抗Fas抗体诱导人肾小球系膜细胞凋亡

抗Fas抗体诱导人肾小球系膜细胞凋亡 中国图分类号 R392. 12 摘 要 目的 :研究抗 Fas 抗体对人肾小球系膜细胞的致凋亡作用 ,探讨 Fas2FasL 在肾脏损伤中的作用 。方法 :常规方法 () (μ) 分离 、培养人肾小球系膜细胞 Mcs,并传代鉴定 ,用不同浓度的抗 Fas 抗体 0 ,2 ,5 ,10 gΠml刺激 4,6 代 Mcs 16 h 后 ,荧光染 色观察 Mcs 凋亡变化 ,二苯胺法和 DNA 凝胶电泳方法定量和定性 Mcs DNA 片段化变化 。结果 :抗 Fas 抗体可诱导 Mcs 凋 亡 ,且致凋亡效应呈依赖性关系 。结论 : Fas2FasL 系统在 Mcs 凋亡中起着重要作用 。 关键词 Fas2FasL 抗 Fas 抗体 系膜细胞 Anti2Fa s antibody induce a poptosis in cultured human glomerular mesangial cells CHEN Ming , L IU Xiao2Hui , HUAN G Song2Min et al . Department of Nephrology , the First University Hospital West China University of Medical Science , Chengdu 610041 () Abstract Objective : To investigate the mechanism inducing aosis of human glomerular mesangial cells Mcsby anti2Fas antibody. () Methods : Msc were cultured with anti2Fas antibody anti2Fas Abat different concentrations for 16 hrs. Apoptosis of Mcs was evaluated and () qualifed by acriding orange AOstained and DNA fragmentation assay. Results : Anti2Fas antibody was found to be able to induce apoptosis in culture human masangial cells and the effect of anti2Fas antibody inducing apoptosis was dose2dependent . Conclusion : Fas and its ligand could play a an role in the injury of human glomerular cell . Key words Fas2FasL Anti2Fas antibody Human mesangial cell 细胞凋亡在肾脏疾病的发生和发展过程中起重 ,继续孵育 48 h ,使细胞同步于 G期 ,去上清液后 液 1 1 分成对照组 、实验组 A 、B 、C 4 组 ,分别加入羊血清 要作用 ,但其机制尚不清楚。研究明 Fas 抗原 μ( ) μIgM 2gΠml ,抗 Fas 抗体 Santa Craz Co2 、5 和 10 gΠ 存在于 多 种 细 胞 表 面 , 一 旦 被 激 活 可 介 导 细 胞 凋 ml 各 1 ml ,继续培养 16 h 。收集 Mcs 作下列凋亡检 2 ( ) 。本文拟用 Fas 配体 FasL的协同剂 ———抗 Fas 亡() 测 Ao。 ()抗体研究 Fas2FasL 系统对人肾小球系膜细胞 Mcs μ1. 1 Mas 凋亡的形态学观察 将 2 l 吖淀橙染液 的作用 ,旨为研究肾小球疾病开拓新的理论思路 。( μ) 100 mgΠml加 50l 待观察 Mcs 悬液中充分混匀后 , μ再加入 1 %多聚甲醛溶液 40 l 固定细胞后 ,于 24 h1 材料与方法 (内荧光镜下 以细胞出现核浓缩或核碎裂为细胞凋 取新鲜正常人肾组织在无菌条件下去除肾包 ) 亡计数每份标本出现凋亡的细胞数〔每份标本 3 膜 ,按谌氏的方法重叠过筛分离并用 IV 型胶原酶( ) 至少计数 200 个细胞 ,计算凋亡率 %〕。 ( ) () Sigma Chemical Co300 UΠml消化肾小球 。用 RP24 1. 2 DNA 片段化率的测定 用二苯胺测定方法, MI 1640培养肾小球 ,直到细胞布满瓶底后 ,用0 . 25 %用 Bio2Rad型比色仪在 590 nm 波长下比色测定每 450 ( ) 胰蛋白酶2EDTA Sigma Chemical Co消化细胞后传 ( ) 份标本 DNA 片段化率 %。 ( 代培养 。取第 4,6 代细胞经形态学鉴定 相差显微 1. 3 DNA 凝胶电泳 取实验后 Mcs 悬液 ,4 ?离心) 镜 、透 射 电 镜 、扫 描 电 镜 及 抗 胸 腺 细 胞 抗 体 , 抗 ( ) Desmin 抗 体 免 疫 荧 光 鉴 定 证 实 为 系 膜 细 胞 Mcs(( ) 500 rΠminPBS 洗涤后 , 加入等体积裂解缓冲液 5 4 后 。取第 4,6 代 Mcs ,以 1 ×10Π孔接种于 24 孔培 mmolΠL Tris HCl ,p H8 . 0 ,100 mmolΠL NaCl ,100 mmolΠL 养 板上 ,待细胞贴壁过夜后 ,换成无血清 RPMI1640 μ) EDTA ,1 %SDS ,200 gΠml 蛋白酶 K充分混匀 ,37 ? 孵育 12 h 后 按 传 统 酚2氯 仿2异 戊 醇 抽 提 DNA 方 ?现工作于泸州医学院附属医院肾内科 ,泸州 646000 5 作者简介 :陈 明 ,男 ,31 岁 ,内科学硕士 ; 法 ,收集 Mcs 的 DNA ,在 1 . 6 %凝胶中 160 mV 电泳 黄颂敏 ,女 ,副教授 ,硕士导师 ,主要研究糖尿病肾病 2 h 后 ,观察 DNA 条带分布情况 。Mcs 细胞凋亡率 、 实抗 Fas 抗体对 Mcs 具有致凋亡作用 ,间接证实了 2 结果 Mcs 膜表面存在着 Fas 抗原 、与文献 6 报告的抗 Fas 形态学观察表明抗 Fas 抗体能诱导 Mcs 凋亡 , 抗体可 诱 导 鼠 肾 小 球 系 膜 细 胞 凋 亡 的 结 果 相 似 。 细胞 凋 亡 率 随 抗 Fas 抗 体 剂 增 加 而 增 高 , Mcs 的 Los 等认为 Fas 抗原存在于细胞表面的特定区域 ,一 DNA 片段化定量分析显示 Mcs DNA 片段化率与抗 旦被 FasL 或类似物激活 ,可通过白细胞介素转化酶 ( Fas 抗体浓度呈直线正相关 Y = 10 . 20 + 4 . 6X , r = 或 Ced23 基因产物转移凋亡信息入细胞内 , 产生类 ) () 0 . 972 , P < 0 . 001表 1;Mcs DNA 电泳分析表明抗 似于原癌基因或化学药物的物质作用于细胞 DNA ,Fas 抗体可致 Mcs 的 DNA 呈不同程度“梯形”改变 , 或者导致类似 CTL 反应作用于细胞 DNA ,使其裂解 () 而对照组 Mcs 的 DNA 断裂不甚明显 图 1。 7 而致细胞凋亡。可见细胞凋亡不仅受细胞本身的 Ced23 、Bcl22 基因控制也受 Fas2FasL 系统的调控 。 表 1 抗 Fas 抗体诱导 Mcs 凋亡 D NA 片段化率和凋亡细胞 本实验使用不同浓度的抗 Fas 抗体刺激人肾小 计数的定量分析球 Mcs ,发现 Mcs 凋亡与抗 Fas 抗体剂量呈正相关 , Ta b. 1 D NA fragmentation of Mcs a poptosis induced by ant2i 与 Ogaswaza 等报告不同剂量的抗 Fas 抗体诱导大鼠 Fas antibody was quantiative analysis 8 肝细胞凋亡的实验结果相似。 μ() ( )( )Group Anto2Fas Ab gΠmlDNA fragmentation % Mcs apopotosis % 综上所述 ,抗 Fas 抗体可通过激活 Mcs 膜上的Control 0 4 . 82 ?1 . 56 5 . 62 ?2 . 30 ))11Fas 抗原 ,导致剂量依赖性的 Mcs 凋亡 。Barker 等认 A 2 25 . 2 ?4 . 2424. 56 ?1 . 95))11 B 5 34 . 52 ?5 . 6531. 