斑节对虾几种激素和基因与卵巢发育相关性的研究（可编辑）

斑节对虾几种激素和基因与卵巢发育相关性的研究（可编辑） 斑节对虾几种激素和基因与卵巢发育相关性的研究 学校代 码: 10264 M090101097 研究生 学号 :上 海 海 洋 大 学 硕 士 学 位 论 文 斑节对 虾 几种 激素和基因 与卵巢发 题 目: 育相关 性 的 研究 Reseach of some hormones and genes being correlation with ovary development from 英文题 目: Penaeus monodon 水产养 殖 专 业: 海洋生物 分子生物学 研究方 向: 周俊 姓 名: 江世贵 研究员 指导教 师 :二 O 一二年 六 月 上 海 海 洋 大 学 学 位 论 文 原 创 性 声 明 本 人 郑 重 声 明 : 我 恪 守 学 术 道 德 , 崇 尚 严 谨 学 风 。 所 呈 交 的 学 位 论文,是本人在导 师的指导下,独立 进行研究工作所取 得的成果。除 文中已经明确注明 和引用的内容外, 本论文不包含任何 其他个人或集 体已经发表或撰写 过的作品及成果的 内容。论文为本人 亲自撰写,我 对所写的 内容负 责 ,并完全 意识到 本 声明的法 律结果 由 本人承 担 。学位论文作者签名: 日期:年 月 日 上 海 海 洋 大 学 学 位 论 文 版 权 使 用 授 权 书 学 位 论 文 作 者 完 全 了 解 学 校 有 关 保 留 、 使 用 学 位 论 文 的 规 定 , 同 意学校保留并向国 家有关部门或机构 送交论文的复印件 和电子版,允 许论文被查阅或借 阅。本人上海 海洋大学可以将本 学位论文的全 部或部分内容编入 有关数据库进行检 索,可以采用影印 、缩印或扫描 等复制手 段保存 和 汇编本学 位论文 。 保密 ?,在年解密后适用本版权书。 本学位论文属于 不保密 ? 学位论文作者签名:指导教师签名: 日期:年 月 日 日期:年 上海海 洋大 学硕 士学 位论 文 斑 节对虾 几种 激素 和基因 与 卵巢发 育相关 性的 研究摘 要 由 于 目 前 普 遍 采 用 的 剪 眼 柄 催 熟 法 存 在 很 多 弊 端 , 对 斑 节 对 虾 繁 育 机 理 进行 研 究 以 寻 找 新 的 安 全 便 利 的 催 熟 方 法 成 为 突 破 斑 节 对 虾 雌 性 性 腺 难 以 大 批 量 集 中 成 熟 问 题 的 研 究 重 点 和 难 点 。 本 研 究 确 定 了 实 验 用 斑 节 对 虾 卵 巢 发 育 所处时 期, 检测了卵巢发育过程中血淋巴的四种激素的浓度变化,同时, 克隆了 与 M 期相关 的 MPP6 基因,研究 了 MPP6 基因表达情况及 其与卵巢发育调控相关基因 cyclinB 以及 cdc25 的表达差异 和相关性 , 为进一步研究与 卵巢发育相关的激素和基因 间的 关联网络 奠定基础, 为研究斑节对虾卵巢发育调控机理提供参考资料。 本实验采用石蜡切片和 HE 染色技术, 结合解剖学、 细胞学和组织学技术对斑 节 对 虾 卵 巢 各 分 期 进 行 分 类 和 鉴 定 , 确 定 了 实 验 用 斑 节 对 虾 卵 巢 发 育 所 处 时 期 。 主要 鉴 定 依 据 为 卵 母 细 胞 特 征 , 即 ? 期 卵 巢 中 绝 大 多 数 细 胞 为 卵 原 细 胞 , 细 胞 小 且 细 胞 核 比 较 大 。 ? 期 中 大 多 数 卵 母 细 胞 是 染 色 质 核 仁 期 卵 母 细 胞 和 周 边 核 仁 期 卵母细胞。 ? 期 中 已 出 现 少 量 的 卵 黄 囊 卵 母 细 胞 。 ? 期 中 大 多 数 卵 母 细 胞 是 卵 黄 囊 卵 母 细 胞 。 ? 期 中 可 见 成 熟 的 边 缘 布 满 皮 质 杆 状 体 的 卵 母 细 胞 。 ? 期中多数卵 母 细 胞 是 染 色 质 核 仁 期 卵 母 细 胞 和 周 边 核 仁 期 卵 母 细 胞 及 部 分 皮 质 杆 状 体 的 卵 母 细胞。 采用化学发光法(Chemiluminesence immunoassay, CLIA )检测了卵 巢发育 阶 段 ( ?期至?期) 血淋巴中促黄体生成激素 (Luteinizing hormone, LH ) 、 促卵泡生 成激素(Follicle-stimulating hormone, FSH ) 、 孕 酮 (Progesterone, P )和雌二醇 (Estradiol, E2 )的浓度和变化趋势。实验结果显示, 卵巢发育过程中 斑节对虾血 淋巴中促黄 体生成激素在卵黄积累阶段 ? 期至 ? 期浓度较高, ? 期 约 为 0.27 mIU/ml 和 ?期约为 0.24 mIU/ml 。卵巢成熟期 ?期浓度最低约为 0.10 mIU/ml ,而 后在恢复期浓度增大。 促卵泡生成激素的浓度在卵巢发育起始期 ?期达到峰值 (约 0.13 IU/ml ) , 而后在卵巢发育过程中浓度持续下降, 至卵巢成熟期 ? 期浓度最低 (约 为 0.03 IU/ml ) ,而后在恢复期浓度增加。孕酮浓度在卵巢发育 ?期缓慢升高,至 ?期增长为 105.3 pg/ml 。