单增李斯特菌选择性增菌培养分离的初步探讨

单增李斯特菌选择性增菌培养分离的初步探讨 单增李斯特菌选择性增菌培养分离的初步 探讨 854中国卫生检验杂志2007年5月第l7卷第5期ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,May2007;Vol17No5 【微生物方法】 单增李斯特菌选择性增菌培养分离的初步探讨 吴瑞英,黄宝明,梁均和 (广东省江门市疾病预防控制中心,广东江门529000) [摘要]目的:寻找一种良好的增菌培养分离法,提高食品中单增李斯特菌(Lm)的检出率.方法:对Fraser肉汤增菌法 进行改良,在白行配制的第一液Half—Fraser肉汤中添加氯霉素,观察其对Lm及蜡样芽孢杆菌(丑cereus)的影响,确定 加人氯霉素的最佳适宜量.160份样品同时采用改良Fraser肉汤法,FDA法,国标法增菌培养后,用传统生化鉴定Lm,比 较检出率.结果:在Half—Fraser肉汤中添加3.0g/,ml氯霉素不会对样品中的Lm产生明显的影响,但可有效抑制 最cereus的生长.3种增菌培养法以Fraser肉汤增菌法总检出率最高,尤其对速冻食品的检出率达100%,FDA法对灭菌 食品的检出率达100%.结论:Half—Fraser肉汤氯霉素的最佳添加量为3.0g/,ml.不同样品类型要用不同的增菌法, 必要时用2种以上方法相结合,提高食品中Lm的检出率. [关键词]单增李斯特菌;选择性增菌培养分离;探讨 [中图分类号]R378.994[文献标识码]A[文章编号]1004—8685(2007)05—0854—02 lsolationandcultivationofListeria WuRui—ying,HuangBao—ming,LiangJun—he (JiangmenCenterforDiseaseControlandPrevention,Jiangmen529000,China) [Abstract]Objective:Tofindoutagoodmethodforisolatingandculturingandtoincreasethed etectingrateoftllePCRrapid detectionontheLminthefood.Methods:Developingfrasers,addingchloramphenicalinthefirstliquid(self—made)一Half—Fra— ser,obsel3leitsinfluenceontheLmand且 cerell~anddecidethemostappropriateamountofchloramphenico1.In160samles,weall adoptedtheimprovedfraser,FDA,internationalculturing,andthenexaminetheLmwiththePCRandcomparethedetecting rate.Results:ThereWasnoinfluenceobviousontheLmoftheHalf— FraseranditCaneffectivelycontrolthegrowthof且cereus.In thethreemethodsforculturing,thehighesttotaldetectingrateWasinthefraser,espsciallythatonthequick—freezedfood.Thede— tectingrateWasupto100%andthedetectingrateonthesterilefoodtestedbyFDAWasalsoupto100%.Conclusion:Themostap- propricteamountofchloramphenicolintheHalf— Fraseris3.0g/m1.Differenttypesofsampleneeddifferentculturingandonee-- yenneedstwoormorethantwomethodswhennecessarytoincreasethedetectingrateofLminthePCRrapiddetection. [Keywords]Listeriamono~ogenes;Chosenisolatingandculturing;Exploration 单核细胞增多性李斯特菌(Lmonocytogenes,Lm)是一种 重要的人畜共患疾病的病原体,因其在4~C能生长繁殖且感 染该菌后病死率高,因而在公共卫生和食品卫生安全中越来 越受到重视.