牙髓干细胞研究进展

牙髓干细胞研究进展 牙髓干细胞研究进展 342中美容医学2011年2月第20卷第2期 ChineseJournal0fAestheti(?Medicine.Feb.2011.V01.20.N【1.2 牙髓干细胞研究进展 Researchprogressesofdentalpulpstemcells 张兆强,刘亚蕊综述,张清彬审校 (广州医学院口腔医院口腔颌面外科广东广州510140) 高度增生能力和多相分化 干细胞是一类具有自我更新, 潜能的细胞,能够产生高度分化的功能细胞,包括胚胎干细 胞和成体千细胞.目前,已在体外成功地扩增出人体多种组 织的成体干细胞,自从2000年Gronthos等发现人牙髓组 织中存在成体T细胞即牙髓干细胞(dentalpulpstem cells,DPSCs)后,近十年来国内外学者对牙髓干细胞的培 养,生物学特性,细胞型,分化能力及重组为诱导性多潜 能_f细胞(inducedpluripotentstemcel1S,iPSCs)等方 面己进行了大量研究,本文就牙髓干细胞的研究现状综述 如下. 1DPSOs的发现和生物学特性 牙髓是结缔组织,位于牙齿髓室和根管内,有'定修复 冉生的能力.由于成牙本质细胞是一种终末细胞一旦分化 后就不再分裂,因此普遍认为在成牙本质细胞遭受损伤后, 牙髓内存在的未分化前体细胞可分化为成牙本质细胞,并分 泌细胞基质.但直到2000年,Gronthos等才首次正式提出 DPSCs的概念,把具有克隆形成能力的高增殖率的牙髓细胞 命名为DPSCs,在试验中应用酶消化法对成人第三磨牙牙髓 细胞进行体外培养,并与骨髓基质干细胞(bonemarrow stromaleellS,BMSCs)进行比较,结果表明,这两种细胞具 有相似的免疫表型,但DPSCs具有更高的克隆形成率和增生 率,经体外诱导后能形成分散而高密度的钙化小结,当将 DPSCs与HA/TCP支架共同培养后回植到小鼠背侧皮下,能 观察到类似牙本牙髓复合体样的结构.Miura等发现人 脱落乳牙(stemcellSfromhumanexfoliateddeciduous teeth,SHED)的牙髓巾含有多能干细胞,具有高度增殖和克 隆形成的特性,当将体外扩增的DPSCs和SHED与羟磷灰 石/磷酸二钙(hydroxyapatite/trica1ciumphosphate, ttA/TCP)联合植入免疫缺陷小鼠的皮下时可形成牙本质一 牙髓样结构.Young等分离猪第三磨牙牙胚,制备单细胞 悬液,并接种到可降解的聚合物支架上,植入大鼠肠系膜内 生长20,30周,可成功地构建出牙齿结构,包括含成熟牙 釉质的釉器官,牙本质,成牙本质细胞,髓室,上皮根鞘和成 牙骨质细胞,证实了在猪第三磨牙有上皮和问充质干细胞 的存在. DPSCs在形态上类似人骨髓成纤维细胞集落形成单位 (colonyformingunitfibroblast,CFU—F)口J,大多数细胞 呈长梭形,体积较小.透射电镜下,DPSCs的核呈卵圆形,约 占胞体体积的80%~90%,核仁大而明显,常染色质居中,异染 色质少,分布于核周.胞浆很少,核浆比例大.细胞器较少,核 糖体丰富,这些形态特征也体现了DPSCs的未分化或低分化 状态.自我更新是T细胞的重要特性,Gronthos等从3个 月的原代DPSCs移植物中分离出基质样细胞,存体外培养扩 增后植于小鼠皮下,结果形成牙本质一牙髓复合体样结构. 对形成的牙本质样结构进行免疫组化检测,发现其牙本质 涎蛋白(dentinSialoprotein,DSP)表达阳性,证实DPSCs 具有自我更新能力.多向分化能力也是下细胞的特征之一, 在不同的微环境下,DPSCs可分化为多种细胞,矿化诱导培 养基中,DPSCs能够形成与前期牙本质相似的球状矿化基质并 表达成牙本质细胞特异性标志牙本质涎磷蛋白(dentin Sialophosphoprotein,DSPP)[_l;脂肪诱导培养基中,DPSCs 培养物中出现油红"O"阳性的脂滴,并伴随脂肪细胞特异性的 pparY2和lpl基因表达上调;此外,DPSCs还在mRNA和蛋 白水平表达神经前体细胞和神经胶质细胞的标志:神绎巢蛋 向(nestin)和神经胶质纤维酸性蛋白(g1ialfibril]ary acidprotein,GFAP),这说明体外培养的DPSCs有向神经样 细胞分化的潜能'.其他学者也成功地诱导了DPSCs向成牙 本质细胞,肌管样细胞以及脂肪细胞的分化. 2DPSCs的定位,分离和鉴定 Gronthos等推测DPSCs可能米源于血管周围的微环 境(perivascularniche).Shi等研究发现,DPSCs和 BMSCs存在于它们起源组织的微血管周围.Tecles等-6选取 拔除的根尖孔未形成的第三磨牙分为三组:一组制备累及牙 本质的浅洞,,组制备暴露牙髓的深洞,一组不做处理,分别 观察牙髓内细胞的活化和迁移,结果表明血管周围存在干 细胞.