益母草膏微生物限度检查方法验证试验

益母草膏微生物限度检查方法验证试验 益母草膏微生物限度检查方法验证试验 一、 目的 确认对供试品进行微生物限度检查时，所采用的细菌、霉菌和酵母菌计数方 法和控制菌检查方法是否适合于该药品的微生物限度检查。 二、样品 益母草膏 批号:071201 071202 071203 规格:250g?瓶 生产单位: 三、试验器材 1、培养基 胆盐乳糖培养基、玫瑰红钠琼脂培养基、营养琼脂培养基、营养肉汤培养基、改良马丁培养基、改良马丁琼脂培养基 以上均由北京三药科技开发公司生产提供 2、?TY—2000A型集菌仪、?TY反复使用集菌培养器均由杭州高得医疗器械有限公司及杭州泰林生物技术设备有限公司生产提供。 3、菌种 大肠埃希菌(Escherichia coli) [CMCC(B)44102] 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)[CMCC(B)63501] 金黄色葡萄球菌(Staphy lococcusaureus)[CMCC(B)26003] 白色念珠菌 (Candida albicans)[CMCC(F)98001] 黑曲霉 (Aspcegillus niger)[CMCC(B)98003] 大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌均由中国医学菌种保藏中心提供，黑曲霉菌由中国药品生物制品检定所提供。 四、 菌液制备于检验 1、取上述经35?培养18—24h的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆-7菌的肉汤培养物1ml用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释，金黄色葡萄球菌至10 -8-7、枯草芽孢杆菌10、大肠埃希菌10、约为50~100cfu?ml，做活菌计数备用。 2、取经25?培养18—24h的白色念珠菌肉汤培养物1ml，用0.9%无菌氯化钠-8溶液10倍稀释至10，约为50~100cfu?ml，做活菌计数备用。 3 取经25?培养1周的黑曲霉斜面培养物，加4ml0.9%无菌氯化钠溶液洗下黑曲霉芽孢，吸取出孢子悬液1ml，加0.9%无菌氯化钠溶液适量稀释，用比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相当后，取1ml稀释后的孢子悬液，用0.9%-4，无菌氯化钠溶液10倍稀释至10，约为50~100cfu?ml，做活菌计数备用。 上述各株菌的培养物均为第三代的培养物。 4、菌液的检验 -7-7-8取上述金黄色葡萄球菌10、大肠埃希菌10、枯草芽孢杆菌10稀释液各1ml，分别用45?营养琼脂培养基20 ml注皿，各平行测定2皿，30~35?培养48h，计数，应约为50~100cfu?ml。 -8-4，取上述白色念珠菌10稀释液及黑曲霉10孢子悬液各1ml，分别用45?玫瑰红钠琼脂培养基20 ml注皿，各平行测定2皿，23~28?培养，逐日观察计数，应约为50~100cfu?ml。 五、细菌、霉菌和酵母菌计数方法的验证 照微生物限度检查法(中国药典2005年版一部附录X? C)中计数方法的验证方法进行试验。 供试品制备:取供试品10g，加PH7.0无菌氯化—蛋白胨缓冲液至100ml，制成1:10的供试液。 平皿法: 1、 试验组: 取1:10的供试液分别按1 ml?皿加入平皿后，加入上述50~100cfu 的试验菌，立即倾注中国药典2005年版规定的营养琼脂培养基，置规定的温度培养24~72h逐日观察结果。 2、菌液组:测定每一菌株所加的试验菌数(同四.4菌液检验)。 3、 供试品对照组:除不加菌液外，同试验组测定方法，置规定的温度培养24~72h，逐日观察结果，测定供试品本底菌数。 4、回收率的计算:按如下公式计算试验组的加菌回收率。 试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数 试验组的加菌回收率= ×100% 菌液组的平均菌落数 培养基稀释法: 1、试验组:取1:10的供试液分别按0.5ml?皿、02ml?皿加入平皿后，加入上述50~100cfu的试验菌，立即倾注中国药典2005年版规定的营养琼脂培养基，置规定的温度培养24~72h，逐日观察结果。 2、菌液组:同平皿法。 3、供试品对照组:除不加菌液外，同试验组测定方法，置规定的温度培养24~72h，逐日观察结果。 4、回收率的计算:按如下公式计算试验组的加菌回收率。 