雌二醇浓度在卵巢发育期中浓度大致相同,最大值 ?期 (77.0 pg/ml )为最小 值?期(68.7 pg/ml)的 1.2 倍。斑节对虾血淋巴中 E2 浓度 自 ? 期 卵 巢 开 始 发 育 起 一 直 维 持 在 较 高 水 平 , 且 呈 高 低 交 替 变 化 趋 势 。 结 果 显 示 I上海海 洋大 学硕 士学 位论 文 斑 节 对 虾 四 种 激 素 与 卵 巢 发 育 有 关 , 与 其 在 脊 椎 动 物 中 的 功 能 一 致 可 能 发 挥 着 促 进卵巢发育的作用。 采用 cDNA 末端快速 扩增技术 (Rapid Amplification of cDNA Ends, RACE) 从 斑 节 对 虾 总 RNA 反 转 录 产 物 中 获 得 了 碱 基 长 度 为 690bp 的 M 期 磷 酸 蛋 白 6 (M-phase phosphoprotein 6, MPP6 ) 的全长 cDNA 序列, 并命名为 PmMPP6。 该序 列包含 68 bp 的 5’ 非编码区 (UTR)和 172 bp 的 3’ 非编码区以及 450bp 的开放阅 读框 (ORF ) , 可编码 149 个氨基酸。 预测分子量为 17.01kDa , 理论等 电点 为 4.89。 序列比对分析表明 PmMPP6 与致倦库蚊 (Culex quinquefasciatus ) 的相似性和同源 性最高。位点分析显示 PmMPP6 无糖基化 位点,但是含有六个磷酸化位点,分别 为 5 个 Ser 位点,1 个 Thr 位点, 没有 Tyr 位 点。 系统树分析显示 PmMPP6 归属于 无脊椎动物大类。 采用实时荧光定量 PCR 技术 (Quantitative real time PCR, QRT-PCR)对三种基 因进行 表达检测的结果可知,cyclinB 的 mRNA 在所检测的卵巢、淋巴、脑、血、 肌肉、心、鳃、肝胰腺和肠 9 种组织中均有 不同程度的表达,在卵巢内的表达量 最高, 淋巴次之, 而在肝胰腺中的表达量最低。 经单因子方差分析, 斑节对虾 cyclinB 基因 mRNA 表达在卵巢中与其他组织存在极显著性差异(P0.01)。cyclinB 的 mRNA 在卵巢发育二至六期中的表达量大致相同, 无显著性差异 (P0.05) 。cdc25 基因 mRNA 在所测的 9 种组织中均有不同程度的 表达,在心脏中的表达量最高, 肌 肉 次 之 , 而 在 鳃 中 的 表 达 量 最 低 。 经 单 因 子 方 差 分 析 , 斑 节 对 虾 cdc25 基因 mRNA 在组织表达中存在显著差异 (P0.05) 。 斑节对虾 cdc25 基因的 mRNA 在? 期卵巢表达量最高, ?期和?期的表达量最低。 在 ?期卵巢中, mRNA 相对表达 量是在 ?期中的 1.6 倍。 经单因子方差分析, 斑节对虾 cdc25 mRNA 在卵巢 发育期 中的表达存在显著 性 差异(P?0.05 ) 。PmMPP6 的 mRNA 在卵巢、淋巴、脑、血、 肌 肉 、 心 、 鳃 、 肝 胰 腺 和 肠 中 均 有 不 同 程 度 的 表 达 , 在 淋 巴 内 的 表 达 量 最 高 , 肌 肉次之, 而在鳃 的表达量最低。 经单因子方差分析,PmMPP6 的 mRNA 在组织表 达中存在显著差异 (P0.05) 。 对卵巢发育 二期至 六期变化检测可知,PmMPP6 的 mRNA 在?期卵巢表 达量最高, ?期的表达 量最低。经单因子方差 分析,斑节对 虾 M 期磷酸蛋白 6 mRNA 在卵巢发育期中的 表达存在显著 性差异(P0.05)。 关键词:斑节对虾, 卵巢发育,激素,基因,克隆,表达II上海海 洋大 学硕 士学 位论 文 Reseach of some hormones and genes being correlation with ovary development from Penaeus monodon ABSTRACT In order to surmount the trouble that the mature phase of the Penaeus monodon female gonad are different under nature environment, it is a important and hot spot to find a new, safe and efficient method for forced ripening via researching breeding mechanism. In this assay, one functional gene correlated with the regulation of ovary development??M-phase phosphoprotein 6 MPP6 was cloned. Its expression mechanism is preliminarily explored, along with two other genes from cyclinB signal path. At the same time, we detected the concentration