TRPV1, 5-HT 在直肠内脱垂患者直肠的表达及意义.doc

TRPV1, 5-HT 在直肠内脱垂患者直肠的表达及意义.doc TRPV1、5-HT在直肠内脱垂患者直肠的表达及意义 张 鑫，田 跃，童卫东，李 凡，王 李，赵 松，叶景旺，刘宝华 (第三军医大学大坪医院野战外科研究 所普通外科) [摘要] 目的 直肠内脱垂(internal rectal prolapse,IRP)患者直肠黏膜层、黏膜下层辣椒素受体 (transient receptor potentia1 vanilloid 1,TRPV1)和5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)的表达，探讨其在 IRP排便功能障碍中的意义。 选择临床诊断IRP的患者20例及对照组20例进行纤维结肠镜检查，在距离齿状线4 cm 处直肠下段取黏膜活检，行TRPV1和5-HT免疫组化染色，采用图像分析法分析其免疫反应阳性情况。结果 对照组黏膜 层仅有少量TRPV1表达，黏膜下层几乎无TRPV1免疫阳性反应，IRP组直肠黏膜腺体可见大量TRPV1阳性染色，且黏膜下 层仍可明显见到TRPV1免疫阳性反应。与对照组相比，IRP组直肠黏膜层、黏膜下层TRPV1的表达显著增强(Z=-5.085, P=0.000);与对照组相比，IRP组黏膜层腺体细胞内5-HT表达量显著升高，且黏膜下层仍明显可见5-HT免疫阳性反应， 但对照组黏膜下层无5-HT免疫阳性染色(Z=-4.734, P=0.000)。结论 IRP直肠黏膜及黏膜下层TRPV1和5-HT免疫反应阳 性显著增强，可能与IRP患者排便功能障碍有关。 [关键词] TRPV1;5-HT;直肠内脱垂 [基金项目] 第三军医大学留学回国人员启动基金(2011XHG08);重庆市国际合作项目(2011gz0045) [通信作者] 童卫东，E-mail:tongweidong@gmail.com The expression and significance of TRPV1 and 5-HT in the rectum in patients with internal rectal prolapse ZhangXin,TianYue,TongWei-dong,LiFan,WangLi,ZhaoSong,YeJing-wang,LiuBao-hua (Department of General Surgery,Institute of Surgery Research, Daping Hospital,Third Military Medical University,Chongqing 400042,China) [Abstract] Background IRP(internal rectal prolapse) is the most common type of outlet obstructive constipation, but the etiopathology is unknown.Past studies had showed that TRPV1(transient receptor potential vanilloid 1) and 5-HT(5-hydroxytryptamine) were involved in regulation of intestinal motor and sensory function. Objective To evaluate the expression of TRPV1 and 5-HT in the rectal mucosa and submucosa in patients with IRP,and to discuss its role in the pathogenesis of IRP. Methods Immunohistochemistry using antibodies to TRPV1 and 5-HT was performed on rectal biopsies from 20 adults with IRP, and 20 adults controls. The immunoreactivity was quantitative assessed by using an Image-Pro Plus System. Results TRPV1 immunoreactivity was mainly detected in the rectal mucosa and moderately in submucosa of IRPs,the positive areas were significantly less in the mucosa of the control group than in IRPs,and almost no staining in submucosa in controls(Z=-5.085, P=0.000); compared with controls,IRP patients revealed strongly higher number of positive cells in the rectal mucosa.In submucosa,IRP patients could find immunoreactivity area,but there were no immunostaining in controls(Z=-4.734, P=0.000). Conclusion In controls patients,the TRPV1 and 5-HT immunoreactivity level in rectal mucosa and submucosa is obviously lower than in IRPs.This may be related to defecation dysfunction in patients with IRP. [key words] TRPV1、5-HT、IRP Supported by the . Corresponding author: Tong Weidong, E-mail:tongweidong@gmail.com 公司。 