卵黄中蝮蛇毒抗体对蝮蛇蛇毒毒性成分的中和作用

卵黄中蝮蛇毒抗体对蝮蛇蛇毒毒性成分的中和作用 卵黄中蝮蛇毒抗体对蝮蛇蛇毒毒性成分的 中和作用 第30卷第2期 2002年6月 广州医学院 ACADEMICJOURNALOFGUANGZHOUMEDICALCOLLEGE VO1.30NO.2 Jun.2002 卵黄中蝮蛇蛇毒抗体对蝮蛇蛇毒毒性成分的中和作用 邓维意方敏华高玫梅黄劭.余清声燕启江’ (广州医学院第二附属医院神经科学研究所,广州510260;广州医学院蛇毒研究所,广州510182) 摘要目的:制备特异性高的蝮蛇蛇毒卵黄抗体,并对其体内保护和体外保护作用进行了研究.方法:用蝮蛇 蛇毒作为抗原免疫鸡,使之在蛋黄中产生抗体IgY,然后用聚乙二醇法提取IgY,并通过小鼠体内保护和体外中和试 验,研究IgY对蝮蛇蛇毒毒性成分的中和作用.结果:通过本法制得的IgY在体内和体外试验中都能中和蝮蛇蛇 毒,时蝮蛇蛇毒急性中毒的小鼠有明显的保护作用.结论:聚乙二醇法从免疫鸡蛋黄中提取的蛇毒抗体IgY,可用于 救治蝮蛇蛇毒急性中毒的小白鼠. 关键词蛋黄抗体IgG(IgY);体内保护作用;体外中和试验 中图分类号R967文献标识码:A文章编 号:1008—1836(2002)02—0008—02 传统中,用于救治被蛇咬伤的药品主要是含有 蛇毒抗体的马血清或羊血清.然而,制备这些抗血 清的操作比较复杂,成本较高,给病人带来了较大的 经济负担.20世纪初,人们发现鸡抗体具有从母体 传递到卵黄的特性:鸡经免疫后,在输卵管内卵黄成 熟期时,血液中的IgG可被选择性地转移到蛋黄 中…,而蛋黄中所获得的抗体主要是IgG(IgY),其 含量超过鸡血清.经过多年研究,人们发现IgY与 抗蛇毒血清IgG相比,具有许多优点:不与Fc受体 或血清中的类风湿因子反应,因而可减少病人机体 因蛇毒抗体而发生的过敏反应;性质比较稳定, 可耐酸,耐碱,耐热和耐高渗性;具有高产性,据 报道,在相同免疫时间内,从一只鸡所生的鸡蛋中所 提取的抗体远远超过一只兔血清制备的抗体量. 目前国内报道大多是IgY用于制备乙肝疫苗及脊髓 灰质疫苗,关于卵黄蛇毒抗体研究的报道.尚未见 到.本文主要是介绍蛇毒抗体IgY的制备提纯方 法,并将所得的抗体IgY进行药效学评价. 1材料和方法 1.1材料 1.1.1聚乙二醇6000,由广州市医药公司化学试 剂玻璃仪器批发部(进口分装)提供;福氏完全佐 作者简介:邓维意(1969.6一),女,实验师,大专. 研究方向:临床检验. 8 剂,Sigma公司出品;其余试剂均为市售分析纯. 1.1.2蝮蛇蛇毒为黄色结晶,由蛇毒研究所提 供,用健康NIH系小白鼠腹腔注射LD,.为1.64 mg/kg. 1.1.3动物NIH系纯种健康小白鼠,雌雄各半, 体重18,22g,由广州医学院医用实验动物中心提 供.22,24周的来抗母鸡:购自广州力康公司. 1.2方法 1.2.1母鸡免疫用蝮蛇蛇毒免疫来抗母鸡,每只 鸡注射420I,zg,采用肌肉多点注射.初次免疫蛇毒 加福氏完全佐剂按1:1(V/V)经肌肉内注射,以后 每隔两周用未加福氏完全佐剂的蛇毒加强免疫1 次,共加强免疫3次,末次加强免疫后,第1天开始 收集鸡蛋,4cC保存. 1.2.2分离提纯鸡蛋黄IgY用2体积(V)0.01 mol/L的PBS缓冲液(pH为7.2,7.4)溶解1体积 (V)鸡蛋黄,边搅拌边加入粉状聚乙二醇6000, 直至其浓度为3.5%(W/V),静置5mln后离心, (10000g,15min);弃表层脂质和底部沉淀,向中 层液相中继续加入粉状聚乙二醇6000,直至其终浓 度为12%(W/V),静置10min中后离心(4000g,10 rain),弃去上清液,将所得的沉淀用0.01mol/L的 PBS溶解,置于半透膜中透析,用以脱盐;透析后分 装,此制品则为蛇毒抗体IgY. 1.2.3IgY体内保护作用选用NIH系健康小白 鼠40只,随机分成4组,每组10只,先给这40只小 第2期邓维意,等:58卵黄中蝮蛇蛇毒抗体对蝮蛇蛇毒毒性成分的中和作用 鼠腹腔注射8.2mg/kg(5LD.)