of four hormones in hemolymph in the stages of ovary development. The study could offer some basic reference for further research about ovary developmentThe techniques of paraffin section and haematoxylin-eosin staining were used to classifying and identifying periods of ovary development in Penaeus monodon, together with techniques of anatomy, cytology and histology. We used ovary development external characteristics and oocytes characteristics as our reasons of judgment. aBiopsy shows that the majority cells are the oogoniums in the stage ?ovary; b. Biopsy shows that most of the cells are chromatin nucleolus oocytes and perinucleolus oocytes in the stage ?ovary; c. Biopsy shows there are a small number of yolky oocytes in the stage ? ovary; d. Biopsy shows that the largest number of cells are yolky oocytes in the stage ? ovary; e. Biopsy shows that the oocytes bestrew with cortical rod oocytes on the edge in the stage ? ovary; f. Biopsy shows that the most of the cells are chromatin nucleolus oocytes and perinucleolus oocytes and some are cortical rod oocytes in the stage ? ovaryThe techniques of Rapid Amplification of cDNA Ends RACE were used to clone the Penaeus monodon M-phase phosphoprotein 6 gene PmMPP6. The full length cDNA of PmMPP6 contained a 5’untranslated region UTR of 68 bp, an ORF of 450 bp encoding a polypeptide of 149 amino acids and a 3’UTR of 172 bp. The estimated molecular mass was 17.01 kDa and the theory isoelectric point was 4.89. Sequence alignment analysis showed that the PmMPP6 and Culex quinquefasciatus shared a high similarity and homologyIII上海海 洋大 学硕 士学 位论 文 The techniques of chemiluminesence immunoassay (CLIA ) were used to detect the concentration and variation tendency of luteinizing hormone LH, follicle-stimulating hormone FSH, progesterone P and estradiol E2 in hemolymph in the stages of Penaeus monodon ovary development. Experiment results show that, the concentration of LH was the highest in vitellus accumulate phage from ? to ?, in ? phage 0.27 mIU/ml and ? phage 0.24 mIU/ml. The concentration of LH was the lowest in ovary mature phage ? 