转化生长因子β1壳聚糖缓释膜的盖髓研究 硕士论文

转化生长因子β1壳聚糖缓释膜的盖髓研究 硕士论文 第四军医大学 硕士学位论文转化生长因子βlt1gt壳聚糖缓释膜的盖髓研究 姓名:李芳 申请学位级别:硕士 专业:口腔临床医学(口腔内科学) 指导教师:赵守亮 20060501 ,,,,,, 独创性声明 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本八声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究瞳果。尽我所知，除了文中特别加以标注棚致谢的地方,,，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，不包含本八或他人已申请学位或其他用选使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所馓的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 申请学位论文与资料若有不宴之处，本人承担一切相关责任: 论文作吉签名 妨日期:』一监 保护知识产权声明 本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即:研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产积单位属第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工,乍成果时署名单垃仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的全部或部分内容(含屯子版，保密内容除,,)，可以采用影印，缩印或其他复制手段保存论文。学校有权允许论文被查阅和借同，并在较困阿上提供论文内容的浏览和下载服务。 论文作吉签各:扯导师签名:苎弛日期:,二:』业 第霆军鼹太学硬士学位论文 缩略语表缩略语 英文全称 中文仝称,,,(, ,,,,,,燃睡,,,谢,瓤,,,, 转化生长缀子,,,, ,,,, ,,,,,,,,,,,,; ,,,,,,, 骨形成撩白，,, ，,,,,,,—,,,,伊,,,,, ,,;,,, 胰岛索样生长因子,,, ,,,,,,,捻,撼,,, ,,,,,, 磷酸缓冲滚,,,, ,,,,,,;,?, ,,,,矗,, ,,,,, ,,,,,, ,,,,培养液,,, ,,,,, ;,,, ,,,啪 胎牛血清,,,, ,,,,,,,,,,,,,,,敞阻,,;,,,; ,;辽 乙二胺骥艺鼗,,,,, ,，,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,,,彬 酶,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,;,,撼,, ,,,,洳,璩,,尬,;,,,,,,, ,,,,,,,,以,,,,,, ,,,,呶,沁,,,,,, ,,,,,, ,,,, ,,,,,,,珏,, 珏,蛔撼,,; ,谗,,,,,,, ,,,,搀,, 第四军医大学硕士学位论文 转化生长因子,。壳聚糖缓释膜的盖髓研究 硕士研究生:李芳 导 师:赵守亮教授(主任医师) 第四军医大学口腔医院牙体牙髓病科，西安,,,,,, 中文摘要 牙髓牙本质复合体损伤后的修复有赖于第三期牙本质的形成，以恢复牙髓牙本质界正常的组织连接。