褐腐真菌产生的羟基自由基HO_对纤维素作用的研究_cropped

褐腐真菌产生的羟基自由基HO_对纤维素作用的研究_cropped 菌 物 系 统 21;3,,400~405, 2002 Mycosystema ,HO褐腐菌统生的统基自由基真 ?统统统素作用的究研 1,21**11王蔚 高培基 段新源 统彩云 1 2 ;山统大微生物技统家重点统统室 学国 统南 250100 ; 统南大化统境工程院学学与学 统南 250002 , 摘 要,由褐腐菌的典型菌株真——密粘褶菌 Gloeophyllum trabeum 的胞外培统液中分统化离3+得到一能统原 Fe～统生统基自由基 HO?的多统统分;称作 Gt 因子,。 采用 HO?特性 异的 抑制统硫统～统 Gt 因子统生的 HO?在统统素降解中的作用统行了统照究～统果表明 研Gt 因子及其 统生的 HO?在统统素降解中起着重要的作用～统褐腐菌 HO?化降解统统素 氧机制假统的立提确 供了一些依据。 统统统,密粘褶菌～统统素～HO?化机制～硫统氧 中统分统,号Q939.96文统统统,献A文章统,号1007-3515;2002,03-0400-0405 褐腐菌是自然界降解木材的主要菌真～能统在木材中的木素部分基本不降解的情下它况,有效地分解统统素。 管褐腐菌降解统统素的能力强～但却不具有水解统统素的统晶 尽很它区至统重要的外切统统素统;Highley, 1988,。 褐腐菌如何统统统统素的降解启至今仍未搞 2+ 清。 自 60 年代～Halliwell;1965 ,统统 F enton’s 统统 HO/ F e统生的统基自由基2 2 HO?具有强的统统素降解能力后～人统推极统 HO?化机制可能是褐腐菌在统统素降解初 氧期的一个重要机制～且有低分子量的能穿统植物统胞壁的小分子物统在 HO?的形成中起主 Koeigs,1974; Jellison et al., 1991Enoki et al., 1992; Enoki et al., 1997; Goodell et al.,要作用;～ 1997; Zohar et al., 1999; Xu & Goodell, 2001,。 统然目前有统于介统 HO?生成的低分子量物统— 糖统和统酚、统统化合物的统道(Enoki et al., 1992; Enoki et al., 1997; Goodell et al., 1997;Zohar et al., 1999; Xu & Goodell, 2001)～但主要集中于活性小分子物统的分统化、离性统及HO?统生的究～缺少直接的统据表研明 HO?统统素降解之统的统系～外与另～HO?存 在的普遍性也有待于统明。 因此～褐腐菌中 HO?化降解统统素机制的立仍然需要统一 氧确步的究研。 本文在究多株褐腐菌普遍统研生 HO?的基统上(王蔚等～1997)～以密粘褶菌统例～采用 HO?特性的抑制异统硫统～统—— HO?统统素降解之统的统系统行了究～统褐腐菌中 与研HO?化氧降解统统素机制的立提供了一些有力的统据。确 , 39970004 国学家自然科基金统助统目;,**通统统系人 E-mail, gaopj@sdu.edu.cn 2 -0 1 -16 ～收修改稿日期,200 2 -0 2 收原稿日期,200 -29 1 方法与 1.1 材料 1.1.1 菌株,密粘褶菌 Gloeophyllum trabeum CFCC 7047 由中林统科院林统科所提供。国学研 1.1.2 主要统统,2-脱氧-D-核糖、统统二糖、统甲基统统素统;CMC-Na,、硫代巴比妥酸统;TBA,均统 Sigma 统品,其统统硫统、甘露醇、二甲统统它(DMSO)等均统统分析统。国 1.2 方法 1.2.1 培统基及培统方法: 无机统培统基(w/v): 含 0.15%的 KHPO～0.05%的 MgSO; 0.05% 的24 4 ;NH,SO～0.01%的 CaCl; 0.001%的 MnSO ; 0.001%的 FeSO. 60 ml 的无机统培统基装 42 4 2 4 4 入 250 ml 的统杯中～加 1.5%的统脂～5 统统布覆盖统杯口～统菌。待培统基凝固后～在其表 面放置无菌的统木片(1.5×1.5 cm)～接统生统在土豆培统基上的菌统统,28? 恒置培统温静 28d。 培统 28d 后～用醋酸统液冲;0.02 mol/L, pH 4.8,浸泡培统基～抽提 4 h～抽提的胞外培 统液统 10000 r / min 离清心取上液。 1.2.2 TBA 法统定 HO?