直肠内脱垂(internal rectal prolapse,IRP)是 指排便过程中近端直肠黏膜层或全层折入远端肠腔1.3 取材 或肛管内而未脱出肛门外缘，并在粪块排出后持续存纳入对象在我院内镜中心进行电子结肠镜检查，在齿状线[1]在的一种疾病，是造成出口梗阻性便秘的重要原因，上4 cm处取黏膜活检2块，放入4%多聚甲醛溶液中固定。常规严重影响患者健康和生活质量。手术、硬化剂注射等石蜡包埋，5 μm厚度切片。 方法可一定程度上纠正IRP的解剖异常，但临床症状 [2-4]1.4 免疫组化染色 的缓解率并不理想，且术后并发症及复发率较高， 将切片放入60 ?恒温烘箱内烤片2 h，然后依次放入二甲提示IRP的病理生理机制并不单纯是直肠黏膜脱垂的 苯、100%,70%梯度酒精中脱蜡、水化，抗原修复。按照SP9000解剖异常，可能涉及更复杂的感觉与运动神经调控机 免疫组化试剂盒步骤说明依次孵育山羊血清、双氧水工作液，制。IRP表现为肛门直肠坠胀、便意频繁、排便不尽 一抗4 ?恒温冰箱过夜、二抗孵育、DAB染色、复染，70%,100%感等直肠高敏感为主的排便障碍症状群，提示可能存 梯度酒精、二甲苯脱水、透明，中性树脂封片。在保持显微镜在直肠的感觉功能异常。研究[5]发现，40%的IRP患 下相同光强度，关掉采图自动白平衡等功能，全部用手动设置者存在直肠感觉功能异常，但详细机制不详。辣椒素 等条件下，拍摄400×数码照片，选择640×480像素范围进行受体 (transient receptor potentia1 vanilloid 裁切图像。采用Image Pro Plus(IPP)软件图像半定量分析技1,TRPV1)及5-羟色胺(serotonin,5-HT)是胃肠道感 术进行分析。首先将IPP程序系统的灰度单位转换成光密度单觉信号调控的重要介质，二者在肠易激综合征 位。分析免疫组化染色的图像时，把采集的图像中呈现黄色的(irritable Bowel Syndrome，IBS)中的作用已有报 [6-8]区域(TRPV1、5-HT阳性染色部分)作为AOI进行光密度测定分道，但二者在IRP患者直肠的表达情况迄今少见报 析。选择测量面积、平均光密度和累积光密度(integrated 道。本研究观察IRP患者直肠黏膜TRPV1、5-HT的表达， optical density，IOD)进行测量，取IOD的累计值(SUM)进行为深入研究其病理生理机制提供基础。 分析。 1 对象与方法 1.5 统计处理 1.1 研究对象 采用SPSS 13.0统计软件，数据用,x?s表示，对IPP软件 IRP组:纳入标准:以肛门坠胀、便意频繁等排便障碍为分析得到的TRPV1、5-HT的IOD的SUM值进行两独立样本比较的主诉来我院结直肠外科门诊就诊的患者，符合功能性便秘诊断秩和检验。 [9]的罗马?标准，经排粪造影诊断为IRP，肠镜或钡灌肠排除2 结果 大肠器质性疾病。排除标准:有泻剂服用史;伴随有结肠慢传 输、直肠前突、盆底痉挛、巨直肠等其他便秘类型;存在精神2.1 TRPV1的表达 障碍。选择符合纳入标准的IRP患者20例，包括男性5例，女性免疫组化切片上主要为黏膜层结构，部分切片包含部分黏15例，年龄29,72(52.70?10.75)岁。对照组:因健康查体而膜下组织。TRPV1免疫反应阳性区域呈棕褐色，广泛分布于黏行肠镜检查的人群，无便秘及排便障碍病史，无泻剂服用史，膜上皮腺管细胞及黏膜下组织。与对照组相比，IRP组直肠黏肠镜结果正常，共收集20例，包括男性6例，女性14例，年龄膜层TRPV1免疫反应阳性显著增强(图1)，图像分析显示增高25,68(46.45?11.78)岁。IRP组与对照组在年龄及性别方面5.28倍(P,0.01，表1)。 差异均无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。研究对象均签署 2.2 5-HT的表达 知情同意书。本研究经第三军医大学大坪医院野战外科研究所 伦理委员会批准同意。 免疫组化切片显示5-HT免疫反应阳性区域呈棕褐色，广泛 分布于黏膜上皮腺管细胞中。与对照组相比，IRP组直肠黏膜1.2 主要试剂 层5-HT免疫反应阳性明显增强(图2)，图像分析显示增高3.44TRPV1多克隆抗体(1:100)、5-HT单克隆抗体(1:10)均购自倍(P,0.01，表1)。 ABCAM公司。二步法SP9000免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥 AB A:IRP组;B:对照组 图1 2组直肠黏膜TRPV1免疫组化染色对比( ×400) AB A:IRP组;B:对照组 图2 两组直肠黏膜5-HT免疫组化染色对比( ×400) 表1 IRP组与对照组TRPV1与5-HT免疫组化染色图像分析(,x?s ) 检测指例数 对照组 IRP组 Z值 P值 标 TRPV1 20 986.40?762.30 5204.70?2847.33 -5.085 0.000 5-HT 20 4554.48?4509.69 15686.44?4469.95 -4.734 0.000 的调控作用，肠动力调节的感觉神经调控机制引起了3 讨论 人们极大关注。IRP的临床症状突出地表现为肛门直 IRP严重影响患者的健康和生活质量，目前常用肠坠胀、便意频繁、排便不尽感，呈现出典型的直肠的治疗方法包括综合保守治疗、硬化剂注射、手术等，高敏感状态。