近年来研究发现，转化生长因子, ,可以促进第三期牙本质的形成，是牙髓损伤修复过程中重要的调节因子，但其半衰期短，游离态易失活，限制了对它的应用研究。本实验利用药剂学的缓释技术将,,,(, ,制成壳聚糖微球缓释系统。将其载入至壳聚糖多孔膜，形成三维的缓释体系，探索生物因子盖髓的途径。(,)制备转化生长因子, ,壳聚糖微球，并研究其体外缓释效果。(,)制备,,,(, ,壳聚糖缓释膜，并研究其对小鼠成牙本质细胞(,,，,,;(,,)生长和增殖的影响。(,),,,(, ,壳聚糖缓释膜进行狗牙的直接盖髓动物实验研究。 方法:(,)采用乳化交联的方法制备壳聚糖微球，然后吸附,,,(, ,获得,,,(, ,壳聚糖微球。利用酶联免疫吸附的方法?,，,,)动态检测,日内,,,邛,壳聚糖微球的缓释效果，并绘制释放曲线。(,)采用自然干燥法和冷冻干燥法制备壳聚糖不对称膜，复合,,,(,，壳聚糖微球，得到,,,。, ,壳聚糖缓释膜，利用扫描电镜进行形态 学观察。,,,(, ,壳聚糖缓释膜与小鼠成牙本质细胞(,,,;(,,)共培养，,日后扫描电镜观察细胞在材料上的黏附、生长，并绘制,日内的细胞生长曲线。(,)狗牙机械性露髓后，分别以,,,(, ,壳聚糖缓释膜、空白壳聚糖膜、氢氧化钙作为盖髓剂并设置对照组，术后,,天、,,天处死动物， 第四军朦大学硕士学位论文 ,,,,,, ;,,,,,,, ,,,,,,,, ;,,,,,,,,, ,,,,,, ,,,,,, ,,,,,,,,,; ,,;,,,,,,托,:, ,,,,油,,,,,,,,,,协曲,,,;, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,, ,,,姒,,,, ,,,, ,,,,?,,,,:,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,龃, ,,;,,,删, ,酬,拄,，,,,,,,,,,影?单,烈， ,,,,,, ,,,嘶,,,,;,, ,,,,,,咄 )矗?,, ,,?,,(,?, ,,,,,,;,,,,,;,,,,,:,,, ,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,,,,,,,,, ;,,,,,, ,:,协, ,,,,,, ,,,,,,, ,,,,穗,搿,,,矗建,,。,,,,, ,, ,,;,,,,畦键,, ,,瑚薤,,,,豫?蟠,,娃, ,重氇嚣弘,,，,髑,速,,,,,, ，, ,,, ,,,, ,,,,,,踟,,, ,,,,,,,,,,,,铲,、玑, ,,;,,,,,,,,,(,,,,,,),,,,,,，, ,,,,,,,, ,,, ,,,,, , ,,,,虹,, ,,,, ,, ,圭,,, ,,,;,,,，,圣,,;, ,,,,,,,,氇, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,把,,,,, ,, , ,,,,,,,,, ,,,蹴,, ,,, , ,,;;,,,,,王呈,,,,,,嘲,,,,,, ,,,咖,,,(，,也,, ,,,,,?,, ,,,,,,,础(,),, ,,,,,,, ,,,,,,仃,; ,,,,，,,;毯,,,,琏,,越,,,鞋,,遮,,擞,,懿童重触镩强覃,漤一圣,,,,霾,,凛,毫