的生成;Halliwell & Getterridge, 1985 ,: 1 ml 含 2-D-核糖脱氧;4 mmol / L,、统统二糖;0.8 mmol/L,、FeCl;0.1 mmol/L,的统酸统檬冲液;0.05 mol/L 3 pH 5.5,与 1 ml 统品混合～30?振统反统 1h,加入 1 ml 硫代巴比妥酸;TBA～1%～用 0.05mol / L NaOH 溶液配制,和 1 ml 三统乙酸;2.8%,, 100?加统反统 15 min,冷却后于 532 nm 统光吸 532 nm HO收, 下的吸收表明有 ?的生成。 1.2.3 CMC-Na 溶液粘度的统定,统品溶液等统将与体的 4%的 CMC-Na 溶液混合～50?保温 一定统统后通统统定溶液流统奥来氏粘度统的统统的统化相统地统定 CMC-Na 溶液粘度的统 化和表征其解聚的统生。 1.2.4 统统化统法统统统素底物统原力的统统(Halliwell, 1961): 向棉花统统素粉中加入 3 ml蒸统水～再加 1ml 统化物-碳酸统溶液;0.064% 统化统与 0.52% 碳酸统,和 1 ml 0.05% 统统化统溶液～沸水浴 15 min,冷却 5 min,加入 2ml 统统-磷酸统统统色～600nm 下统定光吸收。含统品棉粉的溶液统照与棉粉的溶液在 600nm 下吸收的差统可代表统品棉统统统原末端的增加。 1.2.5 循统伏安法;CV,统定统统素底物活力统分之统的统化反统与学: 三统系～统和 甘极体极参汞统统统比统极～Pt 统统统统助统极极～ 统统微统统工作统碳极极～统描统统范统统 –0.4,0.6 V, 统描速度统 50 mV。 以含统统素底物(0.2 m mol/L) 的 KCL 溶液;0.5 mol/L,统 参照, 统统加入活力统分及 HO?的抑制统后循统伏安统统的统化。 所用统器统上海辰统统 器公司生统的 CHI 800 型统化分析统。学 1.2.6 统统素聚合度(DP)的统定: 采用统乙二法统定;胺研北京造统工统究所～1981,。1.2.7 原子力统微统;AFM,统脂脱棉统统的统察: 挑取几剥离根自然干燥的棉统统于新统的 云母表面上～云母用面粘双胶在 AFM 统器配统的统片上。 所用统器统 Nanoscope III 型原 子力统微统～统描模式统统敲模式～统描统率统 0.6 ~ 0.8 Hz。 21 卷402菌 物 系 统 2 统果统统与 统 11 株褐腐菌统生 HO?的普适性究的统果表明研, 在褐腐菌的胞外培统液中均存在低 分子量的、能统生 HO?的活性统分(王蔚等, 1997)。 在缺乏外切统统素统的情下况, 此统 活性物统的大量存在可能有其必然性。 故以密粘褶菌统例, 统此活性统分统行分统离化, 最 统通统 HPLC 得3+到了统的活性多统(称作 Gt 因子)(王蔚等, 2002b)～统统其能统原 Fe～统生 HO?～统其在统统素并降解中的作用统行了初步究研(王蔚等, 2002a)。统了统一步统明 Gt 因子及其统生的 HO?统统素与降解之统的统系,采用添加 HO?特性的抑制统的方异法,统 Gt 因子及其统生的 HO?在统统素降解中的作用统行了比统究。研 2.1 HOGt HO各统 ?特性的抑制统统异 因子统生的 ?的抑制效统 TBA 反统是常用的 HO? 的统定方法～2-脱氧-核糖被 HO?化生成氧与丙二统～丙二统 TBA 反统生成的统物在 532 nm 统有特征吸收～光吸收统统基自由与基 HO? 的量在一定 范统内有统形统系;Halliwell & Getterridge, 1985,。 统统定, Gt 因子具有明统的 TBA 反统,1 ml Gt 因子;1 µg/ml,按 1.2.2 振统反统 1 h, OD= 0.660 。 因 TBA 反统中统得的 HO?往 532 往需要加入 HO?特性的抑制统统统～异来故统统中加入了硫统等抑制统～各统抑制统统 Gt HOGt HO因子统生的 ?的抑制效统如表 1 所示～抑制统统的统果统统了 因子可统生 ?。由表 1 知硫统统 Gt 因子统生的 HO?具有最大程度的抑制,故下面的抑制统统中均采用硫统作 统抑制统。 表 1 各统 HO?的抑制统统 TBA 反统的抑制作用 Table 1 Inhibition of TBA activity by HO? inhibitors HO?的抑制统;10 mmol/L,TBA 活性(%)HO?的抑制统;10 mmol/L,TBA 活性(%) HO? inhibitorHO? inhibitorTBA activity(%)TBA activity(%) 硫统100 62 统照 *ThioureaControl 二甲统统甘露醇 84 88 MannitolDMSO 乙醇 1 00异丙醇96 isopropanolEthanol 1 ml 不加任何抑制统的 Gt 因子;1 μg/ml,的 TBA 反统的 OD作统 100 %以532 2.2 Gt 因子统生的 HO?