78 ?2 . 85为诱导过度增生的 Mcs 凋亡可达到控制系膜增殖性 ))11 C 10 9 54 . 45 ?4 . 8251. 24 ?3 . 25肾炎的目的 。由此可见我们可利用 Fas2FasL 系统 ) Note :1Compared with control , P < 0 . 01 的作用原理 ,合成重组的 FasL 和Π或协同剂 ,促使增 多的系膜细胞凋亡 ,从而达到预防肾脏病进展的目 的 。 4 参考文献 1 Savill J , Mooney A , Hughes J . Apoptosis and renal scarring. Kidney ( ) Int , 1995 ; 49 suppl , 54: S14 Nagata S , Golstein P. The Fas death factor . Science , 1995 ; 267 :1449 2 谌贻璞 ,高 进 ,邢宝才 et al . 肾小球系膜细胞培养. 北京医科 3 图 1 抗 Fas 抗体诱导 Mcs 凋亡的 D NA 凝胶电泳分析 () 大学学报 ,1989 ;21 6:335 Fig. 1 D NA fragmentation of Mcs a poptosis induced by anti2 Illera V A , Perandones C E , Stunz L L et al . apoptosis in splenic lym2 4 Fas antibody was quality analysis phocytes: Regulation by protein kinase C and IL24 . J Immul , 1993 ; 141 :2965 3 讨论 姜 泊 ,张亚历 ,周殿元主编. 分子生物学常用实验方法. 北京 : 人 5 民军医出版社 ,1994 : 66267 细胞凋亡是多细胞机体的重要生理 、病理过程 , 主要表现为细胞核的皱缩 、染色质浓聚 、碎裂 ,DNA Wong G H , Goeddel D V. Fas Antigen and P55 TNF receptor signal ap2 6 片段化 。这种现象贯穿于肾脏正常生理及疾病发生 optosis through distince pathways. J Immunol , 1994 ;152 : 1751 1 的全过程。文献 2 报告 Fas2FasL 系统可通过细 Los M , Graen M V , Penning L E et al . Requirement of ICEΠCED23 pro2 7 ( ) 胞毒性 T 淋巴细胞 CTL 介导细胞毒性作用和对免 teinase for FasΠApo21 mediated apoptosis. Nature , 1995 ; 375 : 81 疫应答 的 调 节 作 用 而 参 与 机 体 的 细 胞 凋 亡 过 程 。 Ogasawaza J , Watanabe F R , Adachi M et al . Lethal effect of the anti2 8 Wong 等报告 Fas 抗原不仅存在于淋巴细胞 、巨噬细 Fas antibody in mice . Nature , 1993 ; 369 :806 6 胞表面 ,也存在于肝 、肺实质细胞表面。本实验通 Baker A J , Mooney A , Hughes J et al . Mesangial cell apoptosis : The 9 过用 FasL 的协同剂 ———抗 Fas 抗体与 Mcs 共同培养 major mechanism for resolution of glomerular hypercellularity in experi2 mental mesangial proliferative Nephritis. J Clin Invest , 1994 ; 94 : 2105 16 h ,从细胞形态学角度观察到抗 Fas 抗体导致 Mcs 核浓缩 、核碎裂 , 与正常对照组比较存在明显差异 ( ) P < 0 . 01,从 Mcs DNA 裂解片段化的定性分析可 〔收稿 1997209206 修回 1998202205〕 ()编辑 徐 杰