细菌脂多糖对培养星形胶质细胞中Src抑制的蛋白激酶C底物表达的影响

细菌脂多糖对培养星形胶质细胞中Src抑制的蛋白激酶C底物表达的影响 细菌脂多糖对培养星形胶质细胞中Src抑制 的蛋白激酶C底物表达的影响 第38卷第1期 2OO7年2月 解剖 ACIIAANATOMICASINICA Vo1.38.No.1 Feb.2007 细菌脂多糖对培养星形胶质细胞中Src抑制的 蛋白激酶C底物表达的影响 沈爱国.孙琳琳程纯刘海鸥肖锋沈聪聪 (1.江苏省神经再生重点实验室,南通大学226001;2.南通大学基础医学院微生物学与免疫学教研室,南通226001) [摘要】目的研究细菌脂多糖(LPS)对培养的大鼠星形胶质细胞中Stc抑制的蛋白激酶C的底物(SSeCKS) 表达的影响.培养的星形胶质细胞随机分为空白对照组,LPS单一刺激组,LPS联合PKC抑制剂(RO.31. 8220)刺激组.运用荧光定量PcR(RealtimeRT-PCR),免疫印迹和免疫细胞化学法分析SSeCKS的表达变化和亚细 胞定位.结果RealtimeRT-PCR显示,LPS可以上调SSeCKSmRNA水 平,在作用浓度为100g/L和1mgCL时与 对照组有显着差异(P<0.01).Westernblotting表明,当LPS作用浓度为100L时,SSeCKS蛋白表达量明显上调; 在此浓度作用下,SSeCKS表达于6h达高峰并广泛磷酸化,至24h其蛋白表达仍维持于较高水平.免疫细胞化学 分析显示,正常情况下,SSeCKS散在分布于胞质,于胞膜略有浓集.在LPS单一刺激组,SSeCKS富集于核周;当LPS 联合RO.31.8220共同作用时,SSeCKS的亚细胞定位与正常组无明显差异.结论在体外培养的星形胶质细胞 中,LPS可诱导SSeCKS表达,上调其磷酸化水平,影响其细胞内定位.这些改变与PKC的功能相关.提示SSeCKS 可能参与星形胶质细胞中炎症信号的转导. [关键词】细胞脂多糖;Src抑制的蛋白激酶C的底物;星形胶质细胞;蛋白激酶c;免疫印迹;免疫组织化学;大鼠 [中图分类号】R364.5[文献标识码】A[文章编号】0529.1356(2007)01.13 EFFECTSoFL?,opOLYSACCHAIDEoNTHEEXPRESSIONOFSRC. SI’PRESSEDCKASESUBSTRATEINCULTUREDASTRoCYTES SHENAi-guo,SUNLin-lin2,CHENGChun2,LIUHai—OU2,XIAOFeng2,SHENCong.cong2 (.TheJiangsu~otrinceKeylabofNeuroregeneration,NantongUniversity;N antong226001,China; 2.DepartmentofImmunologyandMicrobiology,BasicMedicalCollege,NantongUnioemlty,Nantong226001,China) [AbstractJObjecfiveToinvestigatetheeffectsoflipopolysaccharide(LPs)onSrc-suppressedCKinaseSubstrate (SSeCKS)inculturedastrocytes.MethodsPurifiedastrocytesWCI’~randomlydividedintothreegroups:controlgroup.singly stressedandmultiplestressedgroups.TheexpressionofSSeCKSwasdetectedbyRealtimeRT-PCRandWesternblotting,while immunocytochemistrywasusedtoinvestigate出 esubcellularlocalizationofit.ResultsRealtimeRT—PCRindicatedthat.after1 2 hoursincubation,both1130Landlmg/LLPSwereabletoelevatethelevelsofSSeCKSmRNAcomparedwithcontrolgroup, whilelmg/LLPSdidnothaveastrongereffectthan100/xg/L.Westernblottinganalysisshowed100tsg/LLPSsignificantly