0.10 mIU/ml. The concentration of LH enlarged in recovery phageThe concentration peak of FSH 0.13 IU/ml was in initiation stage ? of ovary development and the density kept down in ovary and reached the minimum in ?phage 0.03 IU/ml. The concentration of FSH also enlarged in recovery phage. The concentration of P sustained development of all six stages and was the peak in ? phage 105.3 pg/ml. The concentration of E2 were virtually identical in all six stages and the peak value 77.0 pg/ml in ? phage was 1.2 times of the least one 68.7 pg/ml in ?phage, which showed a high level in six stages of ovary development, and displayed an alterative higher and lower trend. In conclusion, we conjectured that all of four hormones had an important role in ovary development of the black tiger shrimp Penaeus monodon similar to mammalianThe technique of quantitative real time PCR QRT-PCR was used. For tissues expression profiles, there were 9 tissues which were ovary, lympho, neurosecretory organ in brain, blood, muscle, heart, gill, hepatopancreas and intestine. The quantification result of three genes mRNA in 9 tissues of Penaeus monodon showed that, all the expression was different in different tissues. For ovary development expression profile, ovary tissues from ? phage to ? phage were detecded. The quantification result of cyclinB mRNA were in ovary the highest levels, followed by lympho and in hepatopancreas the lowest levels. The expression of cyclinB was significantly different between ovary and other tissues by means of ANNON P0.01 and was no significantly different in ovary development stages. The quantification result of cdc25 mRNA were in heart the highest levels, followed by muscle and in gill the lowest levelsThe relative expression level of heart was 886 times compared with gill. And the quantification result of cdc25 mRNA were in ? phage the highest levels, and in ? phage and ? phage the lowest levels, with 1.6 times between ? phage and ? phageThe quantification result of PmMPP6 mRNA were in lympho the highest levels, followed by muscle and in gill the lowest levels. The expression of PmMPP6 was significantly different between all of tissues by means of ANNON P0.05. The quantification results of PmMPP6 mRNA were in ? phage the highest levels and in ? IV上海海 洋大 学硕 士学 位论 文 phage the lowest levelsKey words:Penaeus monodon,ovary development,hormone,genes,cloning,expression V上海海 洋大 学硕 士学 位论 文 目 录摘 要 I ABSTRACTIII 引 言 1 第一章 综述. 2 1.1 甲壳动物卵巢发育组织形态学研究2 1.2 甲壳动物卵巢发育神经内分泌调控研究3 1.3 卵母细胞发育成熟的分子调控机制研究3 1.3.1 cyclinB 及其信号传导通路是启动卵母细胞成熟的中心环节 4 1.3.2 cdc25 对cyclinB 信号通路的调节作用 6 1.3.3 MPP6 对M 期转变的作用. 