甘蔗糖蜜发酵培养高铁营养酵母的菌种诱变选育_cropped

甘蔗糖蜜发酵培养高铁营养酵母的菌种诱变选育_cropped 50 甘蔗糖蜜发酵培养 高铁营养酵母的菌种诱变选育 , , , 121211*何海燕 覃拥灵 李楠 梁智群 , , , 广西大学生命科学与技术学院广西 南宁 河池学院化学与生命科学系广西 宜州 ( 1., 530004; 2.,546300) 摘要经过抗性筛选和摇瓶发酵培养从 株酵母菌中筛选到一株能以甘蔗糖蜜为碳源的生物量较高及富铁能: , 25 60力较强的菌株辐射诱变选育出一株正突变菌株利用在同等发酵条件下生物量达到R4- 5。Co, R4- 5- 27, , 10.25 mg/L, 铁含量 倍连续 次传代其产量性状无大变化表明该 总铁含量为 比出发菌株提高了 7.43 mg/g, 76.16 mg/L, 1.59 。10 , , 菌株遗传性状稳定极有潜力改良为工业化生产菌种, 。 60关键词高铁营养酵母甘蔗糖蜜诱变筛选: ; ; Co ; SCREENING AND FERMENTING CULTIVATION OF IRON- ENRICHED YEAST WITH SUGARCANE MOLASSES 1, 21, 211, *HE Hai- yan, QIN Yong- ling, LI Nan, LIANG Zhi- Qun (1. College of Life Science and Technology, Guangxi University, Nanning 530004, Guangxi, China; 2. Departerment of Chemistry and Life Science,Hechi University,Yizhou 546300,Guangxi, China) Abstr act: A high - biomass, iron - enriched yeast strain R4 - 5 was obtained after gradual screening and 60fermenting through 25 yeast strain, treated it with Co mutation ,then got a positive mutation yeast strain R4- 5- 27 that contain more biomass and iron,and this yeast strain can used sugarcane molasses as the culture medium.In the same measure , the biomass was 10.25 mg/L, iron content of the yeast cell was 7.43 mg/g.The total iron content was 76.16 mg/L, 159 % higher than R4- 5,and the results of generation experiment show that it is a stabilization and choiceness yeast strain of high biomass and iron. 60Key wor ds: iron- enriched yeast; sugarcane molasses ; Co mutation ;screening 铁是人和动物生命活动中不可缺少的微量元甘蔗糖蜜是甘蔗制糖的主要副产物总糖分在 , 素如果机体内缺乏微量元素会导致一系列病症的 左右且含有维生素及微量元素等多种可利用 , ,50 %, [1,2][6]出现对健康造成极大的损害饮食 成分是发酵生产酵母的良好原料中国的甘蔗种 有研究证实,。,,。中微量元素的吸收与其化学状态有关无机态的微 植业发展较快甘蔗糖蜜原料充足价格低廉是一 , , , , [3,4]种重要的经济资源国内未见有甘蔗糖蜜生产富铁 量元素不易被人体吸收并有一定的毒性酵母细 。,。 酵母的研究报道作者开展了以甘蔗糖蜜为碳源发 胞结构简单营养要求不高繁殖快而且组成细胞 , , , , 60酵培养高铁营养酵母的实验研究利用 辐射对 壁的多糖具有亲和二价阳离子的特点可将无机态 。Co , 微量元素铁富集成为易被机体吸收的有机态的微量 初筛酵母菌株进行了诱变处理提高了筛选得到的 , [4]元素是理想的微量元素载体富铁酵母是目前有 菌株的生物量及富铁能力为后续发酵工艺研究提 , 。, [5]供了优良菌种为开发新型补铁剂增加糖蜜的附加 机铁营养剂研制与开发的主要形式, 、。 值提供了新的思路。 