大肠杆菌生长曲线实验报告

大肠杆菌生长曲线 广州大学化学化工学院 本科学生综合性、设计性实验报告 实验课程 食品微生物实验 肠杆菌生长条件的探讨及其生长曲线的测实验项目 大 定 专业 食品科学与工程 班级 食品131 学号 1305300012 姓名 郭小平 指导教师 刘鹏 2015学年 第一 学期 开课学期 时 间 2015 年 5 月 25 日 一、实验设计 5 实验序号 实验项目 大肠杆菌生长曲线的测定 实验时间 2015.5.25 郭小平、梁永强 实验室 生化楼327 小组成员 一(实验目的 1.通过对大肠杆菌生长条件的探讨及其生长曲线的测定，综合训练微生物实验的基本实验技能。 2.巩固培养基的配制、灭菌、仪器的包扎、倒平板 3.学习用比浊法测定细菌的生长曲线。 4.比较不同培养基的生长曲线。 二(实验原理、实验流程或装置示意图 ? 、实验原理 将少量细菌接种到一定体积的、适合的新鲜培养基中，在适宜的条件下进行培养，一定时间测定培养液中的菌量，以菌量的数量作纵坐标，生长时间作横坐标，绘制的曲线叫生长曲线。它反映了单细胞微生物在一定环境条件下于液体培养时所现出的群体生长规律。依据其生长速率的不同，一般可把生长曲线分为延缓期、生长期、稳定期和衰亡期。将每一种一定量的细菌转入新鲜液体培养基中，在适宜的条件下培养细胞要经历延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个阶段。 延迟期:又叫调整期。细菌接种至培养基后，对新环境有一个短暂适应过程(不适应者可因转种而死亡)。此期曲线平坦稳定，因为细菌繁殖极少延迟期长短因素种、接种菌量、菌龄以及营养物质等不同而异，一般为1,4小时。此期中细菌体积增大，代谢活跃，为细菌的分裂增殖合成、储备充足的酶、能量及中间代谢产物。 对数生长期:又称指数期。此期生长曲线上活菌数直线上升。细菌以稳定的几何级数极快增长，可持续几小时至几天不等(视培养条件及细菌代时而异)。此期细菌形态、染色、生物活性都很典型，对外界环境因素的作用敏感，因此研究细菌性状以此期细菌最好。抗生素作用，对该时期的细菌效果最佳。 稳定期:该期的生长菌群总数处于平坦阶段，但细菌群体活力变化较大细菌浓度达到最大即环境最大容纳量。由于培养基中营养物质消耗、毒性产物(有机酸、过氧化物等)积累PH下降等不利因素的影响，细菌繁殖速度渐趋下降，相对细菌死亡数开始逐渐增加，此期细菌增殖数与死亡数渐趋平衡。细菌形态、染色、生物活性可出现改变，并产生相应的代谢产物如外毒素、内毒素、抗生素、以及芽孢等。 衰亡期:随着稳定期发展，细菌繁殖越来越慢，死亡菌数明显增多。活菌数与培养时间呈反比关系，此期细菌变长肿胀或畸形衰变，甚至菌体自溶，难以辩认其形。生理代谢活动趋于停滞。故陈旧培养物上难以鉴别细菌。 体内及自然界细菌的生长繁殖受机体免疫因素和环境因素的多方面影响，不会出现象培养基中那样典型的生长曲线。掌握细菌生长规律，可有目的地研究控制病原菌的生长，发现和培养对人类有用的细菌。 这4个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所不同。因此通过测定微生物的生长曲线，可了解个菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。 测定微生物的数量有多种不同的方法，可根据要求和实验室条件选用。本实验用比浊法测定，由于细菌悬液的浓度与光密度(OD值)成正比，因此可利用分光光度计测定菌悬液的光密度来推知菌液的浓度，并将所测的OD值与其对应的培养时间作图，即可绘出该菌在一定条件下的生长曲线，此法快捷、简单。 (2)、实验流程 1、设计实验方案:影响微生物生长的因素有:培养基中各组分的比例、菌悬液的加入量等，由此设计实验。 