这种直肠感觉高敏感、运动功能紊乱是[2-4]但总体疗效不理想，有效率差别极大，尚无一种公否与直肠黏膜相关的感觉信号分子表达异常有关，目认的最佳治疗方案。IRP疗效不好的主要原因是对其前少见研究报道。 病理生理机制的认识仍然不清。传统上认为IRP的发已有TRPV1在具有典型内脏高敏感表现的IBS患生可能与以下因素有关:各种原因导致的盆底肌肉松者结肠黏膜表达明显增高，并且这种增高与症状严重 [10]弛;分娩时造成的阴部神经损伤。手术、硬化剂注射程度显著相关的报道。在对具有典型内脏高敏感的等可一定程度上纠正IRP的解剖学异常，对部分患者非腐蚀性反流性食管炎患者食管黏膜进行免疫组化 [11]有效，但相当一部分IRP患者术后复查排粪造影时IRP染色也发现了TRPV1表达明显升高。陈晓敏等在研解剖学异常已经得到纠正，但其临床症状缓解并不明究IBS患者内脏高敏感与结肠黏膜TRPV1的相关性实 [7]验中也得到了相同的结论显，提示IRP的发病存在更为复杂的病理生理机制。。大量研究证明TRPV1在内近年研究认为肠黏膜感觉信号对运动功能有着重要脏高敏感患者消化道黏膜层中大量表达，并且参与消 journal of the European Gastrointestinal Motility 化道感觉、运动的调节。动物研究发现经肛门对大鼠 Society,2011,23(2):151-154,e30. 直肠注入辣椒素，可以导致大鼠内脏高敏感，并且这 [2].Formijne Jonkers HA,Poierrie N,Draaisma WA,Broeders IA,Consten 种高敏感是通过直肠黏膜大量释放5-HT来实现的。并 EC.Laparoscopic ventral rectopexy for rectal prolapse and 且5-HT受体的激活可促进TRPV1的易化，有利于初级 [6, 12]symptomatic rectocele:an analysis of 245 consecutive 传人神经元功能上调形成内脏高敏感。人体内 patients[J].Colorectal disease:the official journal of the 90,的5-HT在胃肠道的肠嗜铬细胞 Association of Coloproctology of Great Britain and (enterochromaffin cells，EC)中合成并储存。肠腔 Ireland.2013;15(6):695-9. 内的物理、化学刺激可激活EC细胞释放5-HT，与黏膜 [3].Michalopoulos A,Papadopoulos VN,Panidis S, et al.Surgical 及黏膜下5-HT、5-HT受体等结合，从而产生系列生34 management of rectal prolapse[J].Techniques in 物效应，调控胃肠道的感觉、运动功能。TRPV1是胃 coloproctology.2011;15 Suppl 1:S25-8. 肠道重要的感觉信号分子，动物实验发现用不同浓度 [4].Pescatori M,Zbar AP.Tailored surgery for internal and external 的辣椒素刺激小鼠直肠，可以诱发产生强烈收缩反 [13]rectal prolapse:functional results of 268 patients operated upon by 应，并且这种收缩反应成浓度依赖性。另有研究证 a single surgeon over a 21-year period[J].Colorectal disease:the 明TRPV1拮抗剂可以降低辣椒素诱导的这种直肠强烈 [14]official journal of the Association of Coloproctology of Great 收缩。这证明了TRPV1能够感受肠腔内刺激，并通 Britain and Ireland.2009;11(4):410-9. 过一定的通路调节直肠的运动。Blackshaw的研究表 [5].Gladman MA,Scott SM,Chan CL,Williams NS,Lunniss PJ.Rectal 明辣椒素可以刺激肠道迷走神经兴奋，从而增加肠蠕 hyposensitivity:prevalence and clinical impact in patients with 动，这可能是TRPV1调节肠道感觉和运动的重要机制 [15]intractable constipation and fecal incontinence[J].Diseases of the 。因此，我们有理由相信TRPV1和5-HT在直肠黏膜 colon and rectum.2003;46(2):238-46. 各层均有表达，并且协同作用，共同完成直肠运动功 [6].Qin HY,Luo JL,Qi SD,Xu HX,Sung JJ,Bian ZX.Visceral 能的感觉神经调控过程，但是目前尚少见相关研究报 hypersensitivity induced by activation of transient receptor 道。 potential vanilloid type 1 is mediated through the serotonin pathway 本研究证明IRP患者直肠黏膜TRPV1、5-HT表达显 in rat colon[J].European journal of 著增高，符合我们对二者是肠动力调节的重要感觉神 pharmacology.2010;647(1-3):75-83. 经调控机制的假设。但是二者是如何协同作用，造成 [7].陈晓敏，施月芳.肠易激综合征患者结肠黏膜TRPV1表达与腹痛的关系患者直肠感觉高敏感和运动功能紊乱，其机制尚不清 [J].胃肠病学和肝病学杂志.2010;19(10):944-946. 楚。