【doc】胎鼠血及新生鼠外周血分次移植对造血干细胞植入影响的实验研究

【doc】胎鼠血及新生鼠外周血分次移植对造血干细胞植入影响的实验研究 胎鼠血及新生鼠外周血分次移植对造血干 细胞植入影响的实验研究 658中华血液学杂志2002年12月第23卷第l2期 ChinJHematol,Deceniber2002.,'0l23,N0.12 胎鼠血及新生鼠外周血分次移植对造血干细胞 植入影响的实验研究 方建培徐宏贵黄绍良魏菁黄文革陈凤英郭芬芬麦惠容 我们拟在建立鼠一鼠同种异体脐血移植动物模型的基础 j:,采用胎鼠血及新生鼠外周血(FNPB)单次或分次移植,观 察移植后免疫和造血重建,试图探讨促进脐血造血f细胞 (rtSC)植入,提高脐血移植(UCBT)效率的新策略,为克服 UCBT存在的问和进一步开发利用提供实验和应用依据. 材料和方法 1动物模型以C57BL/6(H一2")鼠(雌:雄=2:1,8,l2周 龄,体重22,26g,中国科学院上海实验动物中心提供)为供 鼠,BALB/c(H一2)鼠(雌性,清洁级,8,l2周龄,l8,22g,中 山医科大学实验动物中心提供)为受鼠,受鼠以环磷酰胺 (Crx)预处理,剂量380mg/kg,一次性腹腔注射.移植小鼠饲 养于无菌层流室内.饲料,饮用水及垫料均经高压灭菌,不予 预防移植物抗宿主病(GVHD)药物. 2FNPB制备检阴道栓法确定孕期,取孕l8,20d C57BIJ6鼠,颈椎脱臼处死,体积分数为75%的乙醇消毒皮 肤,在超净台内刮宫取出胎鼠,或取生后24h内新生鼠,断头 法吸取外周血于灭菌肝素(50U/m1)抗凝试管中,计数有核细 胞数(Nc),平均每只胎/新生鼠取血40,60,NC(2,6)× l0):用IMDM液分别调整至细胞密度为1.00×l0b,0.250× l0b,0.125×l0b/0.2n1l.分别移人2nd冷冻管中,加等量体积 分数为20%二甲基亚砜置一80?冰箱中保存备用,移植时 于37,40?水中快速融冻后立即回输. 3FNPB的干/祖细胞检测取新鲜FNPB,按本室方法制备 成单个核细胞(MNC)悬液,甲基纤维素半固体培养进行CFU— GM,BFU—E,CFU—GEMM培养,在2n1l培养体系中加入MNC2 ×l,体积分数为5%的c02,37?饱和湿度下培养7d,14d 计数.同时取1×l0bMNC悬液采用双标记流式细胞仪 (BeetonDickinson公司)检测CD34细胞,Sea.1CD34细胞含 量. 4小鼠骨髓于/祖细胞检测在剖宫产取胎鼠的同时,无菌 下取出该孕鼠双侧股骨,按本室方法制成细胞悬液,计数 NC,按上述方法行CEIJ.GM,BFU—E,CFU—GEMM培养和Sea一1 细胞,Sea一1CD34细胞检测. 5移植分组受鼠予CTX注射后24h行随机分组:?一 基金项目:美国中华医学基金会资助项目(96630) 中山医科大学孙逸仙纪念医院儿科 作者单位:510120广州, (方建培,徐宏贵,黄绍良);医学研究中心(魏菁);中山医科大学实验 动物中心(黄文革,陈凤英,郭芬芬);深圳市儿童医院(麦惠容) ? 研究报告? 次移植组:经尾静脉一次性输注融冻的FNPB1×l0b/只;?分 次移植组:分别于化疗后24,48,72,96h输注融冻的FNPB 0.25×l0b/只或0.125×l0b/只,共4次.即输注NC总数分别 为1×l0b和0.5×l0b;?化疗对照组:经尾静脉输注IMDM 0.4ml;此外设空白对照组:不予化疗,仅尾静脉注射IMDM 0.4ml.实验组每批每组20只,空白对照组每批5只,共3 批. 6移植后检测?存活数:计30d,60d存活率;?植入水 平及植人证据:于移植后第11天(+l1d),+17d,+21d用 流式细胞仪检测存活受鼠骨髓H一2D细胞表达;?造血重 建:+11d,+17d,+21d测外周血白细胞,血小板,骨髓Sea一 1细胞,Sea一1CD34细胞含量,并行CFU—GM,CFU—E,CFU— GEMM培养;?免疫重建:+11d,+17d,+21d检测骨髓 CD3,CD.细胞含量;?GVHD:观察移植后小鼠毛色,食欲 及排粪情况,取濒死或存活4,6周小鼠的爪垫皮肤,肝脏, 肠管组织行切片,HE染色,光镜观察组织学改变. 7统计学处理计量资料以i?s表示,采用SPSS10.0统计 软件包处理.多组间比较用随机区组方差及StudentNew— iil~q.nKeals两两组间比较,存活率用检验. 结果 1FNPB与骨髓细胞的生物学特性比较培养7d时.CFU— GM集落产率FNPB低于骨髓细胞,但两组比较差异无显着性 (P>0.05),从集落形态看,FNPB的体积更大些.14d时, FNPB组CFU—GM集落则较骨髓细胞组明显增多(P<0.05). 体积巨大的致密型集落,但骨髓细胞 且FNPB可见含细胞多, 未见有类似集落.7d时BFU—E集落产率,两组比较差异无 显着性(P>0.05).14d时CFU—GEMM集落产率,两组比较 差异有显着性(P<0.05)(表1).