一残毁性掌跖角皮症家系致病基因突变检测

一残毁性掌跖角皮症家系致病基因突变检测 分类号:,,,,(, 单位代码:,,,,,密级: 学 号:,,,,,,,,, 厶紊只孥 硕士学位 鼬绷咖增踟加,昭渺,,,,,,’, ,,,,,, 论文题目: 一残毁性掌跖角皮症家系 致病基因突变检测 ,,,,,,，,, ,, ,,,, ,,,, ,,,,,，,, ，, , ,,,，,,?？,, ,,,,，,,,, ,,,,,,,, 作者姓名: 王占想 学院名称: 出塞太堂医堂随 专业名称: 应瓞痘与丝痘堂 指导教师: 毖麴教授 合作导师:——一 ,,, ,年,月, ,日论结 果……………………………(讨 论……………………………(结 论……………………………(参考文献……………………………(论文综述……………………………(致 谢……………………………(攻读学位期间发表的学术论文目录………… ,,,,,,,, ,,,仃,;, ,, ,,,,,,,……………………………………………………………………………………………?,,,,仃,;, ,, ,,酉,, ,……………………………………………………………………?‘,,舯,,,,; ,,,;,,,,,, ,…………………………………………………………………………………………‘,,,,,(,; ,……………………………………………………………………………………………………………一,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,, ,………………………………………………………………………………………,,,,,,,, ,……………………………………………………………………………………………………………,,,,,;,,,,, ,………………………………………………………………………………………………………?,,,,,;,,,,, ,………………………………………………………………………………………………………,,,,,(,,,,; ,………………………………………………………………………………………………………??,,,,,,, ,……………………………………………………………………………………………………………?,,,;,,,,,,,,,,,, ,……………………………………………………………………………………………,,,,,, ,,,,,,,;,,,,, ,……………………………………………………………………,, 山东大学硕上学位论文 一残毁性掌跖角皮症家系致病基因突变研究 研究生: 王占想 专业: 皮肤病与性病学 导师: 张莉教授 中文摘要 研究背景残毁性掌跖角皮症(,,,订,,,,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,)又称残毁性遗传性角质瘤(,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,)，于,,,,年由德国学者,,,,,,,,,首先描述并命名，因此该病又被称为沃温克耳综合症 (,,,,,,,,, ,,,,,,,,，,,，,,工, ,,,,,,)。它是一种罕见的常染色体显性遗传病，多呈家族性发病，同时也有散发病例的报道。该病好发于白种人女性，多于婴幼儿起病，病程呈进行性发展。其 典型的临床表现包括:对称性弥漫性掌跖角化，掌跖表面呈蜂窝状小凹馅;手足背部及肘膝关节伸侧等可呈典型的海星状或条状角化过度斑块;远端指(趾)间关节呈环形缩窄并逐渐断离(假阿洪病样改变)。 目前已定位克隆鉴定出两个与残毁性掌跖角化病有关的致病基因:分别是定位在,,号染色体,,？?叫,上编码缝隙连接蛋白,,,,的,,,,基因和定位在,号染色体,？,,上编码兜甲蛋白的,,,基因。由,,,,基因突变导致的残毁性掌跖角化病常伴有听力异常，被称为典型的残毁性掌跖角化病;由,,,基因突变导致的残毁性掌跖角化病常伴有鱼鳞病，又被称为变异型残毁性掌跖角化病。