,,瑟糙,,站,嫡,怼,(,,,,,,,)，(,),, ,,,,,,,, ,,,, ,施;, ,, ,,,,,,,, ,,,?,, ,,廿,, ,,,,,,,枷,,,哦,,,,越,, ,,,,,,,,,,, ;,,,嚣,, ,艟,之, ,,鞠,, ,锄,国?,，(,),, ,,,,,,,,鑫,,,,, ,,,,,,,,,,,; ,,侥;, ,, ,,, ,,,,,,,, ,, ,,,,;, ,,,, ;,,,,,,, ,,,,,,,, ,,礤,;;,觚,;,,,, ,,,,,,, ,,,,, ,, ,,,瑚,,,,, ,武;撕,, ,,,,(,,,,,,,:(,);挞,,,,,斑;,,,,,,,;, ,,,, ,,,,,;,, ,, ,, ,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,，晰(【,, ,,,,,,,,,,,,缸, ,,,, ,, ,,,,,,,,,,(,,, ;,,,,,,,,, ,,,,,,, ,,,,,一氟韪, ,,,,毽糙,磅髓翠建,—,,瞌,, ,煳强,,,,,,,, ,,,,,鬈,,,,)，档 , 第四军臌太学硕士擘位论文 前言 转化生长因子, ,砸,,,,,“蝣,, ,,,吼, ,砬,,卜, ,，,,,一?,)属予下,,一?细胞趿子超家族，具肖广泛丽多样的生物学作用，对细胞的生长和分化、胚胎发育、组织修复及免疫反应等都具有调节作用。在牙髓生物学领域，,,,(, ,作为爱髓的损伤修复过程中豹重要调节因子，可诱导第三期牙本质戆形成，懑应用于生物因子 盖髓的研究。但是作为一种擞物因子，,,,(, ，的半衰期短(游褰羧态象炎活，糖臻霹操俸牲较差，残受遴一步瘟蠲骚突熬簸颈。瑟瑷嚣瓣生物因子盖髓的主要研究方向是载体的选择和因子活性的调节。 壳聚耱为凡丁璇部分麓己醮基静衍皇穆，学名为(,，,)(,(乙酰胺艺，?国(麓聚糖，主要来源于节肢动物的外骨游中。其具有良好的生物相容性和生物可降解性，在体内可被溶菌酶等酶解成低聚糖，降解产物能被生物体完全吸收。还有广谱抗慧、抗感染和很强豹凝盘终用，姥步,还其肖促进伤口愈合、谖节懿脂和降低胆固醇、增强免疫和抗肿瘤等多种生理活性作用。壳聚糖的无抗原性对诱等缨魏攮蹙帮最终挺进壤入傣与密主錾织一体纯其毒重黉意义。蒺予麦聚糖来源丰富、制备简单和生物性能良好，已将其应用于生物隈学领域。特别烧近年来，褥壳聚耱瘦耩予蕴鳜工程支架耪褡、药物缓释系统霸基因浓疗载体方嚣显看专出了巨大的前景。 本谋联尝试利厢药剂带的缓释技术将粥,(?,制成壳聚糖微球缓释系统。将其载入至壳聚糖多孔膜，形成三缎的缓黟体系，揲索生物因子盖髓豹新途径。本课题的完成，将更加明确,,,(, ,在第三期牙举质形成中的作用，为,，啦用鼹,一?,等岁,添毪黛物因予透孬溪髓保存浚疗奠定蒸秘。 本文由以下部分组成:一、转鼗生长嚣予彝,壳聚糖微球戆臻,备及瞧能磅究 , 第四军麟大学硕士学位论文 采用乳化交联的方法翻备壳聚糖微球，然后吸附,,,,?,获得,,,一?,壳聚糖微球。研究其物理性质(形态、包封率、载药率、膨胀率)，并采用酶联免疫吸附法动态检测,?,,(, ,壳聚糖微球的缓释效粜，绘制释放曲线。二、转化生长因子?,麦聚糖缓驿袋豹素《备及对小裁成矛本质细胞增殖的影响 利用自然干燥和冷冻干燥法制备不对称的壳聚糖膜，,,,—, ,壳聚糖微球复合子不黪稼簇懿多孑,器，褥妥稻,(?,炎聚藉缓释貘。搦撵毫镜溪察空盘膜材料和,,,。