increasedtIleexpressionofSSeCKS.Intimeresponseexperiments,tIlelevelsofSSeCKSexpressionenhancedthreehoursaftertIle sfimulaton,peakedatthesixthhour,coincidentwithitsrapidphosphorylation,andremainedhighuntilthe24thhour. ImmunocytochemistrysuggestedaperinueleartranslocationofSSeCKS,whilethePKCinhibitorRO.31.8220blockedit. ConclusionInculturedastrocytes,LPScanenhancetheexpressionofSSeCK S,increaseitsphosphorylationlevelandchangeits subeellularlocalization.TheseeffectsarecorrelatedwiththePKCpathway.w hichindicatesSSeCKSmightparticipateinthesignal transductionofinflammationinculturedastrocytes. [Keywords]LPS;SSeCKS;Astrocytes;PKC;Westernblotting;Immunohist ocytochemistry;Rat [收稿日期] [基金项目] [作者筒介] 2006-04.14[修回日期]2006-07.07 国家自然科学基金资助项目(30300099);江苏省 自然科学基金资助项目(BK2003035);江苏省高 校高新技术产业发展资助项目(JH02-117);江苏 省高校自然科学基金资助项目(03KJB180109) 沈爱国(1968一),男(汉族),江苏省东台市人,理 学博士.副教授. *通讯作者(Towhomwdm~~sl~ldbeld由_ed) E-mihee.hong@ntu.edu.cnTel:(0513)85051736 神经胶质细胞激活增殖,分泌大量炎症因子是 中枢神经系统炎症反应的特征性表现,其中星形胶 质细胞的激活由于其调控的复杂性和作用的多样性 一 直是研究的热点.已有研究表明,细菌脂多糖 (1ipopolysaccharide,LPS)可以通过活化蛋白激酶C (PKc),激活其下游的信号分子,上调TNF-a,IL-lO 的表达水平活化星形胶质细胞u,但其作用的具体 分子机制尚不完全清楚,其底物作用的方式也有待 解剖38卷,1期 进一步研究.SSeCKS(Src抑制的蛋白激酶c的底 物)既是PKC的结合蛋白同时也是PKC的底物. Kitamura【3等发现,在炎症反应过程中,SSeCKS在脑 组织中的表达明显增高.ke【4等研究表明,SSeCKS 在星形胶质细胞有表达,并在血脑屏障功能的成熟 和维护中发挥重要作用.由此,我们推测SSeCKS可 能参与到中枢神经系统的炎症过程.本研究检测 LPS对星形胶质细胞中SSeCKS表达的影响,为进一 步揭示星形胶质细胞的激活机制提供了新的思路. 材料和方法 1.材料 1.1实验动物:1—2d的SD大鼠(由南通大学实 验动物中心提供). 1.2试剂:DMEM/F12培养基购于Gibco公司, LPS购于EcoH公司,异硫氰酸荧光.鬼笔环肽(FITC- phalloidin)购于MolecularProbes公司,ECL购于 Pierce公司,兔抗绵羊荧光二抗(rabbit—anti—sheep— rhodamine)购于Jackson公司,抗丝氨酸磷酸化的 PKC底物抗体购于CellSignaling公司,抗GFAP(al fiuaryacidicprotein)单克隆抗体,抗p.actin单克隆 抗体,抗SSeCKS多克隆抗体,选择性PKC抑制剂 R0—31-8220均购于Sigma公司. 2.方法 2.1新生大鼠大脑皮层星形胶质细胞原代培养: 参照McCarthy等方法,并加以改良.取出生1— 2d以内的新生SD大鼠l0只.75%的酒精浸泡消 毒后,采用无菌方法迅速取出大脑,用预冷的D— Hanks液清洗并剔除脑膜,血管,海马,取大脑皮质, 置于DMEM基础培养基中剪碎.吸管吹散组织,静 置,取上清过滤(400目尼龙滤网),反复3次,取滤 液,800r/rain离心5min后,弃上清,加人DMEM/ FI2完全培养基(含15%新生小牛血清),吸管吹散, 制成细胞悬液.将悬液接种于已铺鼠尾胶的培养瓶 中.