6 第二章 斑节对虾卵巢发育六期解剖和组织学鉴定8 2.1 斑节对虾雌 性生殖系统结构 8 2.1.1 卵巢的解剖结构. 8 2.1.2 卵巢的组织学结构8 2.1.3 卵巢发育各期的结构与组织学特征 8 2.2 常规石蜡切片与 HE 染色10 2.2.1 常规石蜡切片10 2.2.2 HE 染色10 2.3 实验 11 2.3.1 实验动物 11 2.3.2 实验仪器及药品 11 2.4 实验方法 11 2.4.1 实验用虾预处理. 11 2.4.2 组织切片 12 2.5 结果. 13 2.6 讨论. 14 第三章 斑节对虾卵巢发育中血淋巴 FSH、LH 和性类固醇激素的浓度变化 16 3.1 引言. 16 3.2 实验材料 16上海海 洋大 学硕 士学 位论 文 3.2.1 实验动物 16 3.2.2 实验仪器 16 3.3 实验方法 17 3.3.1 实验用虾预处理 17 3.3.2 激素含量测量17 3.4 结果. 17 3.4.1 斑节对虾生殖周期中血淋巴 LH 和FSH 水平变化 17 3.4.2 斑节对虾生殖周期中血淋巴 P 和E2 水平变化18 3.5 讨论. 19 3.5.1 雌性斑节对虾 LH 和FSH 的生殖调控作用 19 3.5.2 雌性斑节对虾生殖周期中激素含量变化与卵巢发育的关系 20 3.5.3 雌性斑节对虾激素间及其与 cyclinB 的拮抗作用21 第四章 斑节对虾M 期磷酸蛋白6 的克隆 22 4.1 引言. 22 4.2 实验材料 22 4.2.1 实验动物 22 4.2.2 主要化学试剂23 4.2.3 试剂和培养基配制. 23 4.2.4 实验菌种 23 4.2.5 实验仪器 23 4.3 实验方法 25 4.3.1 实验材料预处理 25 4.3.2 实验用品预处理 25 4.3.3 斑节对虾卵巢总 RNA 提取. 25 4.3.4 cDNA 第一链的合成 26 4.3.5 反转录 cDNA 质量检测. 26 4.3.6 斑节对虾 M 期磷酸蛋白6 cDNA 的克隆27 4.3.7 PmMPP6 的生物信息学分析. 37 4.4 结果与分析. 37 4.4.1 斑节对虾卵巢样品总 RNA 的提取. 37 4.4.2 反转录质量检测 39 4.4.3 斑节对虾 M 期磷酸蛋白6 cDNA 的生物信息学分析. 39 4.5 讨论. 41上海海 洋大 学硕 士学 位论 文 第五章 斑节对虾cyclinB 、cdc25 以及MPP6 基因的表达分析 43 5.1 引言. 43 5.1.1 荧光定量 RT-PCR 43 5.1.2 cyclinB 、cdc25 和MPP6 的表达研究概况 45 5.2 实验材料 46 5.2.1 实验动物 46 5.2.2 主要化学试剂46 5.2.3 实验仪器 46 5.3 实验方法 46 5.3.1 RNA 的提取和检测46 5.3.2 荧光定量引物. 46 5.3.3 荧光定量反应体系. 47 5.3.4 统计学分析. 48 5.4 结果与分析. 48 5.4.1 斑节对虾 cyclinB 基因mRNA 的表达分析 48 5.4.2 斑节对虾 cdc25 基因mRNA 的表达分析49 5.4.3 斑节对虾 MPP6 基因mRNA 的表达分析 51 5.5 讨论. 52 总结. 54 参考文献 55 附录. 65 致谢. 68上海海 洋大 学硕 士学 位论 文 引 言斑节对虾 (Penaeus monodon ) 隶属甲壳纲 (Crustacea)、 十足目 (Decapoda ) 、 游泳亚目 (Natantia ) 、 对 虾 科 (penaeidae ) 、 对 虾 属 (penaeus), 是 对 虾 属 中 最大 型种 , 广 泛 分 布 于 东 半 球 海域 , 具 有 个 体 大 、 生 长 快 、 产 量 高 、 味 道 鲜 等 优 点 , 适 合 进 行 大 规 模 养 殖 和 大 规 格 虾 的 养 殖 , 深 受 欧 美 消 费 市 场 的 欢 迎 。 近年来,斑 节 对 虾 养 殖 年 产 量 已 过 百 万 吨 , 是 我 国 以及 东 南 亚 地 区 最 重 要 的 海 水 养 殖 种 类 之 一。 近年来,中国水产科学研究院南海水产研究所在 863 等项目的 资助下, 成功 地 突 破 了 斑 节 对 虾 全 人 工 培 育 技 术 难 关 , 建 立 了 全 人 工 繁 育 技 术 体 系 , 并在 实际生产中得到了很好的推广应用。 但 是 , 由 于 在 自 然 条 件 下 斑 节 对 虾 雌 性 性 腺 难 以 大 批 量 集 中 成 熟 用 于 育 苗生 产, 斑 节 对 虾 养 殖 业 发 展 受 到 颇 多 制约。 