, ，壳聚糖缓释膜的形态学特征。,,,(, ,壳聚糖缓释膜与小鼠成牙本质缩臌(,,,,,,,)共墙养。培养,瓣螽，取赉零季糕并蠢定，迸行扫缮奄镜观察。予培养,、,、,、,日观察细胞的形态和增殖情,见，计算细胞数蹩，绘制生长曲线。三、转化生长因子, ,壳聚糖缓释膜的直接蓬髓动物实验 机械暴露狗牙的牙髓，分别以,,,—, ,壳聚糖缓释膜、空白壳聚糖膜、氢氧纯钙非受羞髓裁黪设置对照组，零囊,,天、,,天处死动物，制俸组织甥片，研究,,,,, ,壳聚糖缓释膜作为直接盖髓材料在第三期牙本质形成中的作用。 第四军聪大学硕士学位论文 文献回顾 一、生物因子与活髓绦存 牙齿自荫出进入口腔，就开始面临多种致病因索的侵麓。龋坏、磨损、磨耗、壤镶，疆及班拨刺激麓都可以簇害牙体硬组织，势遴一步对雾越造残弼逆性戏不可逆性的损伤。作为牙齿唯一的软缎织，牙髓具有熬要的生理功能:形成牙奉痿帮营莠硬缀织，以及对癸采裁激产生一系翻懿薅镅反应。嚣鼗绦存活髓舆有十分重要的意义，滔髓保存治疗也受到广泛的重视。 牙髓怒一种疏松的结缔组织，箕所包含的细胞、血管颡神经可淤对筛赛的刺激做出反应，这点与其蚀结缔组织基本,致。同时，牙髓的损伤修复也有自己的特征，第三期牙本质的形成就是其中之,。活髓保存治疗的目的就是柱牙髓牙本质爨重建曩三常豹组织连接，诱导组织特异矬楚三翘牙本质的澎威。 随着牙髓生物学研究的不断深入，我们已经认识到，猩牙齿发育过程中，多耱生长戮子移缀戆终基臻分子菸溺参与、,,导秘调节雾零蒺魏发生。那么，在牙髓损伤修复过程中，内源性生物因子对第三期牙本质的形成作用如何呢,废褥外源靛生物因子辩第三麓矛本矮的形成会产垒怎样酶彩嫡鹱,现阶段，国内终的研究就以 上阅题做出了初步的回答，这将为活髓保存治疗提供一种崭新的途径——生物因子治疗。,。第三期磐本质 第三期牙本质的形成题牙髓对外界刺激的一种防御性殿应，其目的是增加牙髓与损终因子阉豹距离，洚低雾本震戆邋透犍，绦护牙髓免逮遂,步懿蠢害刺激。当损伤影响剿牙髓牙本质复合体，就可观察到局部有第三期牙本质的沉积。损伤静程度不同会对成牙本质细胞产生不同静影豌，轻微静瀚激下，成牙 日 第四军敝大学硕士学位论文本质细胞可以存活并分泌牙本质基质:较莺的刺激，会造成成牙本质细胞琵亡，并凌蔚传缨骢分他的戏牙本质样细腿分泌第三期牙本囊。根据分泌第三期牙本质的细胞不同，可以将其分为反应性牙本质和修复性牙本质【，,。,。,轻徽约援揍，暇始弱戏矛本质续愍可以存活。麴:寒残溺豹裁壤龋、避震缓慢的牙本质龋、较轻的滕损、酸蚀等。成牙本质细胞在损伤的刺激下，上调箕生物台残凌髓，程损伤麓对应懿牙髓蟊彩藏第三麓蒡本瑷(爰森洼茅零矮,，并在牙本质小管内可见到臀周牙本质的形成。反应性牙本质在解剖形态、嫩化特征和功能上与第,期和第二期牙本质相似。,(,未露髓的严重牙本质损伤，相对应的贼牙本质细胞被破坏。如:快速进展的龋损，牙体预备弓，起的严重组织损伤以殿充填材料对牙髓的刺激等。很快在爨豫藏牙零蹑缨您熬是部蠢炎症反应积组织筑修复。牙髓纲胞增鏊囱髓周瑟本质迁移;先是成纤维样细胞在牙本质周围线性排列，分泌无小管的臀样牙本质;熬嚣在逶会瓣条箨下，势能为或君零蒺释镧怒，分泌骞毒篱结稳静第三蘩牙本质(修复蚀牙本质)。在临床中损伤后恢复的牙髓牙本质遴接，是由反应性牙本质、修鬣性牙本质和雷样牙本质共同缀成静，不能严格酝分。,(,如果碧髓暴露，暴露的牙髓恧,以自我修复或在盖髓荆的作用下修复。无菌环境、无严重出血、无严重的炎细胞浸澜是牙髓暴露后良好的修复条件。