密度约5×10/cm2,于37~C,5%Co2培养箱中 培养.3d后换液,以后每3d半量换液1次.910 d后细胞已基本融合.将培养瓶置于37~C恒温旋转 摇床215r/min,20h后除去悬浮的细胞,D.Hanks液 清洗3次,进行传代培养即得纯化的星形胶质细胞. 2.2细胞分组培养:将处于对数生长期的星形胶 质细胞随机分为:(1)空白对照组;(2)LPS单一刺激 组:取LPS终浓度分别为1vg/L,10tLg/L,100t~g/L, 1,ng/L,10mg/L作用于细胞8h;取LPS终浓度均为 100L,刺激后继续培养时间分别为1h,3h,6h, 12h,24h.(3)LPS联合RO.31.8220刺激组:RO.31. 8220预处理细胞30min后给予LPS(终浓度为 100L),刺激时间为6h. 2.3Westernblotting:收获各组培养细胞,提取蛋 白.改良l~wry法进行蛋白定量后,用6%SDS— PAGE凝胶电泳分离蛋白,蛋白上样量40g.转膜 后,以5%rI’BsT脱脂奶粉封闭液室温封闭2h,抗 SSeCKS多克隆抗体(1:2ooo)稀释,抗丝氨酸磷酸化 的PKC底物抗体(1:2ooo)稀释,4~C孵育过夜.相 应HRP耦联的二抗(1:2ooo)稀释,室温孵育2h.洗 涤后以ECL发光底物显影,分别显示SSeCKS蛋白 表达水平及其丝氨酸磷酸化水平.p—actin作为内 参,检测蛋白表达量的差异.本部分实验重复3次. 2.4RealtimeRT-PCR:用TRIz0l试剂提取细胞总 RNA.Fermentas公司逆转录试剂盒逆转录eDNA,并 以此为进行荧光定量PCR仪检测.以&M基 因的表达作为内参.目的基因SSeCKS引物序列为: 上游引物5一AAGTGCTGGCTrCGGAGAAAG-3,下游 引物5一TGACTIEAGGAACTICAAGGCTC一3,探针序 列为5(FAM)一AGCCTGTCCAGTCTCAGAGCCCTGrI’G一 (rAMRA)3;内参照以&M上游引物序列为5一 GTC唧rACArCCrGGCTCACA.3,下游引物序列为 5一GACGG1:rI耵GGGC1?Cq3”CA一3,探针序列为5’ (FAM)一CACCCACCGAGACCGATGIlA队rGCrIC一 (TAMRA)3(上海博亚生物技术公司合成).数据处 理方法:以同一份标本SSeCKS拷贝数/&M拷贝数 表示SSeCKS基因的表达水平,定义为SSeCKS (normalizedSSeCKSexpressionleve1),并以此值作图. 3次独立实验,每次实验重复3次. 2.5荧光细胞化学分析法:纯化的星形胶质细胞 以5×104/ml的密度接种于10mm×10mm小圆盖玻 片上.3d后,0.01mol/LPBS洗涤细胞爬片,于4% 多聚甲醛中固定1h(4?)后,以正常兔血清室温封 闭1h.抗GFAP(1:800)单克隆抗体4?孵育过夜, FITC标记的荧光二抗孵育lh,Hoechst染胞核30 min.于Leica荧光显微镜下观察.对于LPS(终浓 度100t~g/L)刺激后继续培养的星形胶质细胞,加抗 SSeCKS(1:150)抗体4~C孵育过夜.洗涤后以TRITC 标记的荧光二抗(Rabbit.Anti.Sheep.Rhodamlne)4~C孵 育1h,并与FITC.phalloidin及Hoechst共染,封片后在 LeicaSP2型CLSM激光共焦显微镜下观察. 2.6统计学处理:运用Stata7.0统计分析软件, 进行单因素方差分析,检验水准设为0.05. ‘ 结果;口木 1.GFAP检测结果 经GFAP检测证实,分离纯化的星形胶质细胞 纯度达98%以上(图1A?1C). 2.LPS诱导星形胶质细胞中SSeCKSmRNA水平的 改变 沈爱国等.细荫脂多糖对培养星形崆质细胞中Src抑制的蛋白激酶 与空白对照组相比.u可上调SSeCKS表达 量:当LPS作用浓度为I}增,L和【OL时,SSeCKS naRNA水平上调(P<0.05);当LPS作用浓度为1130fL 和1n/L时.差异具有显着性(P(0.01)(图2)一 3.LPS对星形胶质细胞中SSeCKS蛋白表达的影响 在LPs单一刺激浓度组,当LPS.终浓度为100 ,I时,SSeCKS蛋白表达量最高.在此浓度作用 下.SSeCKS蛋白表达量于3h开始升高,6h达表达高 峰.至24h仍维持在较高水平(图3). 蠢?