临床上我们收集到一残毁性掌跖角化病伴有感音神经性耳聋的家系，并对该家系进行了致病基因的研究。据我们所知，本研究为国内首次对该病进行致病基因突变检测。 目的对一个中国汉族残毁性掌跖角化病家系进行致病基因突变检测，以明确其致病基因及突变类型，以期进一步明确临床表型与基因型的关系。 方法收集该家系,例患者、,,例正常人和,,,例健康正常对照外周血标本和家系患者临床资料。用外周血,,,提取试剂盒提取外周血基因组,,,，采用聚合酶链反应(,,,)扩增候选基因,,,,基因的整个编码序列和侧翼序列在内的,,,,,,， 山东大学硕士学位论文扩增产物纯化后应用,,， ,,，,, ,,,,,,自动测序仪直接双向测序， ,,？,,,;,,,,(,,(, ,,,,软件与基因组序列进行比对分析，以明确具体的突变位置和突变方式。 结果,;,产物测序结果显示:该家系所有患者,,,,基因均存 ,，导致第一细胞外区域(,,)第,,位天冬氨在一个杂合错义突变,,,,— 酸被组氨酸替代 (即,,,,)，而家系中,,例正常人和,,,例非家系成员正常对照的,,,测序结果均未发现此突变。反向测序结果亦证实该突变。 结论该家系所有患者均存在,,,,基因突变(,,,,)，此基因为已知的残毁性掌跖角皮症致病基因，实验数据表明,,,,基因中,,,,错义突变也是中国汉族人群中残毁性掌跖角化伴耳聋的致病原因之一，可以通过基因诊断和产前诊断阻止致病基因的传递。 关键词 ,,,,,,,,,综合症;皮肤角化病，掌跖;基因,,,,;突变 ,,,,,,,，,, ,, ,,,, ,,,, ,,,,,，,, ，, , ,,,，,, ,，,, ,,,,，,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,:,,,, ,,,,,,,,, ,,,;,,,: ,,,,,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,: ,,,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,, ,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,, ,,;,,,,,,,、，,,,,,,,, ,,,,,,,,，,,,,,,,,,,,,,,,(,, , ,,,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,(，, ,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ;,,,,,,,, ,,，,,,,,,,,,,,,，,,;, ,, ,,觚,, ,,,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,, ,,, ,,,,,,,,, , ,,,,,;,,, ,,,,,,,，,;,，,,,,,,,(,,,, ,,,,,,,,, ,,, ;,,,,,,;,,,, ,,,,, ,,,,,,, ,, ,,,,;,,,,,,, ,,,,,,,,,,,,,,, ,, ,, ,,百,,(,,,,,,,,,,,,),,, ,, ,,,,, ,印,,,,,,,, ,,,, ,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,,，,,,;, ,,; ,,,, ;,,,,,,,,,,,(,,,,)，, ;,,,,,,,, ,,。