作者简介何海燕汉讲师硕士研究生主要从事应用女: ( 1972-) , (),, , 微生物学研究 。 通讯作者* 与方法1 培养 板从较高铁浓度平板中选取大而圆材料, 28 ?48 h, 1.1 的菌落进行摇瓶复筛收集菌体测其总铁含量重复菌种 , , 1.1.1 次取其平均值选出一株总铁含量最高的菌株3 , , 。 产 朊 假 丝 酵 母( 购 自 中 国 普 通Candida utilis) : 微生物菌种保藏管理中心共 株编号为 菌株耐铁驯化,1 , C1; 1.2.3 为了进一步提高酵母菌株耐受铁与富集铁的能 粘红酵母 本实验室保存(Rhodotorula glutinis) : 力获得高产稳产的富铁酵母菌株进行了驯化培, , 共 株编号依次为 14 , R1?R14; 啤酒酵母 养 涂布 本实验室菌株分离纯化后按常规方法制备菌悬液(:Saccharomyces cerevisiae) : ?保存共 株编号依次为 的平板选取大而圆于铁离子起始浓度为 10 , S1?S10。 0.06 % ? 培养材料菌落摇瓶发酵收集菌体测定生物量和铁含量选 1.1.2 ??[7]麦芽汁购买啤酒厂麦芽参照文献处理配制: , ; 指标最高的菌株制备菌悬液涂布于铁离子浓度按 [8]糖蜜广西南宁糖业公司明阳糖厂提供按文献进 : , 逐级递增至 的平板每一步都选取生0.02 %0.2 %, 行预处理。 逐步提高菌株物量和铁含量最高的菌株进行驯化 , 耐铁能力。 仪器1.1.3 60诱变实验1.2.4 Co 高速冷冻离心机美国 BACKMANJ2-21 (Back- 60诱变致死率曲线1.2.4.1 Co 公司型电子天平上海精科实业有限man ); YP1200 ( 上海跃进医疗仪器 公司 无菌生理盐水转入驯化活化的斜面菌将型生化培养箱) ;10 mL SPX- 250 ( 种洗下菌种倒入装有玻璃珠的三角瓶中, , 180 r/min 厂柜式恒温冷冻摇床中国科学院武汉) ; HQL300A ( 科学仪器厂电热恒温鼓风干燥箱上海); 101- 2- BS ( 利用无菌生理盐水调整培养制成单细胞悬液24 h, 8 个菌悬液浓度为分装于小玻璃管中分别跃进医疗器械厂糖用锤度计 浙江余桃仪表二10/mL, , ); ( 60用 万 居 里 的 射 线 辐 照 5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9 Co 公 司厂320 pH Meter (Mettler toledo ); UV- 1601 ) ; 诱变按常规方法稀释浓度梯度涂布筛选平板根据 。, 紫外分光光度计日本 公司(SHIMADZU )。 60平板上生长的菌落数与未经射线辐射的培养平 Co 培养基1.1.4 板菌落数对比计算致死率绘制致死曲线图, , 。 麦芽汁斜面培养基麦芽汁琼脂:10 ?Bx , 2 %。 酵母菌株诱变突变株筛选种子培养基糖蜜硫酸铵 磷酸二:10 ?Bx , 0.1 %, 1.2.4.2 根据致死率曲线以致死率达 以上的诱变氢钾 七水硫酸镁 硫酸亚铁 , 90 % , , ,0.1 %0.04 %0.06 % pH5。 剂量处理菌悬液 辐射后涂布于不同铁离子浓度的, 摇瓶发酵培养基同液体种子培养基: , pH5.5。 筛选平板培养 后从高铁浓度平板上挑选, 28 ?3 d 大而圆的菌落进行摇瓶复筛接种量 装液量, 10 %, 平板筛选培养基糖蜜硫酸铵磷: 10 ?Bx, 0.1 %, 三角瓶培养 , , 酸二氢钾100 mL/500 mL 28 ?180 r/min 48 h,七水硫酸镁琼脂按 0.1 %, 0.04 %, 2 %, 发酵液离心收集菌体测其总铁含量, 。 浓度递增的硫酸亚铁溶液0.02 %( 0.04 %,0.2 %) 。 遗传稳定性实验方法1.2 1.2.4.3 菌种初筛 将筛选到的菌株接种于麦芽汁培养基上传代 ,1.2.1 共传代相同条件下发酵培养测定铁含量和生物 10 , , 无菌条件下将保藏菌种转接至麦芽汁斜面培养量检测诱变得到的高富铁酵母菌株的遗传稳定性, 。 基培养 活化菌种将活化的斜面菌种制 , 28 ?48 h ; 成菌悬液按常规方法稀释涂平板选取大而圆的菌 , , 总铁含量的测定分析方法1.2.5 落接种于种子培养基培养 制 , 28 ?, 180 r/min 24 h 生物量测定 1.2.5.1 成种子液 按 接种量装液量 , 10 %, 100 mL/500 mL 菌种发酵培养发酵液 离心时间 , 6 000 r/min 15 三角瓶摇瓶发酵培养 收集菌, 28 ?, 180 r/min 48 h, 次收集菌体烘干至恒重 蒸馏水洗涤 , , , ,min3 80 ? 