钩虾等位酶基因型对马拉硫磷致死性响应研究

钩虾等位酶基因型对马拉硫磷致死性响应研究 钩虾等位酶基因型对马拉硫磷致死性响应 研究 农业环境科学学报2008,27(6):2447—2451 JournalofAgro—EnvironmentScience 钩虾等位酶基因型对马拉硫磷致死性响应研究 张艳红1,肖艳琴,李翠兰,张秋华,段毅豪 (1.山西大学环境与资源学院,lh~q”太原030006;2-【lJ大学生命科学与技术学院,山西太原030006) 摘要:钩虾的一l,一2,脚,I,Ao一1和I4o一2基冈座佗具有多态性,从平均每个基因座位的等位基因数(A=2.6-2.9),多态 基因座位百分率(71.4%),平均观察杂合度(0.226,0.246)和平均期望杂合度(=0.394-0.409)4个参数可知,钩虾具有较高 的遗传多样性,适合于农药马拉硫磷作为选择因子用于对具有不同基因型的个体的致死性差异研究.本实验以钩虾为对象,通过急 性毒性实验方法,研究了钩虾等位酶基冈型与马拉硫磷急性致死作用的关系.结果明,供试钩虾用10g?L马拉硫磷溶液处理 382只,96h后死亡率为68.8%.分别对存活个体和死f_个体的一1,/dh一2,Pgm,4o,1和Ao一2基因座位进行等位酶以确 定每个个体的基凶型.列联表检验表明:马托硫磷对/dh一1,一2,啊,和o一2各基因型个体的选择呈现随机特征,各基因型与 死亡率未见显着的相关(P>0.05).但存Gpi和Ao一1基因座位上,—AC和一AD基因型死亡率间存在显着差异;Ao一1一AC和 4o一1一BB,Ao一1一CC基因型死亡率之间仔存着差异.示马拉硫磷的致死作用对和o一1基因座位的不同基因型呈现出非随 机特征,i—AD和o一1一AC基冈型很可能与钩虾对马拉硫磷的耐药性有关. 关键词:钩虾;马拉硫磷;基因型;等位酶;死亡率差异 中图分类号:X830.2文献标识码:A文章编号:1672—2043(2008)06—2447—05 LethalResponsesAmongAllozymeGenotypesofGammaruspulextoAcuteExposureto Malathion ZHANGYan—hong’,X|AOYah—qing,LICui-lan,ZHANGQin—hua’,DUANYi—hao (1.CollegeofEnvironmentalSciencesandResom’ces,ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China;2.CollegeofLifeScienceandTechnology, ShanxiUniversity,Taiyuan030006,China) Abstract:ApopulationofAmphipodsGammaruspulexfromYuanpingCity.ShanxiProvi nceinChinaweref0undpolymorphicatthelociof /dh一1,Idh一2,户:n,户,Ao一1andA0—2,usinghorizontalstarchgelelectrophoresis.Thedataofthemeannumberofallele sperlocus(A= 2.6-2.9),percentageofpolymorphieloci(P=71.4%),theobservedmeanheterozygosity(H.=0.226,0.246)andtheexpectedmeanhet— erozygosity(H=0.394~0.409)suggestthatthispopulationpossessessufficientgeneticdiversity,whichmakesitfeasibleforstudyingthepos— sibledifferentialmortalityamongtheindividualsofvariousgenotypesacutelyexposedtomalathion,thepesticidecommonlyfoundinagricul— turalialnoff.Atota1of382G.pulexindividualswereexposedtomalathionat10?Ltoachieveamortalityof68.8%after96hoursfollowed byallozymeanalysistoidentifythegenotypesofeachindividua1.Contingencytable一 testsshowedthatmalathiondisplayedrandomlethal effectsamongthegenotypesatIdh-1,hth-2,踟andAo一 2,wherenocorrelationbetweenthegenotypeandlethalitywasobserved(JD> O.05).However,significantdifferentialmortalitieswereobsmwedinthefollowinggenotypepairs:Pg/-AC(93%)vs.