,,,,,;,,,,,,, ,印,,,;,,,,,刹,,, ,,,,，,,,;, ,,;,,,, ,,,,嘶,?,, ,,, ,印,, ,, ,,,,, ,;,, ,,,,,,,, ,, , ,,,,,,,协,,,, ,, ,,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,,,,打,,,,,, ,, ,,, ,,,,, ,,,,,伍,,, ,, ,,,西,,,,, ,,,嘶,,,(,, ,, ,,,, ,, ,,, ,(,,,,,,,,,，“,,,,,,,, ,,,,, ,,, ,,,, ,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,, ,, ,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,, ,,,, ,,,血,,, ,,,,铲,,( ,,,,,,, ,(,,,,, ,,,, ,,,,;,,,, ,, ,,,,;, ,,, ,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,, ,, ,,,,,,,,,(,, ,)，，,,,,,, ,,,, ,,,,,,,( ,,,,,,, ,,,, ,,,,伊,, ,锄,,, ,，,, ,,,,, ,锄,,,, ,,,,;,’;,,,,;,, ,,,, ,,,,;,,,舶, , ,虢;,,, ,,,,,,,, ,,, , ,,,腩;,,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,锄,,, ,,, , ,,,,,,,, ;,,,,,,,(,,,,,,; ,,, ,,, ,,,,,;,,,蜀,,, ,,,,, ,锄,,,,(,,,珊,,,,, ,,,,,,, ,,锄,,,匆,,, ,,,,;,,,,佃,,),,, ;,币,, ,,, ,,, ,,;,,,,, ,，,, ,,,,,,,, ,,？,,,;,,, ,,,, ,,,, ,，,, ,,,,,,,, ,, ,,,,,,“,,,, ,,？,,,;,,,(,,,,,,,’,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,, ,,,, ,,?铮悖澹螅螅悖?,, ,,？,,,;,,, ,(, ,(, ,,，,,, ,,,,、,,,,? ,,,,,,, , ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,, , ,,,—,, ,, ,,, ,,,, ,,,,，,,,,;, ,,(,,,,),, ,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,; ,;,, ,, ,,,,,,,,, ,, ;,,,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,,,,,,，,,, ,,,, ,,, ,, ,, ,,,,,,, ,, ,,,, ,,锄,,,，,,, ,, ,,,, ,, ,,,, ,,,肌,, ,,,,,,,,,,, ,, ,,,, ,,锄,,, ,,, , ,, ,,,,,,, ;,,仃,,,( ,,,;,,,,,,, ,, ,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,, ,, ,, ,,,, ,,,, ,,,, ;,, ;,,,,、厂,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,, ,,,,,,, ,, ,,,,,,, ,,, ,,,,,,,,,,( ,,, ,,,,, ,,,,,,,,(,, ,,,,,,,,,;,,,, ,,,,;,,, ,,？