喜 LPS捌量 圉2不同枨匪1.Ps对垦形肢菔细胞SSeCKSmPdtA水平的影蛹 注:1对照组;2l,L组;310p#L垣;410L蛆;51mL 组;#与对麒组比鞍.P(005{*与对照蛆比较.P<001 Fig2RealtimePCRrRNAlevelasnk-SSeCKSofd/ffe~nt eDneentmtliong?Ps Nole:】,c~,otrol}2【ttglL;3一Ig/L;4-lcg,L;5,【?ls/L Compare1with?P(005;C0删mrwithc<mt~ltP<Oal LPSIc?儿LPS811 SSeCKS IhgtITt 3【JJ?星形胶屡细胞q强:CKS蚩闩表选柏响 }’ig3ElfrotLPScpml|iljc~pre~.il…?filISS-CKbl I口blottinganalysis 4.LPS诱导星形胶质细胞中SSeCKS亚细胞定位 的改变 在正常对照组l图4A,4C).SSeCKS广泛均一 地分布于细胞质.在胞膜边缘和褶皱处略有壤集;在 LPS单一刺激组(图5A,5C).SSeCKS在校周明显 宦集,同时高表达于细胞伸出的足突边缘 5.PKC抑制剂抑制LPS对SSeCKS细胞内定位及 磷酸化水平的影响 在RO一3I.8220单独作用F,星形胶质细胞内 SSeCKS磷酸化水平与对照组相比明显下降;其蛋白 表达及细胞内定位与空白对照未有明显的改变f图 6A一6C.图8】=在RO.3l-8220与EF’S联合刺激组, SSeCKS的表达较空白对照组增加,与LPS单一刺激 组无明显差异;其磷酸化水平较对照组和单一刺激 组均有明显降低(图8);该组SSeCKS的亚细胞定位 与对照组也无明显差异(图7A,7C). 图8LPS.单一刺澈组和u,RO-31.B2加复台剌融组中SSeCKS 磷酸化水平的比较丹析 Fig8Comparlso~tqfSS,*CKSp}’phorylafionlevel…mestr~ed andmultiplestresoled 讨论 在内毒素脑损伤中,脑组织早期即有炎症细胞 的浸润作为CNS中的重要免疫细胞.星形胶质细 胞被激活.同时产生大量细胞因子,如TNF—a,lL一1 等,能发挥促炎作用,激l发细胞的防御反直,促进损 伤的修复,有保护神经元的功能;但星形胶质细胞过 度活化可导致炎症因子的过度释放,囊腔形成和胶 质瘕痕化,这些电是加重CNS病理损伤的诱因. 因此,进一步分析星形胶质细胞的活化分子机制有 利于更深人了解中枢神经系统的炎症病理.既往研 究表明,多种机制参与星形腔质细胞的激活.其中. PKC参与调节活化过程中细胞的骨架改变.因子释 放及增殖,迁移等行为,但其中的具体机制还未 得到阐明. 本研究的对象SSeCKS是一种细胞骨架蛋白 它既是PKC的底物也是PKC的结合蛋白本实验 结果表明.在LPS怍用下.星形胶喷细胞中S~CKS 的mRNA水平和蛋白表达水平增高.掉具有明显的 时间及浓度依赖关系,提示它是一种炎性蛋白.参与 炎症过程 为了解SSeCKS足否参与u咚激活PK(:活化星 形胶质细胞的信号通路.我们观察了LPS对PKC的 澈话作用j支其与SSet;KS的关系结果发现,在LPs 作用下.用抗丝氨酸磷酸化的PKC喊物抗体可检测 到SSeCKS活性的增高;与此同时.SSeCKS在细胞内 重新分布:由胞装向棱周迁移,于胞膜足突浓集.这 类似于佛渡酯激活PKC后活化SSeCKS并引起晤者 在细胞内的重分布’而用选择性的PKC的抑制 剂Ro一3l一8220可以阻断SSeCKS在胞内的重排及磷 酸化水平的上调.这些现象提示.LPS作用后 SSeCKS亚细胞定位的改变有赖于PKC活性的增高 一, ?幡??. 罩0一<zE0?*至! 晕甏霉<zE乏 4#R_核周的聚集改变相伴.由此推测,在炎性信号的 传递过程中,PKC的活化使其底物SSeCKS磷酸化, 后者则通过向核周聚集影响PKC的亚细胞定位,继 而影响炎性信号的传递.结合以往文献报道中 SSeCKS与细胞周期蛋白结合调节细胞有丝分裂,与 肌动蛋白结合影响细胞形态和迁移等方面的作 用?卜”],推测它可能参与星形胶质细胞活化后增 殖,变构,迁移及炎性因子释放等过程. 综上所述,SSeCKS可能通过PKC介导的信号通 路参与炎症过程中星形胶质细胞活化,这为进一步 了解星形胶质细胞的激活机制提供了基础,也为探 索干预CNS炎症反应提供了新的策略. 参考文献 l1JFanlknerJR,HerrmannJE,WooMJ,eta1.Reactiveastroeytes呻tect tissueandpreservefunctionafterspinalcordinjury[J].JNeIlr08cj, 2OO4,24(9):2143-2155. 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