核酸定量检测技术(可编辑)

核酸定量检测技术(可编辑) 核酸定量检测技术 核酸定量检测技术 温 州 医 学 院 检 验 医 学 院 温州医学院附属第一医院检验科 陶志华分子杂交定量分析技术 一分支链DNA信号放大技术 (bDNA 美国Chiron公司, 分别以微反应板和琼脂 糖珠为载体,在定量检测系统中,采用了 一种人工合成的、结构如同树枝的DNA 信号放大探针,分支链DNA(branched DNA)因此而得名。 (二) 双抗体夹心杂交法 英国Murex Diagnostics Ltd发明, 称之为 Digene系统。该技术采用两种抗DNA/RNA杂交体的抗体: 一抗为捕获抗体,直接吸附在微孔反应板上, 二抗是偶联了AP的标记抗体,通过酶促化学发 光反应检测DNA/RNA杂交体的信号。真正的 核酸探针是RNA,它能特异地与HBV DNA基 因组负链互补。PCR基因定量技术 PCR基因定量技术 (一)PCR基因定量基础 PCR扩增循环过程 PCR扩增循环过程Y Y *1+E n n-1 v 0 E 1 v n Y X*1+E n vLgYLgX + n × Lg1+E LgX LgY - n × Lg1+E决定扩增效率(E的因素: 决定扩增效率(E的因素: 反应体系方面: 反应体系方面: 反应最佳条件、反应物的相对含量、循环次 反应最佳条件、反应物的相对含量、循环次 数 数 反应管之间: 反应管之间:扩增仪上不同位置扩增仪上不同位置 标本之间: 标本之间: 不同标本中所含有的 不同标本中所含有的D DN NA A聚合酶的抑制剂 聚合酶的抑制剂 引物和的结合能力 引物和模板的结合能力 模板的含量 模板的含量怎 么 办 ?摸索最佳的实验条件摸索最佳的实验条件严格实验室规范化管理严格实验室规范化管理制定规范化的操作规程制定规范化的操作规程采用内标法采用内标法(二) 定量PCR的方法学分类: (二) 定量PCR的方法学分类: 外标法 外标法非竞争内标定量PCR非竞争内标定量PCR 内标法 内标法竞争定量PCR竞争定量PCR构建内标物应具备: 构建内标物应具备: 与靶基因待分析序列比较: 与靶基因待分析序列比较: 相同的引物结合位点 相同的引物结合位点相同的长度相同的长度相似的碱基排列顺序 相似的碱基排列顺序 或G+C%含量相似或G+C%含量相似不同的探针结合位点不同的探针结合位点内标法准确定量的原理: 内标法准确定量的原理: n Y X *1+E S S n S n Y nX *1+E I I I Y X S S n Y n X I I内标物的构建: 内标物的构建:靶基因扩增产物的突变靶基因扩增产物的突变限制性片段的插入或缺失限制性片段的插入或缺失含靶基因引物结合位点的非同源性DNA含靶基因引物结合位点的非同源性DNA 序列 序列(三)PCR产物的检测与定量 (三)PCR产物的检测与定量终点检测法终点检测法 琼脂电泳扫描检测法 琼脂电泳扫描检测法 固相捕获法 固相捕获法非探针杂交捕获法 非探针杂交捕获法 探针杂交捕获法 探针杂交捕获法 HPLC检测法 HPLC检测法实时检测法实时检测法 Taqman技术LightCycler技术 Taqman技术LightCycler技术 ELISA-PCR技术荧光定量PCR技术 一. 荧 光 染 料 一. 荧 光 染 料 Fam495nm Tamra560nm L640 Tet 520nm Hex537nmL705 Tamra/FamTamra/Tet Tamra/Hex 光能 光能 热能 热能 转移给临近的分子 转移给临近的分子荧光共振能量转移FRET 荧光共振能量转移FRET荧光标记信号的产生二.荧光PCR类型 二.荧光PCR类型荧光标记探针荧光标记探针 动态监测荧光信号变化动态监测荧光信号变化特异性荧光探针 Taqman双荧光标记探针 molecular Beacon荧光标记探针 荧光标记杂交双探针特异性荧光双标记探针 Taq酶 5’?3’外切酶活性Molecular beacon Mo lar beacon荧光标记杂交双探针 荧光标记杂交双探针 变性 退火 变性 退火 结束 结束 延伸 延伸三. 荧光实时定量PCR的定量原理:nYX×1+E LgYLgX + n × Lg1+E LgX LgY - n × Lg1+En LgY/ Lg1+E ? 1/ Lg1+E × LgX 荧 光实时 P C R的定量概念 T a r g e t 未知标本 n 标准曲线 l o g c o p y n u m b e r n l o g F2/ F1 l o g F2/ F1 C r o s s i n g P o i n t C y c l e s在对数期进行定量分析的优势扩增效率恒定 动态分析,变化灵敏标准曲线呈线性核酸定量检测临床应用疾病的早期诊断 疾病的早期诊断免疫学诊断主要是抗原抗体反应,应用于临床通常在 体内产生抗体以后,而许多病原体的免疫学检测存在 较长的“窗口期”,比如HCV的“窗口期”平均长达70天, 不利于对疾病的早期诊断;PCR方法直接检测病原体的 DNA/RNA,能大大缩短“窗口期”,其高灵敏度的检测显 然也有利于疾病的早期诊断。新药验证 新药验证任何一种抗病毒药物,以免疫标志物来 任何一种抗病毒药物,以免疫标志物来评价 其疗效均不够敏感和及时,若以病毒复制的被抑制 其疗效均不够敏感和及时,若以病毒复制的被抑制 程度,即病毒基因水平的高低和动态变化来评价疗 程度,即病毒基因水平的高低和动态变化来评价疗 效,则较为直接和理想。 效,则较为直接和理想。遗传疾病的早期诊断 遗传疾病的早期诊断 荧光PCR可实现对点突变、缺失突变、 插入突变、多基因突变等的检测,对产 前诊断具有其他方法不可比拟的优势, 有利于优生优育,提高人口素质。母婴传播的监控 母婴传播的监控荧光PCR可对病原体的母婴传播进行有效 的监控,为确定宫内感染、围产期感染或哺 乳期感染等提供依据,为母婴传播的阻断等 提供参考。肿瘤的诊断 肿瘤的诊断可对原癌基因的突变和易位等作出检测; 可对原癌基因的mRNA进行定量分析; 有利于肿瘤的早期诊断,甚至癌前诊断; 探索癌变发生机理的研究提供参考; 区别肿瘤的良性和恶性以及炎症反应。