,,,;,,,,;,,,,,,,, , 山东大学硕士学位论文 符号说明(,啪, ,,,,,,, 基因病,,,,,,;, 基因组学,,, 人类基因组计划,, 单基因病,, 常染色体显性遗传病,, 常染色体隐性遗传病,, ,连锁隐性遗传,,,,,;,, 基因扫描,,,,,,,,, 基因分型,,,,,(,,, 连锁,,, 短串联重复序列, 杂合度,，, 多态信息量,, 残毁性掌跖角皮症,,, 掌跖角皮症, ,,, 松解性掌跖角皮症,,, 掌跖角化伴牙周病综合症,,,, 弥漫性掌跖角化病,,, 有汗性外胚叶发育不良,,, 多聚酶链反应,,，, 人类孟德尔遗传在线 山东大学硕士学位论文 一残毁性掌跖角皮症家系致病基因突变研究 ,‘‘(,刍 刖 吾 人类健康决定于人自身的遗传物质与其内外坏境因素相互作用的平衡，这种 平衡可因遗传物质的变异或,和环境因素的作用而被打破引发疾病。人类的遗传 物质——基因，几乎参与了所有人类疾病的发生，它包括易感基因和致病基因。 因此，人类疾病在一定程度上也可被称为基因病(,,,, ,,,,,,,)。弄清遗传因 素在各种疾病中所处的作用和地位不仅利于揭示疾病的发病机制、了解人体内外环境因素对人类健康的影响，而且将对疾病的诊断、治疗和预防等领域带来深刻 的革命。因此，对人类各种疾病(即基因病)的致病基因或易感基因的定位、克 隆及结构功能研究成为当下人类基因组学(,,,,,,;,)研究的主流方向。随着,,世纪，人类基因组计划(,,,)的完成，为,,世纪基因诊断与基因治疗技术的发展奠定了坚实的基础。 根据基因改变类型的不同，基因病可分为以下三种类型:单基因病、多基因病以及获得性基因病。单基因病(,,,,,,,,; ,,,,,,,，,,)是由单个基因突变引起的,类遗传性疾病，也是唯一符合孟德尔遗传方式的疾病。,,具有数量多，散发，危害子代健康的特点。在单基因遗传病中，遗传因素起了决定作用，通常呈现特征性的家系传递格局，而环境因素基本不起作用。其包括常染色体显性遗传病(,,,,,,,,, ,,,,,,,, ,,,,,,,,，,,)、常染色体隐性遗传病(,,,,,,,,,,,;,,,,,, ,,,,,,,,， ,,)、性连锁遗传疖,(,,,—,,,,,, ,,,,,,,,，,,)，性连锁遗传病又分为,连锁隐性遗传、,显性遗传、,连锁遗传三类。 迄今为止，己发现的单基因遗传病有一万多种，目前己分离得到了上千种重要的人类单基因遗传性疾病的致病基因。随着分子生物学及遗传学的发展，对单基因遗传性疾病的研究方法逐渐成熟，并形成了一套行之有效的研究方法体系，即通过大规模的全基因组扫描和分型连锁分析的方法对致病基因进行定位克隆研究。 全基因组扫描(,,,,,;,,)所利用的是在人类基因组上大量存在的微卫星位 , 山东大学硕士学位论文点，其原理是利用特定引物将某条染色体上特定位置的微卫星位点扩增出来，并进行分析。微卫星位点即,,,短串联重复序列(,,,,,,,,,,, ,,,,,,,，,,,)，它广泛存在于人类基因组中，多位于内含子或非翻译区中，以,,,,,为单位，串联重复排列，其中以(,,),为最多见。微卫星位点具有高度的多态性，高杂合度 (,,,,,,,,,,,,,,，,)和多态信息量(,,,,,,,,,, ,, ,,,,,,,,,,, ;,,,,,,，,，,)，并以孟德尔共显性遗传。通过,,,方法，这些微卫星位点可以被运用于单基因、多基因遗传疾病的相关基因定位，精密遗传连锁作图，以及个体之间的鉴别、亲子鉴定等方面。 微卫星位点的高度多态性和信息量，使该技术运用前景广阔。(,)作为遗传标记，构建遗传连锁图，为基因定位和基因组扫描提供帮助。(,)作为遗传标记进行遗传病的基因定位。当遗传标记与致病基因在同一条染色体上而且距离较近时，会阻止子代传递时的自由分离，出现连锁不平衡。因此可通过对遗传标记的检测，判断患者是否携带致病基因。(,)根据微卫星位点的个体之间的差别，设计以十几个微卫星位点为一组，以个体间的各位点基因型串联编码。可以用于判定两人间有无血缘关系，该技术在用于军事、 法医等方面有着远大前景。 临床上单基因遗传性疾病病大多为少见病或罕见病，单从医学的角度看，对该类疾病的分子机制研究似乎意义不大。实际上，对单基因遗传病的研究意义不仅限于阐明其发病机制，更重要的是:该类疾病相当于天然的基因剔除(功能丧失性突变)或转基因(获得性功能性突变)的模型，它为人们对重要基因的基因功能研究提供了一些不可多得的模型。