至 今 剪 眼 柄 法 仍 是 对 虾 人 工 育 苗 生 产 中 促 进 雌 虾 卵 巢 成 熟 和 产 卵 最 为 常 用 和 实 用 的 技 术 。 然 而 , 眼 柄 被 切 除 后 , 卵 巢 失 去 了 相 关 激 素 的 调 控 , 会 持 续 进 行 发 育 成 熟 , 直 至 卵 巢 枯 竭 。 所 以 这 种 方 法 是 破 坏 性 的 , 不 利 于 重 复 使 用 , 甚 至 有 时 还 会 引 起 很 高 的 死 亡 率 , 增 加 了 亲 虾 和 苗 种 培 育 的 成 本 , 不 利 于 斑 节 对 虾 大 规 模 养 殖 的 发 展 。 因此, 虽 然 斑 节 对 虾 全 人 工 培 育 获 得 成 功 , 但 是 由 于 对 斑 节 对 虾 繁 殖 与 成 熟 的 许 多 机 理 不 是 十 分 清 楚 , 尤 其 是 卵巢发育的分子调控机理研究不明,目前仍无一种安全高效便利的催熟方法。 目 前 , 关 于 经 济 甲 壳 动 物 卵 巢 发 育 的 研 究 受 到 人 们 的 关 注 , 世 界 各 海 洋 大国 [1-2,34] 都 积 极 开展 卵 巢发 育 调控 机 理 方面 的 研究 , 尤其 是 对 虾 。 这 些研 究主要包括 三 个 方 面 , 一 方 面 是 对 卵 巢 发 育 各 个 时 期 的 组 织 形 态 学 研 究 ; 另 一 方 面 是 对 卵 巢 发育神经内分泌调控的研究 ; 再一方面是对卵巢发育 过程中分子调控机制的研究。 1上海海 洋大 学硕 士学 位论 文 第 一章 综述1.1 甲壳动物 卵巢发 育 组织形态 学 研究 [5-8] [9] 目前对 甲壳 动物 卵巢 发 育组织 形 态 学的 研究 较 为深入 。 Emilia 等 对斑节 对虾卵巢发育各期的形态特征进行了较为详细的描述, 将斑节对虾卵巢发育分为 6 个期 , 并 认 为 只 要 其 体 外 纳 精 器 的 形 态 已 能 接 纳 纳 精 囊 , 卵 巢 处 于 核 仁 外 周 期 的 雌 虾 即 可 以 受 精 。 此 外 , 卵 巢 处 于 皮 质 帮 期 的 雌 虾 或 者 孵 出 或 者 再 吸 收 卵 , 推 测 [10] 蜕皮周期 可能 改变 初 次成 熟 雌 虾 的 生 殖 活 力 。黄建华等 从 组 织学 角度 重 新 将斑 节对虾卵巢发育的 6 个时期进行了详细的描述 ,并描述了各期卵巢中主要的细胞 特征 如下:?期(卵原细胞期, the oogonia ) 卵巢处于未发育期,卵原细胞 大量增 殖充满中央 卵管; ? 期 (核染色质期, nuclear chromatin period ) 卵巢开始发育 , 中 央卵管中的 卵 原 细 胞 增 殖 活 动 减 弱 , 卵 黄 发 生 前 期 卵 母 细 胞 不 断 向 卵 巢 中 央 和 卵 室内迁移,卵室内充满大量的卵黄发生前期卵母细胞 ; ? 期(周边核仁期, surrounding nucleoli period )卵巢内充满卵黄发生前期和 卵黄发生期的卵母细胞, 同 时 存在 核染 色质 期或核 仁 周期 初级 卵母 细胞 和少量卵 原细 胞 ; ?期( 卵 黄囊 期, yolk sac period )卵巢 处于将成熟期 ,充满外披一层薄的滤泡细胞 的处于卵黄发生 期的卵母细胞, 细胞 质内逐渐充满卵黄颗粒 (Y ) ; ?期 (成熟期, maturation stage ) 卵巢 属 于 成 熟 期 , 充 满 成 熟 的 边 缘 布 满 皮 质 杆 状 体 的 卵 子 , 卵 母 细 胞 卵 黄 粒 继 续 积累, 卵母细胞周边出 现许多皮质棒 (cortical rods, CRs ) , 滤泡细胞继续变薄, 紧 贴 卵 母 细 胞 的 外 缘 ; ? 期卵巢 处于 枯 竭 期 或 恢 复 期 , 与 ? 期 ( 完 全 产 卵 ) 或 ? 期 相似, 不同部位有清晰和暗色区域 部分产卵 , 卵巢中原来处于休止状态的卵母细 [11] 胞 开 始 发育 ,重 复 卵子发 育 成 熟过 程 。Pattira 等 研 究了 班节 对 虾卵子 激 活 过程 中的形态变化 , 并发现斑节对虾精卵结合的关键时 期在产卵后的第 45 秒。 Hathairat [12] 等 关 于 斑 节 对 虾皮 质棒 的 生 理 生 化 作 用 的 研究 发 现 , 皮 质 棒 作 为 卵胶 的 前 体由 不同比例的蛋白质和糖类组成,其分子量大小从 35 kDa 至 230 kDa ,并且 广泛的 糖基化和硫酸盐化 , 其甘露糖残基可能参与调节斑节对虾精子的顶体反应 。 并且, [13] Hathairat 等 通过电镜 和免疫细 胞化学 技术研 究了斑节 对虾卵 子的发 生和皮质棒 的 形 成 , 并 发 现 成 熟 卵 巢 中 分 化 的 雌 性 生 殖 细 胞 依 据 亚 细 胞 结 构 的 变 化 可 以 划 分 为 4 期(Oc1~4), 发育 中卵巢 (Oc1, Oc2, Oc3 ) 的主要特征是在 Oc1 和 Oc2 期核 糖体大量富集且粗面内质网(rough endoplasmic reticulum, RER )膨大,在 Oc3 期 2上海海 洋大 学硕 士学 位论 文 卵黄粒和脂肪体出现; 成熟期卵巢 (Oc4) 的 主要特征是皮质棒的出现 , 并推测斑 节对虾皮质棒可能最初在 Oc2 期粗面内质网- 高尔基体复合体中合成, 然后在 Oc4 期被运输至胞外隐窝 中组装成皮质棒。 