别置于50mL的容量瓶中，各加入去离子水稀释至刻度，摇匀。得浓度依次为0.20μg/mL、0.40μg/mL、0.60μg/mL、0.80μg/mL、1.00μg/mL的一系列维生素B2标准溶液。待测。 2、激发光谱和荧光发射光谱的绘制 设置λem,540nm为发射波长，在250~500nm范围内扫描，荧光发射强度和激发波长的关系曲线，便得到激发光谱。从激发光谱图上可找出其最大激发波长λex=373nm。 从得到的激发光谱中找出最大激发波长，在此激发波长下，在450~700nm范围内扫描，记录发射强度与发射波长间的函数关系，便得到荧光发射光谱。从荧光发射光谱上找出其最大荧光发射波长λem=525nm。 3、标准溶液及样品的荧光测定 将激发波长固定在最大激发波长，荧光发射波长固定在最大荧光发射波长处。测量上述系列标准维生素B2溶液的荧光发射强度。数据记录于2中。以溶液的荧光发射强度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标，制作标准曲线。 在同样条件下测定未知溶液的荧光强度，并由标准曲线确定未知试样中维生素B2的浓度，计算待测样品溶液中的维生素B2的含量。 五、数据记录与结果分析 ?、维生素B2激发光谱图: ?、维生素B2荧光发射光谱图: 从计算机分析中得知，未知液经过稀释后的维生素B2的含量为0.155μg 则原来未知液的含量C=(155μg/mL x 50.00mL) /2.00mL=3.88μg/mL 分析与讨论:来说，本次实验得操作并不是很复杂，大部分数据分析工作都是有计算机完成。实验的关键是 配溶液。本次实验得到标准曲线的相关性为0.99949，约等于1，即说明此次结果相对好。 思考题: 1. 试解释荧光光度较吸收光度法灵敏度高的原因。 答:这是由于现代电子技术具有检测十分微弱光信号的能力，而且荧光强度与激发光强度成正比，提高激发光强度也可以增大荧光强度，使测定灵敏度提高。吸光光度法则不然，它测定的是吸光度，不管是增大入射光强度I0，还是提高检测器的灵敏度，都会使透光信号与入射光型号以同样的比例增大，吸光度值并不会改变，因而灵敏度不会提高。 2. 维生素B2在PH=6~7时荧光最强，本实验为何在酸性溶液中测定, 答:维生素B2在碱性条件溶液中经光线照射会发生分解而转化成另一物质:光黄素。光黄素也是一个能发荧光的物质，其荧光笔维生素B2的荧光强得多，故测维生素B2的荧光时溶液要控制在酸性范围内，且在避光条件下进行。