通过对该类基因的功能研究，可以让我们认识它们所处的信号转导通路上的许多基因，进而认识这个基因相关的网络。这样，我们就可以寻找各种可能的环节来调控这些基因，为寻找药物的作用靶点提供线索与思路，为开发新药奠定基础。 据文献统计分析皮肤科的单基因遗传性疾病大约有,,,余种，其中超过,,,多种单基因遗传性皮肤病已明确致病基因，已对近百种疾病的致病基因进行了基因定位口,。掌跖角皮症(,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,)又称掌跖角化病 (,,,,,,,,, ,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,)，是以手掌和足跖皮肤增厚、角化过度为特点的一组慢性皮肤病口,。该病为一组临床表现复杂多变的遗传性或获得性皮肤疾病,,，遗传性掌跖角皮症大多为常染色体显性遗传性疾病，而且其致病基因大 , 山东大学硕士学位论文多已被克隆鉴定出，如松解性掌跖角化病(,,,,)、,,,,,,,,—,,,,,,,综合症 (,,,)、弥漫性掌跖角化病(,,,,)(又称,,,,,—,,,,综合征)、残毁性掌跖角皮症(又称,,,,,,,,,综合征,,)、条纹状角化病、,,,,,,病(,,,)(又名转移性掌跖角化病)、掌跖角化病伴发食管癌以及,,,合并耳聋等,刊。遗传性掌跖角化病其遗传方式可为常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传以及性连锁遗传等。常有家族史，同时也有散发病例的报道。也可以是其他皮肤病如银屑病、毛发红糠疹、痣样基底细胞癌综合症等或一些全身性疾病的表现(即症状性掌跖角皮症)。因临床表现、遗传方式及发病时间的不同，构成了许多不同的综合症。角皮症常以临床分类，诸如弥漫性、局限性、条纹状或点状等，但是这些类型之间并无绝对的界限，单一疾病的表现可以随着部位、年龄、性别或职业而变化。跖部皮损比掌部有更严重或更弥散的趋势。 残毁性掌跖角皮症(,,, , ,,,, ,,, ,,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,,,,)又称残毁性遗传性角质瘤(,,,,,,,, ,,,,,,,,,,, ,,,,,,,,)，是掌跖角皮症中比较少见的一种单基因遗传性疾病。于,,,,年由德国学者,,,,,,,,,和,,,,,,分别对该病进行了描述并命名?,引，,,,,,,,,,所描述的患者为一名,,岁白种人女性，其女儿也有类似病史。因此该病又被称为沃温克耳综合症(,,,,,,,,, ,,,,,,,,，,,，,,，, ,,,,,,)。它是一种罕见的常染色体显性遗传病，好发于自种人女性，多于婴幼儿起病，病程呈进行性发展。典型临床表现包括:弥漫性掌跖角化过度，掌跖表面呈蜂窝状小凹陷;手足背部及肘膝伸侧等可呈典型的海星状或条状角化过度斑块;远端指(趾)关节呈环形缩窄并逐渐断离(呈假阿洪病样改变)哺，,,。本病常伴有听力损失或鱼鳞病，前者又被称为典型的残毁性掌跖角皮症，后者被称为变异型残毁性掌跖角皮症。但也有同时伴有先天性耳聋和鱼鳞病的报道阳,。 既往对本病的病因、分类及发病机制不太明确，近年来随着分子生物学和分子遗传学的发展，诸多学者对本病进行了相关基因即编码缝隙连接蛋白,,,,的,,,,基因和编码兜甲蛋白的,,,基因的研究。,,,,们等于,,,,年克隆了人类,,,, 基因全长;,,,，并对该基因进行了功能研究。于,,,,年，,,,,,,,妇等克隆了该基因，并通过人一鼠体细胞原位杂交将该基因定位在人,,？,,一？,,上。,,,,【,幻等和,,,,,,,‘川等先后克隆了人,,,基因全长;,,,和该基因，并将其定位在人,？,,上。,,,,年,,,,,,,,钔等对一同时患有遗传性掌跖角化病伴深度感音神经性耳聋 山东人学硕上学位论文 的家系进行致病基因检测时发现所有患者,,,,基因均发生了一个杂合错义突变 ,,, ,—,，使;,,, ,一末端区域第,,位氨基酸，导致甘氨酸(,,,)被精氨酸(,,,) 替代，即,,,,突变。 ,,,,年，,,,,,,,,,等,朝收集到来自美国的一残毁性掌跖角化病伴有鱼鳞病 的家系，通过连锁分析的方法将其致病基因定位在编码兜甲蛋白的,,,基因上，在对,,,基因进行序列分析时发现有,个碱基插入(,,,,,,,)，导致框移突变， 改变了,末端富含甘氨酸一谷氨酸,赖氨酸的翻译结构，形成异常的兜甲蛋白，从而导致该病的发生。检索国内外文献至今共有,个国家的,个伴有鱼鳞病的残毁性掌跖角化病家系报道，共发现,种突变类型，分别是:,,,,,,,，,,,,,,,，,,,,,,,,争,,,。其中,,,,,,,是最为多见的突变方式，在报道的,个家系中有,个是这种突变方式。 ,,,,年，,,,,,,,,,等,印对来自三个不同国家(英国、西班牙和意大利)的伴有感音神经性耳聋的残毁性掌跖角化病家系连锁分析及基因序列分析时发现，在所有患者的,,,,基因上均发现一错义突变，即第,,,位碱基,—,，致使第一细胞外区域第,,位密码子有天冬氨酸被组氨酸替代，从而形成异常的缝隙连接蛋白,,，出现异常角化表型。自此，在,,,,基因上相继共发现了四个突变位点与伴有耳聋的残毁性掌跖角化病有关，分别是,(,,,,,,,,，,(,,,,,,,,,，,,,,,,,,,和,,,,,,,,,卧,,,。 检索国内外文献，自,,,,年至,,,,年,,月共有约,,余篇相关报道，且大都为病例报告，对该病进行基因定位研究的仅有十几篇。国内文献有十余篇，均为病例报告，尚未见到国内对伴有听力异常的残毁性掌跖角皮症进行基因突变研究的报道。我们收集到山东某地的一残毁性掌跖角化病伴有感音神经性耳聋的家系，并对其进行了致病基因的研究。 , 山? 笱 妒垦 宦畚模辈牧虾头椒ǎ保 绷俅沧柿?先证者，女性，,,岁。因双手足、肘膝及臀部起红斑、丘疹及角化过度斑,,年，伴听力下降,年就诊。患者自,岁左右时无明显原因于双侧掌跖部出现红斑、丘疹及黄色角化过度斑，无明显自觉症状，未予治疗。,,年来，上述皮损逐渐加重，扩展至整个掌跖部皮肤，呈增厚的淡黄色角化斑块，表面为蜂窝状小凹陷。并累及手足背、指趾、肘膝伸侧及臀部等。近,,年来，双手,,指关节僵硬，不能屈伸，不能抓握。近,年，远端指(趾)关节处出现环形缩窄，末端变细。近,年出现听力下降。曾经到过多家医院就诊，均未能明确诊断。自发病来，全身皮肤无干燥、脱屑;掌跖无恶臭及分泌物;视力无异常;生活基本可以自理。 体格检查:先证者一般情况可，发育正常，身材偏小，智力正常，视力及眼底检查未见异常，心肺及肝肾检查未见明显异常。皮科所见:双手足掌跖部弥漫性淡黄色角化过度斑块，表面呈蜂窝状小凹陷，双手指屈曲，不能完全伸直，活动受限。(图,);手足背部及指趾部可见海星状角化和条状角化增生，远端指(趾)关节可见纤维性缩窄环，未节变细;(图,);肘膝伸侧及臀部可见条状及线状或斑点状肥厚性斑块(图,);指(趾)甲变形、肥厚，呈嵴状拱起。 其它部位皮肤粘膜未见异常。 辅助检查:先证者血尿大便常规及肝肾功血生化检测未见明显异常;双手部,线检查示:骨质部分吸收或消失，病变尤以远端指骨最为明显，末端指骨变尖 (图,)。先证者母亲双手,线检查显示:右手小指远端指骨已完全消失(,)。患者听力检查示:轻度感音神经性耳聋。 家系调查:该家系,代,,人中有,人发病，其中女,人，男,人，无隔代遗传现象，符合常染色体显性遗传(图,)。该家系所有患者均在,岁左右发病，症状相似(图,—,)，均表现为:掌跖弥漫性角化过度，表面呈蜂窝状小凹;肘膝及踩腕关节可见线状或海星状角化过度斑块;指趾末节出现纤维性缩窄环，并呈进行性指(趾)断症改变，症状进行性发展。所有患者均伴有不同程度的听力损失。均无鱼鳞病，智力、视力正常。家族中其他人情况良好，无其他遗传病史，无近亲婚配。 ,, 山东大学硕十学位论文 根据典型的临床表现、辅助检查及家族性发病特点，本家系患者诊断为残毁性掌跖角皮症。先证者给予阿维.