我们推测IRP患者直肠黏膜TRPV1在感受肠腔内的 [8].Wang YM,Chang Y,Chang YY,Cheng J,Li J,Wang T,et al.Serotonin 各种物理和化学刺激后，通过激活EC细胞释放大量 transporter gene promoter region polymorphisms and serotonin 5-HT，释放的5-HT与黏膜及黏膜下5-HT、5-HT受体34 transporter expression in the colonic mucosa of irritable bowel 等结合，从而导致直肠感觉、运动功能紊乱，需要进 syndrome patients[J].Neurogastroenterology and motility:the 一步研究证实。另外，TRP家族的其他成员如TRPM7参 official journal of the European Gastrointestinal Motility 与Cajal间质细胞调控胃肠道慢波活动的调节，TRPA1 [16]Society.2012;24(6):560-5,e254-5. 参与肠EC细胞释放5-HT的调节，这些相关的信号分 [9].柯美云，方秀才.罗马3功能性胃肠疾病[M][J].胃肠病子在IRP发病机制中的作用也值得未来深入研究。 学.2008;2008457. 综上所述，TRPV1和5-HT在IRP直肠黏膜的表达异 [10].Keszthelyi D,Troost FJ,Jonkers DM,Helyes Z,Hamer HM,Ludidi 常升高可能是IRP直肠敏感性增高的一个重要病理生 S,et al.Alterations in mucosal neuropeptides in patients with 理基础，但详细的调控机制有待深入研究。 irritable bowel syndrome and ulcerative colitis in remission:A role 参考文献: in pain symptom generation?[J].Eur J Pain.2013. [1].Wijffels N A,Angelucci G,Ashrafi A,et al.Rectal hyposensitivity [11].Chua YC,Aziz Q.Perception of gastro-oesophageal is uncommon and unlikely to be the central cause of obstructed reflux[J].Best practice & research Clinical defecation in patients with high-grade internal rectal gastroenterology.2010;24(6):883-91. prolapse[J].Neurogastroenterology and motility:the official [12].Loyd DR,Chen PB,Hargreaves KM.Anti-hyperalgesic effects of fibres in rats[J].The Journal of antiphysiology.2008;586(Pt21):5247--serotonergic compounds on serotonin-and capsaicin-evoked 58. thermal hyperalgesia in the rat[J].Neuroscience.2012;203:207-15. [15].Blackshaw LA,Page AJ,Partosoedarso ER.Acute effects of [13].Matsumoto K,Kurosawa E,Terui H,Hosoya T,Tashima K,Murayama capsaicin on gastrointestinal vagal T,et al.Localization of TRPV1 and contractile effect of capsaicin afferents[J].Neuroscience.2000;96(2):407-16. in mouse large intestine:high abundance and sensitivity in rectum [16].Nozawa K,Kawabata-Shoda E,Doihara H,Kojima R,Okada and distal colon[J].American journal of physiology Gastrointestinal H,Mochizuki S, et al.TRPA1 regulates gastrointestinal motility and liver physiology.2009;297(2):G348-60. through serotonin release from enterochromaffin [14].De Schepper HU,De Winter BY,Van Nassauw L,Timmermans JP,Herman cells[J].Proceedings of the National Academy of Sciences of the AG,Pelckmans PA,et al.TRPV1 receptors on unmyelinated C-fibres United States of America.2009;106(9):3408-13. mediate colitis-induced sensitization of pelvic afferent nerve (收稿:2013-07-10;修回:2013-07-18) (编辑 龙 亮)