称量并记录数值。 体测其生物量和铁含量 选取总铁含量高的菌株进, 行复筛。 铁含量测定1.2.5.2 准确称取 干燥菌体于三角瓶菌体消化菌种复筛: 0.5 g 1.2.2 从初筛菌株中选取总铁含量较高的菌株制成菌 , 中加入 浓硫酸浸泡 置于 水浴 , 10 mL 10 min, 90 ?悬液后适当稀释涂布于含不同铁离子浓度的筛选平 锅中缓慢消化至黑色粘稠状 然后滴加双氧水至溶 52 表 酵母菌驯化前后的生物量和铁含量2 液透明保温 用蒸馏水定容至 , 90 ?30 min, 25 mL [9]Tab le 2 The biom a ss a nd ir on cont ent cont r a st a ft er dom est ica iont 具塞刻度试管中备用。 [10] 参照文献采用硫氰酸钾法进行铁标准曲线绘 菌株生物量铁含量总铁含量(g/L) ( mg/g) ( mg/L) 制及铁含量测定。 Strain Biomass Iron content Total iron content 驯化前 Originastl rain 7.17 4.50 32.27 计算1.2.5.3 驯化后 Domesticst rain 8.78 5.45 47.85 细胞总铁含量细胞生物量细胞铁(mg/L)=(g/L)× 60含量(mg/g) 诱变的致死率曲线2.3 Co 60随着 辐射剂量的增大平板上的菌落数逐 Co , 渐减少即致死率逐渐增大当照射剂量为 万居里 , 。8 结果及分析2 时致死率达 结果见图 根据诱变机理对, 95 %, 1。, 初筛和复筛 通过初筛和复筛获得九株铁含量2.1 及生物量均较 诱变史短的野生低产菌株或想较大幅度提高菌株, 的产量要求筛选到具有特殊性状的菌株可用强烈 高的酵母菌株结果见表 , , , 1。 的诱变剂和较高的剂量处理 使其基因重排后产生, 表 菌株的生物量和铁含量比较1 较大的变异 容易出现新特性或产量有突破性提高,Table 1 The biomass and ir on content contr ast [11] 的变异菌株的 万居里的辐选用致死率为 , 95 %8 菌株生物量铁含量总铁含量(g/L) ( mg/g) mg/L) ( 射剂量为下一步实验诱变辐射剂量。 Biomass(g/L) Iron conten(t mg/g) Total iron conten(t mg/L) Strain 100 5.26 2.55 13.41 C1- 2 90 )C1- 8 5.36 1.98 10.61 80% ) 70( e C1- 14 5.62 2.10 11.80 % t a 60 ( r率 y R2- 8 6.92 4.37 30.24 50 t i l死 40a R4- 5 7.17 4.50 32.27 致 t 30 h eR12- 15 5.90 4.23 24.96 L 20 10 S5- 11 8.64 1.53 13.22 0 S7- 3 8.02 1.46 11.71 5 6 7 8 9 10 S7- 6 8.40 1.36 11.42 辐射剂量万居里 ( ) Radiation dose( myriad curie) 60图 1 Co 诱变致死率曲线 不同菌株的生物量及富铁量从表 中可看出1 , 60Fig.1 The figur e of lethality r ate after Co mutant 均不相同有的菌株生物量高而富铁能力不强有的,; 60 诱变突变株筛选综合考虑相菌株生物量低却具有较强的富铁能力2.4 Co , 实验表明对比诱变前菌株 诱变后菌株 : R4- 5, 同体积发酵液所收获的细胞生物量和细胞铁含量即的生物量和铁含量的变化各不相同因而总铁含量 , 总铁含量的大小选择总铁含量最高的粘红酵母菌 , 也各不相同有些菌株生物量增加铁含量却降低有 : ; 株 作为进一步驯化的出发菌株R4- 5 。 些菌株生物量减少了铁含量却有较大提高从中筛。 菌株的驯化2.2 实验显示 较低的铁离子浓度有利于细胞的生,60表 诱变菌株生物量和铁含量的比较3 Co 长却影响铁的富集量较高铁离子浓度培养基菌株 , , The biomass and ir on content contr ast of mutant str ains Table 3 的含铁量有所增加而生物量却降低了 当铁离子浓, 菌株生物量铁含量总铁含量 度达 之后随着浓度的增加铁含量和生物0.16 % , , Strain Biomass(g/L )Iron content( mg/g) Total iron content (mg/L) 量均呈递减的趋势 说明过高的铁浓度对酵母菌株,R4- 5- 12 7.42 4.78 35.48 的生长和富铁能力均有抑制作用R4- 5- 18 8.53 5.15 43.93 。 