的蛇毒溶液,15rain 后按高,中,低三种不同剂量浓度的蛇毒抗体IgY溶 液分别给三组小鼠腹腔注射进行抢救,对照组注射 同体积0.01mol/L的PBS溶液,观察72h,各 组小白鼠的存活率. 1.2.4IgY体外中和实验选用NIH系健康小白 鼠40只,随机分成2组,每组20只;试验组:将16.4 mg/kg的蛇毒液与16.4mg/kg的IgY液在无菌试 管内混合,置37cC水浴中孵育30rain,给一组小白 鼠腹腔注射此混合液;对照组:将0.01mol/L的PBS 溶液与等浓度的蛇毒液混合,同样条件下给一组小 白鼠腹腔注射,记录72h内小白鼠的存活率. 2结果 2.1IgY体内保护作用药效学评价体内保护作 用结果见表1.从结果可得知用本法所制得的蛇毒 抗体IgY可中和小鼠体内的蛇毒,但低剂量的IgY 不能抵御住体内蛇毒对中毒小鼠的攻击,浓度需达 到1:1(IgY与蛇毒的浓度比)或以上时,才能抵挡 蛇毒的攻击,使大部分小鼠存活. 表1IgY对蝮蛇蛇毒的体内保护作用(n=10) Tab.1ProtectiveeffectoflgYinmicewhichhave beenpoisonedbyAgkistrodonHalys(AH)venom Vscontrol:P>0.05.…P<0.005 2.2IgY体外中和实验药效学评价IgY体外中和 实验结果见表2.从中可见,IgY对蛇毒有明显的中 和作用. 表2IgY对蝮蛇蛇毒的体外中和试验(n=20) Tab.2NeutralizingtestinvivoofIgYagainst AgkistrodonHalys(AH)venom Vscontro1.…尸<0.005 3讨论 从免疫鸡的蛋黄中提取蛇毒抗体的方法与从经 蛇毒抗原免疫的马,羊等动物的血液中获取蛇毒抗 体的传统方法相比,具有较大的优越性:?高产 性:鸡经免疫10天左右,即在蛋黄中产生抗体,约 20天达到高峰,蛋黄中的抗体一旦达到高浓度,不 再加强免疫,也可持续很长时问,从而可免除周期性 的加强免疫,如再继续免疫加强,一般能获得高产的 特异IgY,效价可维持9,28周;?经济性:在相同 免疫时间内,从一只鸡所生的鸡蛋中所提取的抗体 远远超过一只兔血清制备的抗体量,每只鸡一个月 约可提取IgY65mg.?IgG纯度高:蛋黄中仅有 IgG,而无IgM和IgA,因此,便于纯化蛋黄中IgG抗 体;?减少过敏反应:IgY特异性好,不激活补体,不 与类风湿因子结合;?鸡对很多病原微生物均有天 然抵抗力,在饲养,管理方面较为经济,方便.?免 疫方法简单,分离过程较适于将来进行大规模商品 化生产. 本文用沉淀法从鸡蛋黄中提取蛇毒抗体,并对 IgY进行了药效学评价,体内实验和体外中和实验 的结果证明了该法所获得的蛇毒抗体IgY可用于救 治受蛇毒侵害的小白鼠,因而,蛇毒抗体IgY有良好 的进一步研究前景. 参考文献 [1]LoekenMR,eta1.Antibodiestothealpha-submitofinsulin receptorfromeggsofimmunizedhens[J].Immunology, 1983,49(1):21. [2]LarssonA,eta1.Determinationofcirculatingimmune complexesbychickenanti-humanC3andanti-humanCl. microELISA[J].JImmunolMethods,1988,113(1):93. [3]那红,杨曜中,袁勤生.鸡卵黄免疫球蛋白的研究进展 [J].中国生化药物杂志,1997,18(3):151—155. [4]王德春,等.蛋黄免疫球蛋白制备和应用研究进展[J]. 国外医学?临床生物化学与检验学分册,1995,16(1): 22—24. [5]杨德,王道若.两种鸡蛋黄IgG提取方法的对比研究 [J].华西医科大学,1990,21(3):263—266. (收稿日期2002—04—12) (下转第23页) 9