2、设计正交表: 3、实验操作:根据实验方案配制培养基、灭菌、转移菌悬液、培养、终止培养、测量OD值。 4、数据处理:比较各组生长曲线的差异、根据生长曲线的最终结果分析正交表，得出最佳的培养参数。 5、撰写报告:撰写实验报告，并进行讨论:培养基中各组分的作用，及其对大肠杆菌生长的影响。 三(实验设备及材料 大肠杆菌斜面菌种、营养肉汤培养基、生理盐水(0.85%NaCl)50mL、721型分光光度计、比色皿、恒温摇床、培养箱、高压蒸汽灭菌锅、电子天平、酒精灯、电炉、接种环、试管架、锥形瓶9个(250mL)、无菌吸管、烧杯(1000mL)、乳胶头、报纸、胶塞、玻璃棒等 四(实验方法步骤及注意事项 实验步骤: 配制营养肉汤培养基 营养肉汤培养基灭菌 配制大肠杆菌菌液 标记 接种 培养 测定 绘制生长曲线 1.配制营养肉汤培养基:用电子天平称取1.0g酵母膏、蛋白胨1.8g和食盐2g置于1000mL烧杯中，加水至200mL，用 电炉加热(加热过程中要用玻璃棒不断搅拌)至沸腾后，冷却少许后分别倒进10个锥形瓶中， 每个锥形瓶倒20mL，塞上胶塞，用报纸包好，棉绳系好。 2.营养肉汤培养基灭菌:将步骤一包好的培养基置于高压蒸汽灭菌锅121?灭菌30min. 3.标记:将9个锥形瓶进行标记，分别标号1、2、3„„8、9、10，并标记时间为2h，4h，6h，8h，14.5h，16h，18h，20h，24h。 4.接种:用1mL无菌移液管分别移取1mL大肠杆菌菌液到已编号的9个锥形瓶中，并充分震荡均匀. 5.培养:将锥形瓶置于37?下在恒温摇床上培养(180r/min)。然后分别按对应时间将锥形瓶取出，待培养结束时测定 OD值。 7.测定:将培养的大肠菌群菌液用无菌移液管移取到比色皿中，选用600nm分光光度计上调节零点，用蒸馏水作为空白 对照，并对不同时间培养液从0起依次进行测定，对浓度大的菌悬液用自来水适当稀释后测定，使其OD值在 0.1-0.65之间，经稀释后测得的OD值要乘于稀释倍数，才是培养液实际的OD值。 8.绘制生长曲线:对所得数据进行生长曲线的绘制，分析实验结果。 五(实验数据处理方法与原始记录 实验数据处理方法: 以时间为横坐标，OD为纵坐标，用excel绘制大肠杆菌的生长曲线，分析实验结果。 600 实验数据原始记录: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 分组 2h 4h 6h 8h 14.5h 16h 18h 20h 24h 空白 时间 0.046 0.197 0.308 0.450 0.579 0.598 0.626 0.636 0.65 0.032 OD 640 大肠杆菌的生长曲线图 0.7 0.6 0.5 0.4系列1OD值0.3 0.2 0.1 0 12345678910 时间h 24h大肠杆菌OD值 1 2 3 4 5 6 7 8 9 实验第一次 0.791 0.587 0.503 0.803 0.65 0.376 0.939 / 0.864 实验第二次 1.013 0.72 0.615 0.925 0.65 1.27 1.197 0.998 0.798 实验第三次 0.843 0.72 0.701 0.878 0.64 / / / / 平均OD值 0.882 0.676 0.606 0.869 0.65 0.823 1.068 0.998 0.831 稀释后OD值 1.764 1.352 1.212 1.738 1.3 1.646 2.136 1.996 1.662 大肠杆菌的24h平均OD值 2.5 2 1.5 系列1OD值1 0.5 0 123456789 时间/h 正交实验表 实验组分 酵母膏 蛋白胨 NaCl 1 1 1 1 2 1 2 2 3 1 3 3 4 2 1 2 5 2 2 3 6 2 3 1 7 3 1 3 8 3 2 1 9 3 3 2 六(参考文献 [1].