前体绷照可殴增殖、分化，形成残牙本质样缨腿恢复被破坯瓣矛髓矛本质界。龋源性露髓，由于细菌已经长时间刺激牙髓，牙髓的自我修复能力减低。,(瘫漂瞧燕耪嚣予与第三麓牙零矮澎藏 大量体内、体外的研究表明:牙本质基质并不是一种惰性的组织，它富含犬激的内深往生物豳子，懿:,,, , ,，,,,(,、，,，,,,等活萑耪旗。它稍存在于可溶,生和不可溶性的牙本质綦质中，在龋损脱矿时可以被溶解释放或暴露出来，为粥三期牙本质的形成提供分子信号。 二，冬嚣裁有缀道:执摄箨髓嚣重，可以在牙本鹱殍漂黥阕围双察到修复性 ,, 第四军暇大学硕士学位论文矛本质的形成„,，辩。,,,,溶解的牙本质基餍应用予来露髓的龋洞，可戳在龋摄的牙髓面残察到反应性牙本质豹形成【,，扪。将滤膜在牙本质的,,,,溶液中稷泡之尉，植入牙髓，可在滤膜的周围观察到成牙本质样细胞的形态和功能分化【,】。羧矿豹或未矿化静矛本矮綦质透过蓬髓位点嬗入雾麓，两髑屠可以观察到戚琴本膜样细胞和修复性牙本质形成〔,”。 上述实验鄂表骥矛本痰基矮孛毽含菜黧肉源嬖羹垒蘩嚣,予，可良键逶第三麓牙本质的形成。如果用抗体对牙本质基质进行预处理，封闭,,,，,的分子活往，这种第三期牙本质形成酌,乍用会清失【棚。现在已经有研究表明牙本质中台有,,,(,【,】，并应用酶联免疫吸附方法对其进行了定量研究吼所以，可以说，牙本质基质中内源性的,?,,。,可以诱导第三期牙本质的形成。 此夕,，寿报道袭明，牙本囊基质中除下,,(?外还含商其它的内源性擞物因子，如，,,(，、，，，,,,，,,,(，，，以及,,,,，,,,,，,,,等。前者与第三期牙奉震懿形成秘关，爨者寿褒遴盘管影戏豹露耀。这终疼源性豹生蘩毅子在龋损脱矿时可以被溶解释放或暴露出来， 相互作用共同参与牙黼的修复【”。,(多,源往黧物因予与第三瓣矛本矮 实验已经证实:牙本质基质中内源性的生物因子可以促进第三期牙本质的形成，那么，如果程龋病、磨损、酸蚀，以及机械露髓等情况下，牙髓受到了损伤，能否应用辨源牲豹生物因子促进第三期牙本质静形成，加速矛髓的修复呢,,。,夕,源牲生糍嚣子与反宠瞧琴零痰 对于外源性生物因子与反应性牙本质的形成之间的关系，这方面的实验研究较少，霞湾蓄 第四军联大学硕士学位论文可以表明外源性的生物因子可能上调成牙本质细胞的合成和分泌功能。 ,,,,,,秘,,拍月爨寅培养的方法研究外源性生物因予与反应性牙本威形成的关系【,,,心，,,,。通过应用鼠的牙齿切片进行器官培养，可以保持牙髓牙本质复会体豹完整缝衣艘牙奉矮缀瑟熬活性。趱部应用浸有,,,,?,载璩,誓颗粒，观察到,,,。, ,和,,,(, ,可以上调局部反应性牙本质的形成【,,,。将没有,,,(,懿璩,毒颗粒藏羁牙蓊切片的成牙本矮绥麓簸，遣可驻裁激爱黢性雾奉蒺的形成，，…。,。,矫源性搬物因予与修复往牙本质 在牙齿的发育过程中，来源于牢串经嵴的闻充质缨胞对予基底膜介导的诱导信号作出反应，进行成牙本质细胞的分化过程。在牙齿的损伤修复过程中，成矛本屡缨艟鲤果受援坏死，裁由兹体缨骢分化为成牙本质捞绥瑰形成穆复性芳本质，恢复牙髓牙本质界的完整性。因此成牙本质样细胞的形态分化和功能分诧怒修复瞧雾本覆澎藏兹耄要多骤。冒藐懿藏俸缨麓是牙髓缨藏，躐蛊警溺爱的来分化间充质细胞。 体矫培养牙髓缁臆，躐察其在不同条佟下静反成，可戳研究外源性生物箧子对修复性牙本质形成的作用。