干细胞表面的分子标记是鉴定和研究下细胞功能的重 要手段,目前发现明确的干细胞标记不多,埘DPSCs的标记 物研究也不够深入.Gronthos等Ill应用免疫组化技术研究 DPSCs的表面分子标记,并与B~ISCs比较.结果表明,均表达 与内皮细胞(血管细胞粘附分子1,CD146),平滑肌细胞(a2 平滑肌肌动蛋白),骨细胞(碱性磷酸酶,I型胶原,骨连接 素,骨桥素,骨钙素)和成纤维细胞(III型胶原,成纤维细胞牛 长因子2)有关的分子标记.DPSCs不表达骨基质蛋白,骨涎 蛋白,而在BMSCs为低水平表达.用Northernblotting方 法研究发现DPSCs不表达成牙木质细胞的特异性标记物牙 本质涎磷蛋白(dentinSialophosphoprotein,DSPP),说 基金项目:7'.州医学院青年基金资助项目(编号:2010A34) 通讯作者:张清彬,医学博士,副教授,副主任医师;主要从事正颌外科和颌面创伤的 临床研究与牙齿组织细胞分予生物学基础研究 E-mail:doctorqingbinOhotmail.com 中国荚医学2011年2月第2O卷第2期ChineseJournalotAestheti(?Medk?ineFeb.2011.Vo1.20.N0.2343 明DPSCs处于未分化状态,尚未分化为成熟的成牙本质细 胞.为进一步比较DPSCs和BMSCs的性质,Shi等应用基因 芯片技术研究DPSCs和BMSCs的基因表达情况,发现两者在 人类将近4400个基因表达水平上是一致的,包括表达细胞 外基质成分,细胞粘附分子,生长因子,转录调节因子等的基 因.但同时发现,DPSCs较高表达XVIIIdl型胶原,胰岛素 样生长因子2,盘状结构域酪氨酸激酶,NAD(P)H2维生素 K3氧化还原酶,周期素依赖性蛋白激酶6等;BMSCs较高表 达胰岛素样生长因子连接蛋白27和I.2型胶原.Liu等 研究发现,DPSCs分化时,初始Runx2,TGF相关基因,胶原 代谢相关基上调,碱性磷酸酶活性上升,后均下降;而细胞 外基质磷糖蛋白(matrixextracellularphosphoglvco protein,MEPE)是DPSCs分化过程中唯一下降的标记物,作 者认为MEPE是矿化的抑制剂,在DPSCs分化时下调,可作为 DPSCs分化时的检测指标.最近Mokry等研究表明,牙髓 干细胞表达STRO一1,vimentin,CD29,CD44,CD73,CD90,CD166 等问充质_T细胞的细胞标志物,同时表达Sox2,nestin及 nucleostemin干细胞标志物. 3DPSCs的多向分化能力与相关因素的调控 牙髓_T细胞是来源于神经嵴和问充质的多潜能干细胞, 研究发现其细胞群辛要是来源于神经嵴细胞群,细胞标志物 为lowaffinitynervegrowthfactorreceptor (LANGFR)和问叶细胞群,标志物为卜integrinreceptor subunit.这两个细胞群都具有多向分化的功能.牙髓干细胞 的多项分化能力即可塑性(plasticity)在围内外的很多实 验中得到验证.Yu等认为牙髓干细胞的分化方向取决于局 部的微环境,他们在试验中发现利用猪牙胚细胞条件培养基 能诱导牙髓下细胞形成更加合理组织学结构的牙本质,牙 髓复合体.Iohara等研究发现,BMP2能够刺激牙髓细胞分 化为表达牙本质涎磷蛋白DSPP的成牙本质细胞.Saito等 也发现,BMP2能促进牛和人单层培养和三维胶丸培养的牙髓 细胞分化为成牙本质细胞.Keklikoglu等认为转化因子 AP21家族的成员FosB在成牙本质细胞和牙髓未分化问充质 细胞的分化和增牛方面有重要作用.Moioli等m的研究, TGF2S能诱导DPSCs向成牙本质细胞分化.Liu等研究表 明牙本质素是MEPE的一个肽片段,它能下调P16,促进 DPSCs的增牛,在牙髓修复中扮演重要角色.Gronthos等?