周德庆，胡宝龙. 微生物学实验教程. 第2版. 北京: 高等教育出版社, 2006. [2].杨革.微生物学实验教程. 第2版. 北京: 科学出版社, 2010. [3].何国庆，贾英民，丁立孝等. 食品微生物学. 第2版. 北京: 中国农业大学出版社，2009. 二、实验报告 1(实验现象与结果 实验现象: 随着培养时间的增加，培养基里的液体变得越来越混浊，所散发出来的味道也越来越浓，味道很难闻。 实验结果: 大肠杆菌在培养基里生长繁殖，数量越来越多，达到一定数量后，增长速度变慢，后大肠杆菌进行营 养和空间的竞争，有些大肠杆菌死亡，最后数量不断减少，直至变为0。 2(对实验现象、实验结果的分析及其结论 分析: ? 随着培养时间的增加，培养基里的液体变得越来越混浊，所散发出来的味道也越来越浓，味道 很难闻，是因为大肠杆菌增长迅速，后来数量达到顶峰，此时培养基内的营养物质已被消耗殆尽， 大肠杆菌进行营养和空间的竞争，有些大肠杆菌死亡，最后数量不断减少，直至变为0。 ? 通过对大肠杆菌生长曲线的测定，了解了细菌生长的特点，是:刚开始时细菌缓慢增长，后来增 长迅速，呈“J”型，最后细菌生长缓慢，数量达到顶峰，在一段时间内保持不变。 因实验测量的时间不够合理等各种因素，因此用原始数据绘制出来的大肠杆菌的生长曲线图不够有 规律，经修正后生长曲线比较好。 结论: 细菌的生长曲线分为延缓期、生长期、稳定期和衰亡期。体内及自然界细菌的生长繁殖受机体 免疫因素和环境因素的多方面影响，不会出现象培养基中那样典型的生长曲线。掌握细菌生长 规律，可有目的地研究控制病原菌的生长，发现和培养对人类有用的细菌。 这4个时期的长短因菌种的遗传性、接种量和培养条件的不同而有所不同。因此通过测定微生 物的生长曲线，可了解细菌的生长规律，对于科研和生产都具有重要的指导意义。 三. 实验 1(本次实验成败及其原因分析 总的来说，本实验算是成功的。在一定程度生探讨出了大肠杆菌生长曲线的测定。通过此次试实验，了解了细菌生长的特点，综合训练了微生物实验的基本实验技能。巩固培养基的配制、灭菌、仪器的包扎、倒平板。在一定程度上掌握了用比浊法测定细菌的生长曲线的方法。 但有两点不足:一是一开始忽略了OD值必须在0.10-0.65 之间才有效;二是时间的间隔不太合理,开始的阶段应该时间安排紧密一点，还有晚上的一段数据没有测，实验时间不够长，延迟期和衰亡期曲线不明显。实验中若能考虑全面，这样测出来的数据才更有代表性，更加准确。 2(本实验的关键环节及改进措施 本试验的关键环节有以下四点: ? 整个过程最好是在无菌操作台上操作，这样培养基受空气中微生物的影响就较小，同时也可以减少污 染，保证培养基里大肠杆菌纯度较高，否则会在一定程度上影响结果的准确性。 ? 每隔半小时或一个小时(测量时间要安排合理，时间要控制好:在实验初期30min对菌悬液进行一次测 定。实验中期每小时测一次，后期1,2小时测定一次，依次持续到20小时后。)从恒温摇床取出锥 形瓶，用无菌移液管移取少量，操作要快，先进行预测，OD值应在0.10-0.65 之间，如果超过这个 范围则需要进行稀释后再测量。 ? 测量时要等数字变化不大时再读取，可以读三次，最后取平均值，这样能保证实验结果更加准确。 ? 721型分光光度计要先预热，实验过程中最好使用同一台仪器，同一个比色皿，这样可以减少仪器误 差，分光光度计的使用操作要规范。比色皿经蒸馏水清洗后，必须经待测样品润洗。比色皿的毛面用 吸水纸擦干，而光面只能用吸水纸吸干，以免光面被划破。比色皿用擦镜纸擦干净，上面不要残留有 纸纤维和水珠等。 改进措施:在试验过程中应严格按照标准的操作要求，在上述步骤时更加应该规范操作。 指导教师评语及评分: 签名: 年 月 日