统 CMC-Na 溶液粘度的影响- 4 3+1 ml Gt 因子;1ìg/ml,、10mol/L Fe与 1ml 4% CMC-Na 溶液50?保温 30min 后,CMC-Na 溶液的粘度明统降低, 流统粘度统的统统由 110s 降统 64s, 反映了 CMC 糖统的苷断裂。 但反统系中未能统统到统原糖的统生～统体明 Gt 因子统 CMC 的作用是不同于切统 内统素统统 CMC 的水解机制的。如果反统系中加入体硫统;10 mmol/L,～统 CMC-Na 溶液的 粘度的下降程度明统降低～流统粘度统的统统由 110s 统统 87s～表明 Gt 因子是藉 HO?化 氧径来途统致 CMC 糖统统苷断裂的。 2.3 Gt 因子统生的 HO?统统统素底物统原力的影响 统统化统法可统统不溶性的统统素材料的统原末端～非常敏灵。Gt 因子统统素与温数没底物保 天～有统原糖的统生～但统统统化统法统统～统统素底物的统原力明统增加～表明统 统末端数目有明统的增多。2 4 -3+ml Gt 因子(2ìg /ml)、10mol/L Fe与 20mg 脱脂棉粉在 45?下 振统作用 5 d 后～OD600 =0.694～而如果添加硫统～OD= 0.458～明统低于不加硫统的棉统 统系体～统统了 Gt 因子统生的 600 HO?统不至于统致统统素糖统的苷断坏裂～但以某统形式破 了统统素的统密统构～如破坏统统～使统统素暴露出更多的统原末端～有利于统一步被降解。2.4 Gt 因子统统统素底物作用的统化分析学 在 TBA 反统中～统统 Gt 因子能以统统素底物统统子供形体成 HO?～Gt 因子统统素 与底物统有氧化统原反统的统生。采用循统伏安法统可溶性的统统素底物中加入 Gt 因子后的统 化统行了统统～统果如统 1 所示。统 1;a,中的统合曲统 1 统统统二糖的 CV 统统～曲统 2 统加入 Gt 因子后的 CV 统统～统中可统加入 Gt 因子后统流有明统的升高～而如果加入 Gt 因子的同统加入硫统～CV 统统统化不大;统 1;b,,。因硫统统 HO?特性的异学消除统～循 统伏安统化分析的统果表明 HO?在 Gt 因子统统统素的作用中起着重要的作用。因系中 体不可避免地存在统于 3+3+HO?的形成至统重要的 Fe, Gt 因子统统 Fe的统原～统而形成 HO? 是可能的～硫统抑制反统的统果更是统明了系中体 HO?的形成。 Potential / V (a) 统 1 统统二糖溶液加入 Gt 因子后的循统伏安统统 Fig.1 Cyclic Voltammograms of cellobiose and Gt factor (a) 1. Reference: KCL solution containing cellobiose; 2. Gt factor added; (b) 1. Reference: KCL solution containing cellobiose; 2. Gt factor and thiourea(10 mmol/L)added2.5 HO?的抑制统统密粘褶菌培统统程中菌生统及统统素降解的体响影 在密粘褶菌的培统起始统～如果培统基中添加硫统;10 mmol/L,～统菌的生统明统体受 到抑制培统 10 天后～仍不统菌统大量蔓延到木片上～而统照统不加硫统的培统中～密粘 瓶褶菌生统良好～菌统已覆盖到整个体与碳木片上～统始利用统统素。菌的生统统统源物统的利 21 卷404菌 物 系 统 并改在培统统行 10 天后向统统上统硫统～培洒统 25 天后统止培统～取出统统统定失重及统统聚合度的统化～统果如表 2 所示。 表 2 HO?的抑制统统密粘褶菌培统统程中统统素降解的影响 Table 2 Effects of HO?-inhibitor on cellulose degradation during incubation of G.trabeum 统统失重;%,统统素聚合度的下降;%, Weight loss of filter Decrease of paperDP 不加硫统的统照统42.540 Control 培统统程中添加硫统33.327 Thiourea added during incubation 由表 2 可以看出～培统统程中加入硫统的统统统统统统素底物的利用明统低于不加硫统的统照统～表明 HO?的了统统素的降解且有可能在降解初期起着至统重要的作用确参与极。统然在密粘褶菌的胞外培统液中统统到了切内葡聚糖统、β- 葡萄糖统的存在～但却有苷没 统统到外切葡聚糖统。 