发 现DPSCs在含有L2抗坏血酸22磷酸,地塞米松,无机磷酸 盐的矿化诱导液培养基中培养546周后,经染色表明有钙 结节形成.Yamada等的研究表明,人DPSCs高表达DMP1, 而DXIPI在未分化问充质细胞分化和牙本质矿化中起重要作 用.Arthur等体内和体外实验中,分别加入了各种生长因 子如EGF及FGF等,均发现牙髓于细胞可以分化为具有功能 活性的神经元.FrancescaPaino等认为黑素细胞和牙髓 细胞均源于神经嵴细胞群,在试验中DPSCs在没有外加定向 诱导因素下,表达TRP一2,TRP—l,gplOO/PmelandMART一1抗 原,且能自主分化为完全成熟的黑素细胞.Demarco等最 近研究把三维多聚乳酸支架置于拔除的第三磨牙髓室内,用 晶体盐或胶体做成孔剂辅料,把牙髓干细胞接种于其内,发 现与牙本质相关的形态发生因子在诱导牙髓干细胞向成牙 本质细胞的分化中起着重要的作用,且DPSCs的微环境对细 胞的行为和分化也有重要的影响.JingWANG等用纳米纤 维多聚乳酸支架进行DPSCs体内体外定向分化研究,发现 BMP一7和DXM复合因子及纳米纤维多聚乳酸支架可大大提高 DPSCs向牙髓牙本质复合体的定向分化能力.Oronthos等实 验成功对DPSCs进行了脂肪诱导,而Norsat等证明DPSCs 具有神经分化分化能力. 4DPSOs向iPSOs的重组转化 诱导多潜能性干细胞(inducedpluripotentstem cel1S,iPSCs)是通过在分化的体细胞中表达特定的转录因 子,以诱导体细胞的重编程而获得的可不断自我更新且具有 多向分化潜能的细胞.由于iPSCs既避免免疫排斥,又不涉 及伦理道德问题,因此具有广泛且重要的临床应用价值.在 2006年日本学者Takahashi和Yamanaka[2s研究小组采用体 外基因转染技术,从24个因子中筛选出Oct4,Sox2,cMyc, Klf4等4个转录因子,通过逆转录病毒将上述4个转录因 子导入胚胎小鼠成纤维细胞或成年小鼠尾部皮肤成纤维细 胞,在小鼠Es细胞的培养条件下获得了Fbxl5+的多潜能 干细胞系,该细胞系在细胞形态,生长特性,表面标志物,形 成畸胎瘤等方面与小鼠ES细胞非常相似,而在基因表达 谱,DNA甲基化方式及形成嵌合体动物方面却不同于小鼠Es 细胞,故将其命名为iPSCs,从那开始全世界众多实验室开 始了iPSCs研究...,相继从狗,猪,猴和人等哺乳动物的皮 肤细胞,肝细胞,羊水细胞,CD34血细胞,骨髓干细胞及牙齿 干细胞等成体细胞成功获得了iPSCs.其中牙髓组织在临床 上易于获得,不牵涉伦理问题而得到广泛关注.Tamaoki2g和 XingYAN等研究小组利用病毒载体把c—Myc,K1f4, Oct4,Sox2和Lin28,Nanog,Oct4,Sox2因子导入牙髓干 细胞中,成功获得了iPSCs. 迄今为止,关于DPSCs的研究,国内外学者做了大量的 工作,取得了很大的进展.但是DPSCs的研究仍面临许多问 题,如DPSCs有无特异性细胞标志物?DPSCs的鉴定? DSPCs的潜在分化能力和如何定向诱导DPSCs的分化? Telomere在DPSCs体外培养和体内增殖过程中的作用机制? DPSCs向iPSCs的成功转化载体和重组因子的优化?这些问 题说明DPSEs应用于临床还有很长的路要走,需要相关学者 更多的基础和临床研究. [参考文献] [1]GronthosS,MankaniM,BrahimLeta1.Postnatalhumandentalpulp 344巾国美容医学2011年2月第2O卷第2期 ChineseJournalofAestheti'Medicine.Feb.2011.Vo1.20.No.2 stemcells(DPSCs)invitroandvivo[J].ProcNatlAcadSciUSA, 2000,97(35):13625—13630. [2]MiuraM,Gronthoss,ZhaoM,eta1.SHED:stemceilsfromhuman exfoliateddeciduousteeth[J].ProcNatlAcadSciUSA,2003,100(10): 5807—5812 [3]YoungCS,TeradaS,VacantiJP,eta1.Tissueengineeringofcomplex toothstructuresonbiodegradablepolymerscaffolds[J].JDentRes, 2002,81(10):695—700. [4]GronthosS,BrahimJ,LiW,eta1.StemcellPropertiesofiaumandental pulpstemcells[J].JDentRes,2002,81(8):531-535 [5]HaradaH,KettunenP,JungHS,eta1.Localizationofputativestemcells indentalepitheliumandtheirassociationwithNotchandFGF signaling[J].JCellBiol,1999,147(1):105-120. 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