-AD(25%),A0—1一 AC(37%)vs.Ao一1一BB(69%),andA0—1一AC(37%)us.Ao一1一 CC(72%).SincethesamplesizeofPg/一AC(27)andPg/-AD(8)maynotbe sufficientlylargefurtherexaminationisneeded.AtthelociofAo一 1,undertheassumptionsof1)thepresenceofuniformbiologicalcharacters otherthanAo-1genotypes,and2)thepresenceofallelicinteractionandheterozygoticvigorfortheallelesofAo一1一AandA0—1一C,itisex— pettedthatAo一1一ACwoulddisplaylowermortalitythanAo一1一 CCwhenexposedtomalathion.ThedataobtainedfromthestudywereNund consistentwithsuchreasoning,whichsuggeststhatthecorrelationofAo-1-ACgenotypetotheresistancetopesticidemalathioninG.palex. ThedataimplythatmonitoringthedynamicsofAo一 1-ACgenotypesandperhapsAo-1-Aallelefrequencymaybeusefulinevaluatingthe resistancepotentialofthispopulationagainstmalathionexposure. Keywords:Gatnrao;ruspulex;malathion;genotype;allozyme;differentialmortality 收稿日期:2008一Ol一07 基金项目:山西省基础研究项目(2006011015);国家自然科学基金资助项目 (20177012) 作者简介:张艳红(198O一),女,硕士研究生,研究方向为环境毒理学. 通讯作者:段毅豪E—mail:duany@sxu.edu.cn 2448张艳红等:钩虾等位酶基因型对马拉硫磷致死性响应研究2008年11月 近20年来,害虫防治采用高浓度,大剂量的杀虫 剂,严重地污染了包括水生系统在内的生态环境,威 胁到人畜及害虫天敌的安全.大量复杂的微量有毒有 害的化合物如环境激素排入水生系统也对水生系统 和人类的健康产生了更为严重的危害.监测和评价水 生生态状况及控制污染物排放是当前面临的挑战之 一 .多种生物测试方法如具有很高的生态相关性的单 物种毒性试验,微宇宙实验等已广泛应用于评价和预 测有毒有害化合物对水生系统的影响,但是这些方法 敏感性较低,无法对环境状况的发展以及生物在遗传 水平发展方向作出指导. 应用环境生物酯酶等位酶谱带可以作为对有害 有毒物质的检测方法.Maa等发现小菜蛾(Plutella xylostella)对马拉硫磷的抗性与酯酶等位酶有关_11.李 暄等对抗阿维菌灭小菜蛾酯酶等位酶的研究中发现 在杀虫药剂逐代选择过程中,其酯酶基因型正从杂合 型向纯合型过渡12J.乔传令等的研究表明小菜蛾 (Plutellaxylostella)对阿维菌素杀虫剂的抗性与酯酶 基因型的变异有关l3l.但酯酶谱带复杂,难以判读.故 需要开发其他稳定的等位酶标记用于种群遗传水平 有研 的监测和评估.但有关这方面的研究尚不多见. 究表明美洲钩虾(Hydellaazteca)种群的遗传结构与 重金属抗性比率呈现明显的相关性.李翠兰等发现 中华稻蝗Gp基因型与有机磷农药敌百虫和阿维菌 素的急性致死作用存在显着相关性. 马拉硫磷是一种非内吸性低毒类有机磷杀虫剂, 全名为0,0一二甲基一S一(1,2一二乙氧羰基乙基)二硫 代磷酸酯.