流式细胞术检测CD34细 胞(即造血干/祖细胞)在FNPB与骨髓中分别为(5.25? 2.71)%和(8.24?2.41)%,差异无显着性(P>0.05),但从 CDa_1细胞亚群(即造血于细胞)看,前者[(3.63? 1.13)%]明显高于后者[(1.41?0.87)%],P<0.01. 2FNPB分次移植对小鼠存活率的影响化疗组小鼠于注 射后30d内全部死亡,1周内死亡占80%,生存时间(11.5? 3.50)dPB移植明显提高小鼠的存活率,分次移植0.5× l0c'FNPB组的20只小鼠,30d和60d存活率与单次移植l× l0b组近(P均>0.05),但明显低于分次移植1×l0b组(与 前两组比较,P均<0.05).见图1. 中华血液学杂志2002年l2月第23卷第l2期ChinJHen~— tol,December200— 2,Vol23,No.12 表1新生鼠外周血(FNPB)与骨髓造血干/祖细胞培养 (/105MNC)及表型检测(%,x?) 注:样本数均为l0,与骨髓组比较,#P>0.05;*P(0,05. CFU—GM和CFU—GEMM为培养14d结果,BFU—E为培养7d结果 7l02l:{0:{4Zq956b0 存活时问(d) - X--次移}『』1×1组一分次移植0.5×1O组 ?分次移植l×l0n组化疗组,向埘照组 图I移植后各组小鼠生存曲线 3FNPB分次移植对植入水平的影响以检测H一2D?细胞 百分率作为植活指标,结果IXl分次移植组和一次移植组 H-2Db细胞分别为(53.46?7.71)%和(27.94?I.95)%,两 者差异有显着性. 4FNPB分次移植对造血及免疫重建的影响移植后wBc 回升,IXl分次移植组快于单次移植组,前者于+21d基 本达正常.血小板恢复较慢,至+21d,各组仍较低,但分次 移植组已显着高于单次移植组(P<0.05).CD34Sca一1细 胞代表造血干细胞,CFUGM,BFU—E,CFU—GEMM集落数反映 造血祖细胞,其恢复速度,单次移植1Xl组与分次移植 0.5×l组相近,但均慢于分次移植1×106组(表2). 移植后各组免疫恢复相对较慢,但与单次移植1Xl组 比较,分次移植1Xl组CD3细胞和CD.细胞恢复明显 增快(P<0.O1),但与分次移植0.5Xl组相比,差异无显着 性(P>0.05)(表3). 5FNPB分次移植对GYTID的影响移植后各实验组小鼠 未见明显脱毛,腹泻,皮疹,出血等典型GVHD表现.病理检 查仅单次移植1Xl组肝脏见轻度淋巴细胞浸润,皮肤爪垫 及肠管亦未见异常. 659 表3分次移植对免疫功能恢复的影响(%,x?) 注:样本数均为5,与正常对照组比较,*P<0.05;与单次移植 组比较,?P<0.O1 讨论 我们选择了遗传背景较清楚的C57BId6(H一2)一BAl,c (H一2)同种异体脐血移植模型.我们首先对FNPB的移植生 物学特性进行探讨,结果显示FNPB中cSc.d-1造血干细 胞亚群明显高于骨髓,从体外培养结果看,FNPB培养7d的 CFU-GM,BFU,E产率接近或略高于骨髓,各类集落体积多大 于骨髓集落,说明FNPB含丰富较早期的造血干/祖细胞,且 具有更高的增殖潜能.这与人脐血较成人骨髓富含更原始 造血干/祖细胞,细胞增殖分化潜能强的结论相一致.FNPB 移植模型研究结果表明C57BId6鼠FNPB造血干细胞在 BALB/c成年鼠体内植入,并增殖分化,重建受体部分造血和 免疫功能,提高存活率. 本实验结果还显示,降低一倍或相同移植细胞数时分次 移植组GVHD发生率和严重程度较单次移植组无明显增加, 低于文献报道该小鼠模型骨髓移植的GVHD. 以上研究表明,鼠一鼠脐血移植模型为非血缘}{】不相 合UCBT的体内研究提供了一种良好途径.分次移植充分利 用有限数量的FNPB和化疗预处理后腾出的龛位,减少干细 胞体内"丢失",促进其植入,降低移植所需细胞数,这为解决 临床单份UCB细胞数量少和成人骨髓植入率低,增加UCB 人群,使更多患者受益提供了一条新策略. 参考文献 1ScavadaouA,IsolaL,RubinsteinP,eta1.Amttrinemodelforhuman cordbloodtransplantation:near-termfetalandneonatalperipheralblood ceilscanachieVelong-termbonemal'13owengraftmentinsublethaUyirradi— aedadultrecipients.Blood,1997,89:1089—1099. 2黄绍良,周敦华,李树浓,等.HGFs联合对体外人脐血造血干细胞 及SCID小鼠体内扩增作用的研究.临床儿科杂志,1998,16:258 259. 表2各移植组小鼠移植后21d外周血白细胞,血小板,造血细胞集落生长及表面标记检测结果(?) 注:样本数均为5,与正常对照组比较,*P<O.05.#P<O.O1;与单次移植组比较,?P<0.O1 (收稿日期:2001—12—12) (校对:董文革) ?????O