试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数 试验组的加菌回收率= ×100% 菌液组的平均菌落数 薄膜过滤法: 1、试验组:取1:10的供试液1 ml加入开放式滤器(滤膜先用冲洗液润湿)中，用200 mlPH7.0无菌氯化—蛋白胨缓冲液缓冲液冲洗，每次100 ml，在最后一次的冲洗液中加入上述50~100cfu的试验菌，冲洗完毕后，滤干，取出滤膜贴于规定的营养琼脂培养基上，置规定的温度培养24~72h，逐日观察结果。 菌液组:除不加样液外，同试验组测定方法，置规定的温度培养24~72h，逐2、 日观察结果。 3、供试品对照组:除不加菌液外，同试验组测定方法，置规定的温度培养24~72h，逐日观察结果。 4、回收率的计算:按如下公式计算试验组的加菌回收率。 试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数 试验组的加菌回收率= ×100% 菌液组的平均菌落数 六、控制菌检验方法的验证 大肠埃希菌:按常规法 1、试验组:取1:10的供试液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基中，加入上述50~100cfu的大肠埃希菌，置35?培养24小时，按相应的控制菌检验方法检查。 2、阴性对照菌:取稀释液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基中，置35?培养24小时，按相应的控制菌检验方法检查。 3、阳性对照组:取上述50~100cfu的大肠埃希菌加入100ml胆盐乳糖培养基 4、供试品组:取1:10的供试液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基中，置35?培养24小时，按相应的控制菌检验方法检查。 5、阴性菌对照组:阴性对照组菌采用金黄色葡萄球菌，方法同试验组，阴性对照组菌不得检出。 七、试验结果 1、试验用菌检查(菌落计数结果平均值，单位:cfu ) 大肠埃希金黄色葡萄球 枯草芽孢杆菌白色念珠菌黑曲霉 -7-7-8-8-4 菌10 菌10 10 10 10 代数 3 3 3 3 3 平皿法 54 72 89 58 63 薄膜过滤法 / / 85 / / 表2、白色念珠菌计数方法的验证(菌落计数结果平均值，单位:cfu ) 样品组 菌液组 试验组 供试品对回收率% 照组 平皿法 1 58 49 0 84 2 50 86 3 47 81 表3、黑曲霉菌计数方法的验证(菌落计数结果平均值，单位:cfu ) 样品组 菌液组 试验组 供试品对回收率% 照组 平皿法 1 63 59 0 94 2 56 89 3 52 83 表4、大肠埃希菌计数方法的验证(菌落计数结果平均值，单位:cfu ) 供试品对样品组 菌液组 试验组 回收率% 照组 1 53 98 平皿法 54 0 2 56 100 3 51 94 表5、金黄色葡萄球菌计数方法的验证(菌落计数结果平均值，单位:cfu ) 样品组 菌液组 试验组 供试品对回收率% 照组 平皿法 1 72 16 0 22 2 12 17 3 18 25 培养基稀1 72 33 0 46 释法2 38 53 0.5ml/皿 3 30 42 培养基稀1 72 57 0 79 释法2 52 72 0.2ml/皿 3 55 76 表6、枯草芽孢杆菌计数方法的验证(菌落计数结果平均值，单位:cfu ) 供试品对样品组 菌液组 试验组 回收率% 照组 1 0 0 平皿法 89 0 2 0 0 3 0 0 1 12 13 培养基稀 释法89 0 2 16 18 0.5ml/皿 3 9 10 1 33 37 培养基稀 释法2 89 37 0 42 0.2ml/皿 3 30 34 1 83 98 薄膜过滤2 85 85 0 100 法 3 83 98 表7、控制菌检查方法的验证结果 试验组 阴性对照组 阳性对照组 供试品组 大肠埃希菌 + - + - 阴性菌对照组中阴性菌未检出。 注:表中“+”表示试验结果检出控制菌;表中“-”表示试验结果未检出控制菌 八、结论 从表2~表6可以看出:细菌、霉菌和酵母菌检查的方法验证试验中，平皿法对大肠埃希菌、白色念珠菌、黑曲霉菌的回收率均高于70%;采用培养基稀释法0.2ml/皿金黄色葡萄球菌回收率均高于70%;采用薄膜过滤法枯草芽孢杆菌回收率均高于70%;从表7可以看出:控制菌大肠埃希菌的检查可采用常规法。 试验结果表明，细菌数可采用薄膜过滤法测定，霉菌和酵母菌可采用平皿法测定，大肠埃希菌的检查可采用常规法。 九、微生物限度检查标准 根据上述结论，提出益母草膏微生物限度检查标准如下: 【检查】 微生物限度 照微生物限度检查法(中国药典2005年版一部附录X? C)检查。取本品10g，加加PH7.0无菌氯化—蛋白胨缓冲液至100ml，制成1:10的供试液。按薄膜过滤法进行细菌数测定，冲洗200 ml/筒(50 ml/次);用平皿法进行霉菌和酵母菌计数;按常规法进行肠埃希菌的检查。结果应符合规定 。