钩虾(Gammaruspulex)是水生生态系统中 的重要类群,在水生态系统能量传递和物质循环中起 重要作用,对于污染物具有较高的敏感性,已被广泛 地运用于毒理学试验. 本实验以钩虾为研究对象,利用钩虾种群遗传结 构特点,通过了解钩虾等位酶基因型与马拉硫磷急性 致死作用的关系,探索将这种关系作为钩虾对马拉硫 磷的生物标记物(biomarker)的可能性,从而为环境监 测方法构建模式生物提供科学依据. 1材料和方法 1.1供试农药 马拉硫磷(Malathion)是一种非内吸性低毒类有 机磷杀虫剂.本实验所用马拉硫磷原药(45%乳液)购 自山东省德州市. 1.2样本采集及处理 钩虾(Gammaruspulex)属于端足目钩虾科(Gam— maridae),甲壳纲动物.供试钩虾采自山西原平云中 河,运回实验室后,在去氯的自来水中饲养,隔一天饲 喂不含色素的金鱼饵料(fishflake)一次.供试虫体用 lO?L马拉硫磷溶液处理,96h后对活体和死亡个 体分别计数,并计算其死亡率,判断死亡的标准为用 镊子轻触虫体,肢体不再运动的即为死亡.虫体单独 分别包装,冻存于一80?冰箱待用. 1.3等位酶电泳 根据以前研究结果,对有多态性的异柠檬酸脱氢 酶(IDH),磷酸葡萄糖异构酶(PGI),磷酸葡萄糖变位 酶(PGM)和苯甲醛脱氢酶(AO)进行淀粉凝胶电泳. 凝胶浓度为12.5%,采用Tris一柠檬酸缓冲液(0.05 mol?L,,pH8.0),电极缓冲液与凝胶缓冲液比例9:1, 凝胶模板大小为234mmx135mmxl8film. 取钩虾个体置于25L双蒸水内冰浴匀浆,浸入 3mmx9mm滤纸芯作为上样样品.上样后在4cI=冰箱 内恒压(10V?em)电泳4.5h,水平切片后用特异性 染色方法进行染色[71.酶谱判读时,同一基因座位泳动 最快的带记为A,以后依次记为B,C等. 1.4数据处理 1.4.1基因型与死亡率之间的相关性检验 对钩虾多态基因座位的各基因型与死亡率进行 ,以了解基因型与马拉硫磷致死作 2x2列连表检验 用之间的相关性.在进行统计分析时,各多态基因座 位上的每个基因型为一组,每组的个数即为重复. 1.4.2种群遗传结构分析 应用BIOSYS一1I软件[81计算存活组,死亡组及初 始种群各基因座上的等位基因频率,对哈一温(H—w) 平衡的符合度,固定指数(F),每个基因座的多态性, 杂合度(H)和Roger’s遗传距离. 2结果 2.1钩虾种群遗传结构分析 马拉硫磷急性毒性处理后钩虾存活组,死亡组和 初始样本的等位基因频率,哈一温(H—W)平衡适合 度,每个基因座位的杂合度(H)和同定指数(F)见表 1.结果表明,钩虾种群的Pgm一2为单态基因座位 (0.95标准),而/dh一1,Idh一2,虾种群在6个基因座位上的多态性程度较 高,体现在较高的平均每个基因座位的等位基因数 (A:2.6,2.9),多态基因座位百分率(P=71.4%),平 均观察杂合度(Ho=0.226,0.246)和平均期望杂合度 (H=0.394,0.409),适合于马拉硫磷等农药作为选择 因子用于对具有不同基因型的个体的致死性差异研 究.日.小于日.,表明钩虾种群出现了一定程度杂合体 缺乏现象,这可能是由于非随机交配等因素引起的, 也可能存在不利于某些杂合体的自然选择. 2.2钩虾多态基因座位的各基因型与马拉硫磷致死 表1马拉硫磷处理后钩虾3个样本在唧i,Ldh,Ao和m基因座位的等位基因频 率,基因型频率对哈一温平衡预期值的 卡方检验,每个基因座位的杂合度(H)和固定指数(F) Table1Allelekequenc)r,Chi-squaretestsforHardy—Weinberg’Sexpectationofgenotyp e~equency,heterozygosity(H)and fixationindex(F)perlociatsevenlociinalive,deadandinitialsamplesofGammaruspulexa cutelyexposedtomalathion 注:a为括号内的值为样本数目为基因型频率对哈,温平衡预测值的卡方检验值(PO.01);为杂合度的直接观察值. a:Samplesizeinparenthesis:Chi—squarevaluesofH—Wexpectationsofgenotypefrequencies(P<O.05;P<O.O1);日:Directcountofheterozygosity 表2马拉硫磷处理后钩虾3个样本的遗传多样性 Table2Geneticvariabilitya1thesevenlociinaliveIdeadandinitialsamplesofGammarusp ulexacutelyexposedtomalathion 注:当最常见的等位基凶频率小于95%时,即为多态基座位;一无偏差估计(Nei,1978);括号内的值为标准误差. AlocusisconsideredpolymorphicifthemostcommonalleledoesnotexceedO.95(standar derrorsinparenthesis);Unbiasedestimate(seeNei 1978);Standarderrorsinparenthesis. 