是否在缺乏外切葡聚糖统的情下～况Gt 因子在统统素的降解中具有 象外切葡聚糖统那统统足统重的地位, 将密粘褶菌的胞外培统液用截留分子量统 5 KD 的超统膜超统～然后含有统统素统统 将分的分子量 >5 KD 的统液部分 50?下作用棉统统 6 天～无统原糖的统生～在 AFM 统察统 片的高度象;Height image,和相位象(Phase image)中～统照与相比～棉统统基本无统化;统 略,～而统分子量 <5 KD 的 Gt 因子作用统的棉统统却有明统的统化～统统的统向和横向上 都有一些明统的统隙和裂痕;统略,。 统合以上统统统果分析～统然褐腐菌的胞外统液中所含的切内葡聚糖统和β- 葡萄糖 统可能苷参与了统统素的统底降解～但 AFM 的统察统果表明～统统统素统统分统统统素基 靠本无作用。硫统统 HO?的抑制统统统果表明～Gt 因子统生的 HO?统统统了统统素的降 确参与解。HO?具有强的化性～很氧可化统统素的氧体葡萄糖统上的统基统统基～从而统致统统素 统和统统统统的内断裂(Uchida & Kawakishi, 1988)～使统统素的统构疏松～统统一步的统水 解作用提供条件。此外～我统目前利用统子统磁共振;EPR,技统正在统行 HO?形成机制 3+2+– . 的究～研EPR 研究的统果表明～Gt 因子统原 F e统 F e～统统了超氧离统统子自由基 O 的22+ . –形成～并引统统一步形成 HO。HO与统原了的 Fe 以 Fenton 反统的形式统生 HO?。O22 22 2和 HO?的 ESR 信号的统出更是统一步统统了 Gt 因子形成 HO?的能力和 HO?形成的途径～统褐腐菌中低分子量多统及 HO?的化降解统统素机制的立提供了参与氧确理统上的支持。 [参 考 文 献] 王蔚, 统雪梅, 高培基,1997. 褐腐菌统生的低分子化合物统统统素的解真研聚作用究. 菌物系统, 16 (1): 40~4 5王蔚, 胡统, 高培基, 2002. 密粘褶菌 Gloeophyllum trabeum 胞外低分子量多统的分统化离、部分性统和形成统基自由基 HO ?的究研. 中生物化分子生物统国学与学, 18(2): 2 02~208 北京造统工统究所～研1981. 造统工统的化分析学. 北京: 统工出版社. 121~129 Enoki A, Hirano T, Tanaka H, 1992 . 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FEBS Lett, 446: 49 ~54. evidence EFFECTS OF HYDROXYL RADICAL HO?ON CELLULOSE DEGRADATION BY BROWN -ROT FUNGI1,211 1WANG WeiDUAN Xin-YuanSUN Cai-YunGAO Pei-Ji 1(State Key Laboratory of Microbial Technology, Shandong University, Jinan 250100) 2(School of Chemical and Environmental engineering, Jinan University, J inan 250002)ABSTRACT: A peptide(named Gt factor) was isolated from the extracellular culture of Gloeophyllum 3+ 2+ trabeum, the typical brown-rot fungus. Gt factor could reduce Feto Feand mediated the production of HO? Effects of HO?on cellulose degradation was comparatively studied with thiourea used as HO?- specific inhibitor. All results showed that HO? produced by Gt factor did have some effects on cellulose degradation, it provided some evidence of HO?be involved in oxidative mechanism of cellulose degradationby brown-rot fungi. KEY WORDS: Gloeophyllum trabeum, cellulose, HO?-involved oxidative mechanism, thiourea