1.2 甲壳动物卵 巢 发育神经 内分泌 调 控研究 甲 壳 动 物 卵 巢 发 育 的 内 分 泌 调 控 系 统 研 究 主 要 集 中 在 激 素 调 节 上 。 近 年 来有 关 性 类 固 醇 激 素 在 甲 壳 动 物 体 内 的 含 量 和 作 用 的 研 究 颇 多 。 研 究 发 现 , 甲 壳 动 物 [14,15] 与 脊 椎 动 物 类 似 也 具 有 合 成 类 固 醇 激 素 的 能 力 。 利用 类 固 醇 激 素 体 外 注射亲 体 或 者 体 外 培 养 细 胞 的 研 究 表 明 孕 酮 等 类 固 醇 激 素 对 甲 壳 动 物 的 卵 巢 发 育 和 卵 黄 [16-22] 积累具有不同程度 的促 进作用。 利 用 生 物 监 测 、 色 谱 技 术 和 放 射 免 疫等方法 在 许 多 甲 壳 类 动 物 处 于 不 同 发 育 阶 段 的 大 额 腺 、 血 清 、 卵 巢 、 肝 胰 腺 等 组 织 中 监 [23,24] [25,26] [27] [27] 测到了孕酮 、雌二醇 、促黄体生成激素 和促 卵 泡 生 成 激 素 的存在及 其 在 相 关 组 织 中 的 浓 度 和 变 化 趋势 。 孕 酮 、 雌 二 醇 等 激 素 水 平 在 甲 壳 动 物 卵 巢 发 [28] [29] 育 成 熟过 程中 明 显出 现增 高 趋势 。 黄建 华 等 研 究 自然 海域 捕 获的 不同卵巢发 育阶段的斑节对虾的组织生化成分和内分泌激素变化也证实了这一点。Laufer 等 [30] 研究证实甲 基法尼 醇 (MF ) 与蜘蛛 蟹的繁 殖关系密切 。性腺 抑制 激素(GIH ) [31] [32] 可 能会 阻止 卵 细胞 吸收 卵 黄蛋 白, 而 性腺 刺激 激 素 (GSH ) 对卵黄 蛋白合成 起重要促进作用,并且已经证实甲壳类动物中存在 GSH。对卵黄蛋白合成抑制激 [33] [34] 素(VIH ) 、蜕 皮激素 (MH ) 、卵黄生成 素 (Vg ) 进行了研究, 证实 了 它 们 [35,89] 与卵巢发育和卵子发生也有着密切的关系。 此 外, 多种激素和其受体 间的 作 用 关 系 及 其 细 胞 分 布 区 域 也 得 到 了 研 究 。 但是 目前 对 甲 壳 动 物 繁 育 的 调 控机制尚不 [36] 清楚。 1.3 卵母细胞发 育 成熟的分 子调控 机 制 研究 近 年 来 , 人 们 越 来 越 重 视 卵 母 细 胞 发 育 成 熟 的 分 子 调 控 机 制 , 相 继 在 脊 椎和 [37] [38,39] [40-42] [43] 部 分 无脊 椎 动物 中 开展了 研 究, 如 哺乳 类 、两 栖 类 、鱼类 、海星 以 [44] 45 [46,47] [ ] 及日本沼虾 、 罗氏沼虾 和斑节对 虾 等甲壳 动物。 目前已知 生物 体中 卵 母 细 胞 发育成熟 需要经过 第 一 次 和 第 二 次 减 数 分 裂 , 最 终 发 育 成 具 有 受 精 、 胚 胎 发 育 [48] 能力的生殖细 胞 而完成 成熟 。卵母细胞 成熟 是发育过程中 生殖细胞 正常受精及 早 期 胚 胎 的 发 育 的 必 经 阶 段 。 卵 母 细 胞 成 熟 过 程 包 括 质 成 熟 和 核 成 熟 两 部 分 , 两 49 [ ] 者在体内协调 进行 , 彼此促进和影响,从而完成这一过程。 3上海海 洋大 学硕 士学 位论 文 研 究 表 明 , 卵 巢 发 育 过 程 中 卵 母 细 胞 成 熟 的 调 控 并 不 是 一 个 单 纯 的 级 链 式作 [50] 用, 而是一个非常复杂的多因子调节过程。 其中, 卵母细胞减数分裂过程中存在 三个关键调控点: 第 一 次 减 数 分 裂 前 期 、 第 一 次 减 数 分 裂 中/ 后 期 、 第 二 次 减 数 分 裂中期。 大 多 数 脊 椎 动 物 , 在 胚 胎 期 或 者 出 生 后 不 久 卵 原 细 胞 便 停 止 增 殖 , 进 入 [ ] 49 第 一 次 减 数 分 裂 前 期 , 此 时 称 为 初 级 卵 母 细 胞 。 之后经细线期、偶 线期、粗线 期 发 育 到 双 线 期 。 在 双 线 期 后 期 时 染 色 质 高 度 疏 松 且 外 面 包 裹 着 完 整 的 核 膜 , 故 称此时期 为 核 网 期 (dictyate stage ) , 此 时 的 细 胞 核 又 称 为 生 发 泡 (germ vesicle, GV ) 。 不 同 物 种 的 卵 母 细 胞 将 在 第 一 次 减 数 分 裂 前 期 休 止 数 日 至 数 年 不 等 。 在 此 期间,尽管卵泡不断生长和凋亡,但卵母细胞一直处于 GV 期直至 性成熟 前。