2450张艳红等:钩虾等位酶基型对马抽硫磷致死性响应研究2008年l1月——————,——————————————————————————————— ————一———————————————————————————————————一 表3钩虾6个基因座位各基因型对马拉硫磷致死率的影响 Table3Genotypeeffectsontheprobabilityofdeathf0rsixpolymorphiclociinGammarusp ulexexposedtomalathion 注:括号内的值为样本大小;观察值小于5,小进行统计分析;杯有不同字母的死亡率之问有娃着差异,如a和b之问有显着差异(P<0.05o Samplesizeinparenthesis.Theprobabilitiesofdeathamonggenotypesnotshatingthesanl eletteraresignificantlydifl~rent.Forexample.av.s.bis significantlydifferent(P<O.05). 作用的关系 用马拉硫磷处理钩虾成虫共382,平均死亡率为 68.8%.6个多态基因座位上各基因型个体的死亡率 及各基因型与死亡率的2x2列联表检验结果见表 3.检验结果表明,一ac和一基因型死亡率 间存在显着差异;_40—1一和A0—1一bb,A0一l—CC基 因型死亡率之间存在显着差异. 3讨论 农药面源污染在—定程度上改变了自然地理环 境,使得生物种群面临一个受胁迫环境.污染胁迫最 显着的效应就是污染物使敏感个体逐渐减少或消失, 因而改变了生物种群的遗传结构L4l.利用水生生物种 群遗传结构动态变化作为水环境污染的监测指标是 反映水环境污染程度的一条新的思路.以无脊椎动物 和鱼类为实验动物的研究表明,环境污染物作为环境 选择因子与等位酶基因型频率的改变有最着的相关 关系.9-11一2,,m—l,0—1和,{o一2)上的基因型对马拉 硫磷的致死作用具有不同响应(response),表现为马 拉硫磷对M一】,厅一2,砌n一1和o一24个多态基因 座位各基因型个体的致死作用呈现随机性特征,但对 和AO—l基因座位各基L大j型的致死作用却呈现非 随机效应,在基因座位上,具有一AC基因型个 体的死亡率(93%)显着高于具有P一AD基因型个体 的死亡率(25%,P<0.05,表3).考虑到这两个基因 型的个体数量不是太大(分别为27和8个),需要进 一 步增加样本量进行确认.本研究同时发现,在Ao一1 基因座位上,具有/Io一1一AC基闪型个体的死亡率 (37%)显着低于具有AO一1一BB的死亡率(69%)和 Ao一1一CC基因型个体的死亡率(72%,P<0.05,表3). ?除o一1基因型外,本钩虾种群 进一步分析,假设 的其他生物学性状相同;?o一1一A和Ao—l—C等为 基因存在相互作用,并表现杂种优势,则具有Ao一1一 AC基因型的个体死亡率应该着低于Ao一1一CC基 因型的死亡率.以上推论与本研究数据相吻合,表明 本钩虾种群中,4o一1一AC基因型很可能与钩虾对马 拉硫磷的抗性有关.当然,这种相关关系不能等同为 因果关系.等位酶基因型的动态有可能成为潜在的环 境因子标记,进一步T作应该结合其他遗传标记 结果和种群生态特征,探讨种群遗传结构和抗性进化 之间的关系. 参考文献 f1JMaaWC,LiaoSC.Culture—dependentvariationinesteraseisozymes andmalathionsusceptibilityofDiamondbackmoth.Hutellaxylostella LlJ1.ZoologicalStudies2000,39(4):375—386. 【2】李暄乔传令.抗阿维菌灭小菜蛾酯酶等位酶的研究【cy/走向2l 世纪的中国昆虫学.北京:『f1闰科学技术出版社,2000.379—381. 