通过驯化菌株 较驯化前更能适应较高 , R4- 5 R4- 5- 26 6.89 3.22 22.19 的铁离子浓度富铁能力也得到提高驯化后的菌株, , R4- 5- 27 10.25 7.43 76.16 R4- 5- 38 9.43 6.34 59.79 再回复常规培养基培养 生物量和细胞铁含量均有,R4- 5- 40 8.78 5.64 49.52 所提高其中总铁含量提高了 倍实验结果见, 1.48 , R4- 5- 41 10.22 6.77 69.19 表 2。 R4- 5- 52 8.90 6.92 61.59 选到一株总铁含量最高的正突变菌株编号为 甘蔗糖蜜含有丰富的糖分氮源无机盐及维生, R4- 、、 素等且甘蔗糖蜜的成本较低可作为微生物发酵生 结果见表 , , 5- 27, 3。 产富铁酵母的培养基原料提高甘蔗糖厂制糖副产 通过对比实验可知突变菌株 的生物 , , R4- 5- 27 物的附加值量提高了 倍铁含量提高了 倍总铁含量 。 1.17 , 1.36 , 为 提高了 倍富铁能 比菌株 76.16 mg/L, R4- 5 1.59 , 寻找新的菌种资源筛选出耐铁离子和富铁能力 , 力有了较大提高结果见表 , 4。 强的酵母菌株是生产富铁酵母的关键本实验以 , 。 60甘蔗糖蜜为碳源通过筛选得到耐铁离子的富铁能 , 表 诱变前后菌株 的生物量和铁含量的对比4 Co R4- 5- 27 力强的菌株 驯化后菌株 的生物量及富铁 R4- 5,R4- 5 Table 4 The biomass and ir on content contr ast 60量均有所提高经过 诱变处理后筛选出正突 ; Co , of the R4- 5- 27 yeast str ain 变 酵母菌株其总铁含量为 R4- 5- 27 , 76.16 mg/L, 菌株生物量铁含量总铁含量(g/L) ( mg/g) ( mg/L) Strain Biomass Iron content Total iron content 比诱变前菌株 提高了 倍具有较好的遗R4- 5 1.59 , 诱变前 OriginaSl train 8.78 5.45 47.85 60传稳定性实验结果表明酵母菌株对 辐射比。, Co 诱变后 MutantS train 10.25 7.43 76.16 60 较敏感可以用 诱变技术对富铁酵母菌株进行 , Co 选育提高菌株生物量及富铁能力, 。 遗传稳定实验2.5 往后研究重点应该放在糖蜜发酵生产富铁营养 菌株 传代 次其生物量铁含量基 R4- 5- 27 10 , 、 本稳定总含铁量基本稳定在 左右这 , 76.16 mg/L 。 酵母培养条件的优化 菌种的分子定向改造以适应,60表明经过 辐射诱变后菌株的基因发 R4- 5- 27 Co , 高糖蜜浓度的生产提高糖蜜的利用率微生物发 , 。生了突变生物量铁含量得到提高有较好的遗传 , 、, 酵生产富铁酵母将为糖厂副产物的深加工综合利用 稳定性如表 所示, 5 。 提供一个很好发展前景。 表 的传代实验结果5 R4- 5- 27 参考文献 :Table 5 The r esults of gener ation exper iments 李卫平秦翠霞富铁牛乳的研究与开发食品科技[1] , .[J]., 2002, 130 传代次数生物量 (g/L) 铁含量( mg/g) 总铁含量( mg/L) (8): 48,50. 何崇维生素和微量元素的科学应用上海上海中医药大学 .[M].: [2] Generation Biomass Iron content Total iron content 出版社, 2003: 199,201. 0 10.25 7.43 76.16 Gaudreau H, Tompkins TA, Champagne CP.The distribution of iron [3] 1 10.52 7.45 78.37 in iron- enriched cells of Saccharomyces cerevisiae.Acta Alimentaria, 2 10.11 7.32 74.01 2001, 30:355,361. 3 10.39 7.40 76.89 Yamaguchi - Iwai Y,Dancis A and Klausner RD. 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