在培养基中加入:,,,(, ,，，,,(，、，，，酸性或碱性的,,,，,,,,以及,,,等，可以增加人牙髓细胞,,,的合成以及糖蛋良鞠蛋囊多糖螅分泌，势亨霉毒,碱性磷酸酶躲活性,,,?,,，, ,,。但是这糖甥麓壤养方法不能反映牙髓细胞的形态和功能分化。较厚的牙齿切片的器官培养可以克鼹主述襞患，在爱帮应曩漫毒曩,,,?,约糠,警鬏靛，鼹察戮羊,,(鍪,窝,,,。, ,可以促进牙髓细胞的有丝分裂，并在,,,—, ,周围看到有成牙本质样细胞形成吲。 在动物实验中，,,,,,,,等将滤膜浸入”,,，,饼。(,，,,,(, ,生物因予后，通,蕊狗牙的露髓点植入牙髓中央进行观察，在浸有,,,,,，,,的重缀人源,,,(,,鸵鼹囝鞭以看到成雾本蒺样缨臌葶珏修复性牙本臻躲形成;,,,,豹滤骥髑滋 ,, 第四军医大学硕士学位论文有成牙本质样细胞的形态分化，但没有第三期牙本质形成，但在距离滤膜较远的露髓点下方有骨样牙本质形成:，,,(，，滤膜周围没有特殊的反应，但在露髓点下方可见骨样牙本质形成【,,】。由此可见，,,,(, ,促进成牙本质样细胞的形态和功能分化，促进第三期牙本质的形成:,,,,只能诱导成牙本质细胞的形态分化，而没有分泌牙本质基质的功能。 动物牙齿机械露髓后，应用生物因子进行盖髓，可以研究生物因子诱导修复性牙本质形成的作用。,,,—,,吸附到胶原膜后进行盖髓，可以观察到促进软组织和硬组织的愈合，诱导修复性牙本质的形成【他】。应用,,,,进行盖髓也可以刺激修复性牙本质的形成【,,】。在多种不同的实验中都可以发现，先是骨样牙本质形成。然后才有修复性牙本质的形成。说明生物因子可能先提高牙髓细胞的生物合成功能，形成骨样牙本质，然后待分化成熟的成牙本质样细胞形成后，才有修复性牙本质的形成。,(生物因子临床应用展望 关于内源性和外源性生物因子对第三期牙本质的诱导作用，已经得到了大量实验的证实，这为活髓保存治疗提供了一种新的途径。 ,(,内源性生物因子与活髓保存 牙本质基质是一个生物因子库，其包含着包括,,,(, ,在内的多种生物因子。当使用,,,,等处理剂对窝洞进行处理时，可以释放基质中可溶性的,?,,(, ,等生物因子，渗透到牙本质小管促进反应性牙本质的形成【,,,。氢氧化钙等材料作为洞衬剂时也有溶解牙本质基质释放生物活性因子的作用，刺激第三期牙本质形成【,,】。,(,外源性生物因子与活髓保存 大量的实验表明，外源性生物因子，特别是,,,(, ,，,,,等有诱导第三期牙本质形成的作用。如果将其作为盖髓材料，将为活髓保存治疗提供一种新的方法。 第四军医大学硕士学位论文 ,,,,丘,,等将几种人工材料作为,,,(, ，的载体，结果显示:微孔滤膜、羟基磷灰石颗粒和纯钛，复合,,,(, ,进行盖髓不能诱导第三期牙本质的形成。只有氢氧化钙复合,,,—, ,盖髓后能观察到成牙本质样细胞和修复性牙本质形成〔,,】。 另外，传统的盖髓剂，如氢氧化钙制剂，盖髓后可以出现第三期牙本质形成过度，引起髓室的钙化【,,，,,,。因此，应用生物因子进行活髓保存，还要考虑其剂量反应，控制第三期牙本质形成的量。 这提示我们，要想将生物因子应用于活髓保存治疗还需要就以下问题进行进一步的研究: ?生物因子的载体。许多生物因子在皮克级就可以发挥作用，但是需要选择合适的载体。 ?生物因子的剂量反应。明确生物因子的剂量反应可以有效的控制第三期牙本质形成的量，避免盖髓术后的髓室钙化。 ?生物因子的半衰期和活性的调节，以及作用机制和信号转导过程。 ?应用外源性生物因子盖髓，可能造成的免疫反应的问题。.