第27卷第6期农业环境科学学报2451 LIXuan,Q1AOChuan—ling.Studiesontheesteraseallozymeof abameetinresistantdiamondbackmoth(PluteIlaxylostellaL.)fromYun- nan【A】.//ChineseEntomologytothe21thcentury”【c】.Bejing:China scienceandtechnologypress,2000.379-381. [3】乔传令,王靖,邢建民.不同地区小菜蛾种群的抗药性及酯酶同功 酶的研究lIl1.农药学报,2000,2(4):33—39. QIAOChuan—ling,WANGJing,X1NGJian-minStudiesontheinsecti— tide—restantandesteraseisozymesindiamondbackmothPlutellaxy- lostella(I.)fromthreepopulationsinChina[J].Chinesejournalofpesti— cidescience,2000,2(4):33—39. [4]DuanYH,GuttmanSI,OrisJT,eta1.Differentialsuiwivorshipamong allozymegenotypesofHyalella(iztecuexposedtocadmium,zincorlow pH[J].AquaticToxicology,2001,54:15—28. [5]李翠兰,段毅豪,卢芙萍,等.中华稻蝗等位酶基因型与阿维菌素急 性死亡率差异研究【J].遗传学报,2004,31(11):1241—1247. LICui—lan,DUANYi—hao,LUFu—pingeta1.DifferentiaJacutemor— talityamongtheallozymegenotypesofOxyachinensisbypesticideaver_ meetin[J].AetaGeneticaSinica,2004,3l(11):l241一1247. [6】李翠兰,段毅豪,卢荚萍,等.敌百虫对中华稻蝗磷酸葡萄糖异构酶 基因型的致死性差异研究『JI.农业环境科学学报,2004,23(2): 38l一383. LICui—lan,DUANYi—hao,LUFu-ping,eta1.Differentialmortalitya— mongtheOxyachinensisgenotypesatglucose一6-phosphateisomerase bytrichlorphon[J].JournalofAgro—EnvironmentScience,2004,23(2): 381—383. [7]王中仁.植物等位酶分析[M】.北京:科学出版社,1998.74—163. ren.PlantAllozymeAnalysis[M].Beijing:SciencePress, WANGZhong— 1998.74一l63. [8]SwoffordDL,SelanderRB.BIOSYS一1:aFORTRANprogramforthe comprehensiveanalysisofelectrophoreticdatainpopulationgenetics andsystematies[J].JournalHeredity,198l,72:419—426. [9]SchlueterMA,GuttmanSI,OrisJT,eta1.Survivalofcopper—expose juvenilefatheadminnows(Pimephalespromelas)differsamongallozyme genotypes[J].EnviroToxicolChem,1995,14(10):1727—1734. — 【10]DuanY,GuttmanSI,OrisJT,eta1.Genotypeandtoxicityrelation shipsamongtIyalellaazteca:I.AcuteexposuretometalsorlowpH【JJ. 1421. EnviroToxicolChem,2000,19(5):1414— [】1]DuanY,Gut/manSI,OrisJT,eta1.Genotypeandtoxicityrelation— shipsamongHyalellaazteca:?.Acuteexposuretofluoranthene—con— taminatedsediment[J].EnviroToxieolChem,2000,19(5):1422—1426.