HPLC分离和测定香梨三种植物激素

新 疆 农 业 大 学 学 报 2000, 23( 1) : 54~ 56 Journal of Xinj iang Agricultural University 文章编号: 1007-8614( 2000) 01-0054-03 HPLC分离和测定香梨三种植物激素 郑春霞, 王 强, 阮 晓 (新疆农业大学环境系,乌鲁木齐 830052) 摘 要 本研究探索用高效液相色谱法, 测定吲哚-3-乙酸、脱落酸、赤霉素三种植物激素的条 件,建立了从植物果实中提取三种激素的方法。 关键词 香梨 高效液相色谱 中图分类号 S66117601 1 文献标识码: A 香梨采前、采后、贮藏及衰老等生命活动,是受植物体内的内源激素所调节的,因此搞清 植物内源激素的变化规律,对香梨采后生理的研究非常重要。植物激素在植物体内含量甚 微,而且存在着大量的干扰测定的物质, 给提取、分离和定量分析带来一定困难112。我们采 用反相液相色谱法, 对香梨中吲哚-3-乙酸( IAA)、脱落酸(ABA)、赤霉素( GA)三种植物激素 同时进行分离和测定,具有较高的灵敏度和选择性12, 32。 1 仪器与方法 LC-6A高效液相色谱系统(日本岛津) ; UV-250型紫外可见分光光度计(日本岛津)。 GA, IAA, ABA标样均为 FLURA 产品, CH3CN, CF 3COOH 均为色谱纯,水为超纯水。 准确称取香梨果肉 2 g,加入 10 ml 0. 5 mol#L- 1NaOH 溶液, 离心 10 min后,取上清液, 并在等体积的乙酸乙酯下萃取三次,每次离心 10 min, 且中间水相, 用 1 mol#L- 1 HCl调至 pH= 2。合并酯相,减压蒸馏,定容至 50 ml,并取 10 Ll样品入HPLC 分析142。 2 结果与讨论 2. 1 条件选择 2. 1. 1 色谱条件 流动相 A液为 CH3CNBH 2O( 1B9 V/ V)混合液,其中内含 0. 2% CF 3COOH, pH= 3。流 动相 B液为 CH3CNBH2O( 6B4 V/ V)混合液。流速 1. 5 ml#min- 1, 泵压 1. 92 MPa。检测波 长 250 nm, 分析样品采用二元梯度参数。 采取流速为1 ml#min- 1,泵压 1. 28 MPa,按二元梯度参数, 只能分离测试单独的某种激 素, 不能同时分离出三种激素。经过反复试验 , 我们将二元梯度加大 , 由原来的2 0min 收稿日期: 1999- 06- 23 B. CONC 45%, 改为 14 min时,就将 B. CONC提到 45%。加大流速,使出峰时间提前。在 20 min之前三种激素全部分离出来, 从 22 min时开始冲洗,采用保留时间定性, 外标法定 量12, 52(见 1)。 1. GA 2. IAA 3. ABA 4. CH3CN 图 1 三种激素和乙腈的吸光度值 表 1 色谱条件 T IME FUNC VALUE 0. 01 B. CONC 10 14 B. CONC 45 22 B. CONC 60 25 B. CONC 60 25. 1 B. CONC 10 2. 1. 2 波长选择 对于 40 Lg#ml- 1的三种植物激素 溶液, 分别在紫外分光光度计上进行光谱扫 描,三种激素最大吸收分别为: GA 250 nm , IAA 275 nm, ABA 245 nm。而溶剂 CH3CN 却在 200 nm处为最大吸收。但在 250 nm 处条件下, CH3CN 最大吸收保留时间为 30 min, 而三种激素在该波长下 21 min之前出峰完毕。经反复在 200, 250, 270, 300 nm 不同波长条 件下试测,决定以 250 nm 为分离、测定三种激素的最佳波长。 图 2 三种激素标准溶液色谱图 图 3 香梨中三种激素的色谱图 2. 1. 3 流动相的用量 采用不同浓度 CH3CN溶液分离三种激素, 发现随着 CH3CN 溶液浓度增大, 三种激素 保留时间增加。当 CH3CNBH 2O> 6B4时, GA, IAA, ABA不能分开。当 CH 3CNBH 2O< 1B9 时,保留时间随着 CH3CN 比例减少而迅速增加,也不便分离。流动相A 液中 CF 3COOH 的 含量对分离三种激素保留时间灵敏度影响不大,选择 0. 2% CF 3COOH 溶液, 使A液的 pH= 3,显酸性, 即能保证 GA, IAA, ABA完全分离, 又避免酸度过大会损害色谱柱添料。综合考 虑定为: A液为10% CH3CN 溶液,并用 0. 2% CF 3COOH 调至 pH= 3。B液为60% CH3CN 55第 1 期 郑春霞等: HPLC 分离和测定香梨三种植物激素 溶液。采用二元梯度洗脱,此时三种植物激素能很好的分离,且干扰小(图 2, 3)。 2. 2 回收率 回收率的测定:在用本方法测得已知含量的样品中,加入一定量的标准品, 按上述条件 进行色谱分析, 回收结果为: GA 为 79. 5%, IAA 为 87. 6%, ABA为 83. 1%。 参 考 文 献 1 Brenner M . L. Am. Rev. Plcuat Physiol. 1981, 32: 511 2 李金昶, 石晶,赵晓亮等1 分析化学, 1994; 22( 8) : 801~ 804 3 Withenop. K M . Look SA, Seasko. M W, J. Lig. Chromaeogr , 1989, 12( 11) : 2117 4 分析化学手册(第四分册) . 色谱分析.北京: 科技出版社, 1980 5 Zahradnickova H, Marsalek B, Polisenska M . J. P lanar Chromateogr. Mod. TLC, 1990, 3: 243 Three Kinds of Botanic Hormones Fragrant Pear in Xinjiang are Isolated and Tested With HPLC Zheng Chunx ia, Wang Qiang, Ruan Xiao ( Department of Environmental Sciences) Abstract To ident ify and measure plant hormones fast and accutately is of great importance in advanced studies on plant physiolg y and biochemistry. T he paper was concerned w ith the cond-i t ions to determine Gibberellines acid. Indole-3-Acotic Acid and Abscisic Acid by HPLC. A method of ext ract ing the three kinds of plant hormones in plant fruits w as established. Key words plant hormones; determinat ion; high performance liquid; chromatog raphy 56 新 疆 农 业 大 学 学 报 2000 年