Nemo样激酶抑制中枢神经系统炎症过程中神经元的凋亡（可编辑）

Nemo样激酶抑制中枢神经系统炎症过程中神经元的凋亡（可编辑） Nemo样激酶抑制中枢神经系统炎症过程中神经元的凋 亡 生 月第 卷第 期 , . . . . 基础研究 . 样激酶抑制中枢神经系统炎症 过程中神经元的凋亡 季伙燕 王惠民 【摘要】 目的 研究样激酶,在中枢神经系统炎症过程中的作用。 方法 构建 大鼠侧脑室注射脂多糖 诱发中枢神经系统炎症模型;构建谷氨酸盐诱导细胞凋亡的神经元凋亡模型;构建过表达和干扰质粒。利用 、免疫荧光双标、 细胞凋亡检测等方法检测的表达和定位情况。结果 炎症产生后,大鼠大 脑组织中表达水平下降. ~ . ,均.;仅表达在神经元中;表达水 平的下降伴随神经元的凋亡而发生. ,.;过表达可减少谷氨酸盐诱导神经元凋 亡的数量. , . ;干扰表达后,引起相同数量神经元凋亡所需的谷氨酸盐浓度显 著降低. ,.。结论 在中枢神经系统炎症过程中,可抑制神经元凋亡。 【关键词】 中枢神经系统感染; 炎症; 丝裂原激活蛋白激酶类;细胞; 神经元; 细胞凋亡 , ? , , , , : ? , : ... 【 】 ?.. . . ?. ? ., , 一. .. .。 ., ., ....?. ,.. , . ,. . . 【 】; ;? ; ; ;在中枢神经系统中,主要由小胶质细胞和星形胶 样激酶, 是 世 质细胞介导炎症反应 ,这 种细胞分泌的炎症因子 纪 年代末学者们在研究红鳍东水纯神经纤维瘤 病 型 基因时,在其 非 可诱导神经元凋亡,从而导致中枢神经系统不可逆性 编码区发现的一个新基因。大量研究表明,在 损伤口。在已有关于在中枢神 经系统炎症模型 脑组织中高表达,但至今为止,在中枢神经系 和神经元凋亡模型中的作用的研究 基础上,我们 统中的作用仍然没有被阐明 。 初步研究了在中枢神经系统中的作用。 : ./ .. ... .材料和方法 作者单位: 江苏省南通市,南通大学附属医院医学检验 .构建中枢神经系统炎症模型: ~ 周龄中心 通信作者:王惠民,: ... 雄性大鼠 南通大学动物实验中心提供只,分为年 月第 卷第 期.堑: : :. , ?孵育过夜,然 正常组、阴性对照组和炎症组,其中炎症组按不同时 后再用 洗片 × 次,之后分别加异硫 间点分为 组 、 、 、, 、 , 、 周 ,每组 氰酸荧光素 和 标记的二抗, ?避光放 只。用 %水合氯醛将大鼠麻醉,然后用大鼠立体 置,再用 ×避光洗片× 次,擦干玻 定位仪将其固定,暴露前囟点,并用棉签将脑膜拨 片并加封片剂封片 避光 ,最后用荧光显微镜观察 开。以前囟点为中心,按照前后位 ,左右位 结果。 .将微量注射器针尖固定,将硬脑膜钻穿,然 .细胞培养及细胞蛋白电泳分析:高分 后以硬脑膜为起点,向下进针 .抵达右侧脑 化的神经元细胞系细胞 本实验室自行保种 室,再将脂多糖 , . 溶液 缓慢注 所用 的培 养基 为含 % 胎 牛血清 人侧脑室中,注射速度为 / ,留针 ,以 / 的速度缓慢退针 。阴性对照 组只注人,加入/ 谷氨酰胺和 %?双抗的 完全培养基,置培 生理盐水。炎症组所有大鼠作用时间都从针 养箱中培养。将 细胞悬液接种于 孔板中 尖退出侧脑室起计时。× 孔 ,待细胞 %一 %融合后,用 、 .大脑组织提取及冰冻切片制备:炎症组在 . 、 . 、 、 、 、 / 共 种不同浓度的谷 作用 、 、 、 , 、 , 、 周 后,阴性对照组 氨酸盐刺激各孔细胞,继续培养 后,每孔加入后取材。用 %水合氯醛将大鼠麻醉,每组中 细胞蛋白裂解液,用细胞刮子将蛋白刮下,并 只大鼠用于新鲜大脑组织的提取,并将脑组织立刻 存放至一 ?