现有的Lm的快速检测方法有免疫酶染色法, VIDAS全自动荧光免疫法,基因探针法,聚合酶链反应法 等.但由于各种原因,如食品中的Lm数量低于10cfu/g,或 受生产,包装,贮存,运输等条件的影响而导致Lm的毒力缺失 或变异,核糖体退化,酶活性减弱等,均可限制快速检测法在 食品中Lm的检出率.因此要准确检出Lm,就要有效地将样 品中含菌量少的或受损的李斯特氏菌进行增菌复苏.良好的 增菌培养基是提高检出率的重要手段,为找出一种理想的增 菌培养法,我们对Fraser肉汤增菌方法…进行改良,并与FDA 法和国标法进行比较,结果报告如下. 1材料与方法 1.1材料 1.1.1菌株实验用的2株单增李斯特菌标准株由卫生 部食检所提供,4株分离株由本实验室从食品中分离得到,蜡 [基金项目]江门市卫生局课(0411012) [作者简介]吴瑞英(1970一),女,学士,副主任技师,主要从事 微生物检测工作. 样芽孢杆菌(B.cereus)由本实验室保存. 1.1.2培养基单增李斯特菌选择性增菌肉汤(IJB,LB), 单增李斯特菌选择性琼脂平板(MMA),含0.6%酵母膏的胰 酪胨大豆琼脂(TSA—YE)及其肉汤(TSB,YE),均购于北京 陆桥生物技术公司.单增李斯特菌增菌肉汤(LEB),含5% 兔血李斯特菌琼脂(LMBA),参照FDA方法和Martin?的 选择性复苏试剂盒自行配制.Fraser肉汤增菌法以Half—Fra— ser肉汤为第一增菌液,由本实验室配制,Fraser肉汤为第二增 菌液由梅里埃公司提供.MMA分离培养基由北京陆桥商检 技术公司提供.鉴定试剂三糖铁,半固体及系统生化培养基 (MR—VP试验,硝酸盐还原试验,过氧化氢酶试验,甘露醇, 鼠李糖,七叶苷,溶血试验,协同溶血试验)由本实验室依据 GB478930—94配制. 1.1.3化学试剂吖啶黄,萘啶酮酸,放线菌酮,七叶苷,均购 于北京陆桥生物技术公司;丙酮酸钠,巯基醋酸钠购于佛山化 学试剂公司;氯霉素购于珠海银科生物技术研究所. 1.1.4样品各类熟食,生肉,速冻食品,盒装消毒奶由公卫 科到各大市场采样. 1.2方法 1.2.1Fraser肉汤的优化试验 1.2.1.1氯霉素对李斯特菌(以Lm为指标)及B.cereus的抑 菌作用:将Lm标准菌株(或分离株)和B.cereus分别接种于自 中国卫生检验杂志2007年5月第l7卷第5期 ChineseJournalofHealthLaboratoryTechnology,May2007;Vol17No5855 行配制的第一液Half—Fraser肉汤培养液中,调整细菌浓度为 10efu/ml左右,将150trl混有细菌的肉汤分别加入到96孔 反应板中,分别加人20l各种浓度(100,10mg/L)的氯霉 ,1mg/I,30~C培养24,48h,每隔4h 素使其最终浓度为10 于酶标仪上测0D49o值,试验同时设不加抗生素的阳性对照和 不加细菌的阴性对照.根据上述结果确定加入氯霉素的最佳 适宜量以改善Half—Fraser液对杂菌的抑制作用. 1.2.1.2增菌效果试验:将Lm标准菌株接种于改良的Half — Fraser肉汤中,调整菌液浓度为10.efu/ml,把20l混有细 菌的肉汤加到96孔板中,并做10倍递减稀释,使其最终浓度 为10,10cfu/ml,30oC培养12,48h,每隔4h观察1次结 果,根据李斯特菌能水解七叶苷生成葡萄糖和七叶素与二价 铁离子反应生成黑色化合物这一生化特性,判断肉汤变黑为 阳性. 1.2.2样品中单增李斯特氏菌的分离鉴定 1.2.2.1样品处理:25ml(或25g)样品,液体摇匀直接加入, 固体于无菌搅拌器中搅拌均匀后加到225ml增菌肉汤中(详 见1.2.2.2增菌方法). 1.2.2.2增菌方法:对同一样品同时用3种方法进行增菌培 养:?国标法:先将样品加到LB肉汤中30~C培养24h,取出 0.1ml加入10mlLB增菌液中进行二次增菌,48h后接种到 MMA琼脂.?FDA法:样品加到LEB肉汤(含0.25%丙酮 酸钠和0.01%巯基乙酸钠)中30?预增菌8h,加人选择性 试剂Y啶黄,萘啶酮酸,放线菌酮,30~C培养24,48h,将增菌 肉汤接种到LMBA琼脂.?改良的Fraser增菌法:样品直接 加入到改良的half—Fraser肉汤,30?培养12h,后取增菌液 0.1ml加入到Fraser肉汤中,30~C培养24h见黑色后将肉汤 转种到MMA琼脂. 1.2.2.3鉴定:挑取可疑典型菌落,分别进行革兰染色,显微 镜下观察动力及传统生化方法鉴定. 