性 成熟后,在促性腺激素或其他因子的作用下,这些处于 GV 期的初 级卵母细胞才 逐批恢复减数分裂, 发生生发泡破裂 (germinal vesicle breakdown, GVBD ) ,由 G2 期向 MI 期转变, 并进 一步发育, 排出第一极体, 到第二次减数分裂中期 (M ?) , 成 为 一 个 成 熟 卵 母 细 胞 。 如 果 不 受 精 子 或 其 他 因 素 的 刺 激 , 成 熟 卵 母 细 胞 将维持 在 MII 数小时直到退 化。 因此, 超越 GV 期阻滞 并启动卵母细胞恢复减数分裂 以 发生 G2/M 转变对卵母细胞发育成熟至关重要。 对脊椎动物卵巢发育研究发现,卵母细胞成熟是由 3 种介质直接 调 控完成的 ( 如 图 1-1 所示 ) :促性 腺 激素 (gonadotropin, GSH ) 、 成熟 诱导 激素 (matrution inducing hormone, MIH ) 及成熟启动因子 (maturation Promoting Factor, MPF)。 GSH 从垂体中释放后, 刺激 卵巢卵泡层、 肌层纤维 细胞和卵泡颗粒细胞产生 MIH ,MIH 通过卵母细胞 MIH 受体 和经由抑制 G- 蛋白的信 号传导通路之间复杂的交互作用来 刺激卵母细胞成熟 。MIH 信号通过去磷酸化的 cyclinB 和 cdc25 复 合体诱导 MPF [51] 合成, 激活的 MPF 诱导胚泡破 裂, 最后卵母细胞发育成熟。 而在整个调控过 程 中细胞周期蛋白 B (cyclinB ) 及其相关调控蛋白 cdc25、myt1 、mos 和 plx1 蛋白之 间 的 信 号 调 控 网 络 在 启 动 卵 母 细 胞 成 熟 过 程 中 起 着 关 键 性 的 作 用 。 孕 酮 诱 导 的 cyclinB 及其信号传导 通路是启动卵母细胞成熟的中心环节。 1.3.1 cyclinB 及其信号传导通路是启动卵母细胞成熟的中心环节 卵母细胞的发育与成熟需要细胞内各信号通路的协同调控, 其中, Mos/MAPK cdc2 通路与 plx1/cdc25/cyclinB-P34 通 路 是 孕 酮 诱 导 下 启 动 卵 母 细 胞 成 熟 的 中 心环 节。其中细胞周期蛋白 B 及其相关调控蛋 白 cdc25、myt1 、Mos 和 plx1 蛋白起了 [52] 关键性的作用。 cyclinB (细胞周期蛋 白 B)在 G2 期或 G2/M 转变期发挥着重要的作用。 其作 cdc2 为调节亚基与催化亚基 P34 结 合 , 组成物 种 间 高 度 保 守 的 刺 激 因 子 MPF,即 cdc2 cyclinB-P34 ,在卵母细胞减数分 裂过程中 起中心调控作 用( 如 图 1-2 所示)。 4上海海 洋大 学硕 士学 位论 文 cdc2 MPF 的激活主要依赖 于 cyclinB 蛋白合成、P34 的 14-Thr (苏氨 酸)和 15-Tyr (酩氨酸) 位点发生去 磷酸化 以及 cyclinB 的 磷酸化 。 这个 过程需要 cyclinB 、 cdc25、 myt1 、Mos 和 plx1 等 蛋白的协同调控。研究发现 ,停滞于 GV 期的爪蟾卵母细胞 cdc2 中尽管已含有 Pre-MPF 库(无活性状态 的 cyclinB-P34 复合物) ,但激活 MPF 活性 仍需要 cyclinB 的 参与。 但近来通过反义阻断寡核甘酸技术对猪的卵母细胞研 究发现 ,阻断 cyclinB 蛋白合成并没有阻止 GVBD 发生,只是发生 的时间明显延 [53] 滞。 另外, 一些其他的 激酶如 Mos 蛋白和丝裂原激活蛋白激酶 (mitogen-activated protein kinase, MAPK ) 也能促使 cyclinB 磷酸 化, 而且 MAPK 的活化 对抑制 cyclinB [54] 降解也是非常重要的。 [ ] 图 1-1 脊椎 动物 卵母 细胞 成熟激 素调 控网 络 51 Fig1-1 Schematic diagram showing the hormonal regulation of oocyte maturation in vertebrate5上海海 洋大 学硕 士学 位论 文 [51] 图 1-2 脊椎 动物 中 MPF 激活卵母 细胞 成熟 的 作 用示 意图 Fig1-2 Maturation-promoting factor MPF formation and activation in vertebrate oocyte maturation 1.3.2 cdc25 对cyclinB 信号通路的调节作用 [55] cdc25(cell division cyclin 25 )基因是最初由 Wickramasinghe 等 鉴定 出来 。 [56] [57,58] [59] [60] [61,62] 目前,多种 cdc25 基 因已经在 酵母 、蝇类 、线虫 、大 鼠 、小鼠 、 [63] [64] [65] 爪蟾 、 鸡 和人 类 中被 鉴 别出 来 , 并 研究 了其 表 达与 功能 。 cdc25 的基因产 物 Cdc25 磷酸酶是一种 丝氨酸/ 苏氨酸 (Ser/Thr ) 双特异性酪氨酸激 酶dsPTP,它 cdc2 cdc2 在真核生物细胞中通过 去除 P34 的磷酸基 团而 激活 P34 ,从而 诱导细胞进 入 [66] 有