2结果 2.1氯霉素对Lm和丑cereus的抑菌作用 结果显示,在30~C培养10h后添加大于4.0mg/L氯霉 素的Half—Fraser肉汤中,Lm标准菌株和分离菌株均受到明 显的抑制,但20h后含4.0mg/L氯霉素的Haft—Fraser肉汤 中Lm标准菌株和分离菌株有明显生长,吸光度A分别为 0.213,0.195,Lm分离菌株在含5.0mg/L氯霉素的Half— Fraser肉汤中亦有明显生长,A为0.148,添加氯霉素浓度小 于3.5mg/I的Haft—Fraser肉汤中Lm标准菌株和分离菌株 在10h培养后的A4帅分别为0.223,0.198,在20h培养后A 分别为0.420,0.391(阴性和阳性对照A分别为0.09,0.31 左右),这说明在4.0mg/L以下浓度的氯霉素会延长Lm的生 长速度,但不会抑制其生长,而B.cereus对于氯霉素十分敏感, 不同添加浓度培养时间的A均小于0.08. 2.2改良的Fraser肉汤对单增李斯特菌和&cereus增菌效果 分别在Half—Fraser肉汤中添加2.5,3.0,3.5~g/ml的氯 霉素,含3.5g/ml的氯霉素的Half—Fraser肉汤可以使 10efu/ml以上浓度的单增李斯特菌在48h内呈阳性,而 &cereus的浓度则要在104efu/ml以上才显阳性;含 3.0m】氯霉素的Half—Fraser肉汤可以使10cfu/ml以上 浓度的Lm标准菌株和分离菌株在48h内呈阳性,而B.cereus 的浓度则要在10efu/ml以上才显阳性;含2.5g/ml的氯霉 素的Half—Fraser肉汤可以使10.efu/ml的Lm标准菌在48h 内呈阳性.说明在Half—Fraser肉汤中添加3.0g/ml的氯 霉素不会对样品中的Lm产生明显的影响,并有效抑制 B.cereus的生长o 2.3FDA法,国标法和改良Fraser肉汤培养法对不同样品单 增李斯特菌的检出结果 改良的Fraser肉汤培养法对食品样品的总检出率最高,尤 其是对速冻食品的检出率达到100%,对消毒牛奶,熟食及生 猪肉的检出率也分别达到75.0%,80.0%,66.7%;FDA法对 食品的平均检出率为77.8%,对灭菌食品的检出率最高,达 100%;而国标法对各类食品的检出率均低于FDA法和改良的 Fraser肉汤培养法(见表1). 表1不同增菌法对不同样品的单增李斯特菌检出率(%)的比较 ()内为检出率 3讨论 由于蜡样芽孢杆菌和单增李斯特菌同属革兰阳性需氧杆 菌,在营养要求上有很多共通点,蜡样芽孢杆菌广泛分布于 水,土壤,尘埃,淀粉制品,乳及乳制品等食品中,该菌对外抵 抗力较强,在食品检测过程中常成为主要的杂菌.单增李斯 特菌和蜡样芽孢杆菌对氯霉素都较为敏感.选用蜡样芽孢杆 菌作为对照菌,通过反复试验摸索氯霉素加入的有效浓度是 非常必要的. 本文对Fraser肉汤增菌法进行改良,实验结果表明,在其 中自行配制的第一液Half—Fraser肉汤加入3.0g/ml的氯 霉素可以有效地抑制蜡样芽孢杆菌等杂菌的生长,而不会对 Lm产生明显的影响,可以检出1,10efu/ml浓度的Lm菌,通 过与FDA法和国标法相比较,改良的Fraser肉汤培养法对各 种食品Lm的总检出率明显高于国标法,同时也略高于FDA 法.在第二增菌液Fraser肉汤是否需要添加氯霉素,还有待日 后探讨. 本试验结果显示,3种增菌法以改良Fraser肉汤培养法对 速冻食品中的单增李斯特菌的检出率最高,FDA法对消毒食 品(如经巴氏消毒的盒装奶)的检出率最高,这说明Fraser肉 汤培养法对速冻食品中的Lm增菌效果显着,而FDA法对于 消毒食品中受损的Lm的修复效果更明显.提示我们在实际 检测中,不同的食品类型,要用不同的增菌法,必要时可用2 种以上的方法相结合,以提高Lm菌在快速检测中的检出率. [参考文献] [1]温瑞荣,符振华,王少明,等.VIDAS自动免疫分析系统快速检测 食品中的李斯特氏菌[J].中国卫生检验杂志,1999,9(1):49. [2]AnthonyDH.Bacteriologicalanalyticalmanual[M].8thEdilion.Revi— sionA,1998.Chapter10. [3]LainMartin,StanleyE.RapiddeterminationofL/ster/amonocytogene~ infoodsusingaresuseitation/selection/kitsystemdetection[J].J AOACInternational,1993,76:632—636. (收稿日期:2006一ll—l4)