备用。另外 只大鼠用于冰冻切片 将蛋白在沸水中煮 ,然后 ? /离心,取上清用于蛋白电泳分析。 制备,首先用 %多聚甲醛灌注,将大脑完整取出, .细胞转染:将 细胞悬液接种于 孔板 取出后继续用 %的多聚甲醛固定,待脑组织沉底 中 × 个/孔 ,用无双抗完全培养基培养过夜 后更换 %蔗糖溶液,待再次沉底后更换 %蔗糖 溶液 终极储存液 ,再次沉底后即可进行冰冻切 后,更换新鲜无双抗完全培养基继续培养。转染时 铺板体积为 ,首先将 脂质体片,切片厚度为,一 保存备用。 与 . 一质粒 引物序列:上游 . . 分析:取大脑组织 置于 组织裂解液中冰浴匀浆,并加入蛋白酶抑制剂一 ;下游 一 一 ,酶切 ,匀浆后 ?/ 离心后取上 清,用/,管分装,一 ?保存备用。临用前每 位点: 和或. ? 管分别加入二硫苏糖醇, , ×十二烷基 质粒 引物序列分别为: :上游 一 ? 丫? 硫酸钠 , ,并在沸水中煮,取 不 . ;下游一? 蛋白进行电泳 电泳条件: , , ’ ? 湿转。硝酸纤维素膜用 %的脱脂牛 奶封闭,然后加入抗一抗 :, 。 :上游 . ? 或抗诱导型一氧化氮合酶一抗 :, , ?孵育过夜,再加 . ;下游 . ? 一 。 入酶标二抗室温孵育 : ,,最后用增强型化学发光剂检测蛋白:上游一 删 ? 条带 , 。的相对分子质量 一 ;下 游一. 为 ,的相对分子质量为 ,和 的表达水平以的灰度值与内参照甘油醛一 .分 别 稀 释 于 一磷酸脱氢酶 的灰度值的相对值表示。 培养基中,室温下静置后将二者轻轻混 .组织免疫荧光分析:将冰冻切片取出,置于 匀,再室温静置 ,然后加入各孔中,继续培养?复温 ,用 ×液洗片 × 次。后更换新鲜无双抗完全培养基, ~后再用 将切片擦干,加驴血清室温封闭。接着加入一 / 的谷氨酸盐刺激各孔细胞, 后提取 抗: :、胶质纤维酸性蛋白 , :, 细胞蛋白进行蛋白电泳分析。 、 : , 、神经元核抗原 , .一 一 细胞凋亡检测:将 年 月第 卷第 期, . : 周时不再上升 图 。 细胞悬液接种于 孔板中×~ ×.主要定位于神经元内:我们用免疫荧光 个/孔 ,细胞 %~ %融合后,用各种不同浓 度的谷氨酸盐刺激细胞,继续培养 后,每孔中 双标技术检测了与神经元、小胶质细胞和星形 胶质细胞的共定位情况,结果发现在正常和炎症脑 加入 . 溶液,继续培养至各孔培养基变 色时,在 波长下读取各孔光密度 值 ,与 组织中,与小胶质细胞和星形胶质 细胞均无共 定位,而与神经元共定位几乎完全一致 图 。 细胞凋亡数呈反比。 .统计学处理:所有数据以 ? 表示,数据采 正常 阴性 对照 对照 周 周 用统计学软件进行处理,各组计量数据采用 检验。. 时认为差异有统计学意义。 结 果 工 工 工 工 .大脑组织中炎症因子在炎症产生后表 达增加:分别提取各组大鼠大脑组织进行芏 分析。刺激 后 开始上升 与 正常 对照组比较:.,与阴性对照组比较: .,均., 后进一步升高 .、 .,均.,持续上升至 达顶峰, 周后 删 僻王盆 《 靛 表达显著下降 图 ,表明炎症反应自行缓 解。是一种常见的急性炎症因?子 ,加 : 埔 ?的 表 叠加 达水平是炎症模型构建成功与否的良好指标,以上 结果表明模型构建成功,且成功构建模型所需时 正常对照 间?。 正常 阴性 对照 对照周 周 炎症脑组织 删 僻 正常对照 雹 口 尝莨 罂 炎症脑组织 与正常对照组和阴性对照组比较, . , . 图检测炎症反应前后蛋白的表达 .炎症产生后表达水平下降:分别提取 各组大鼠大脑组织进行分析。随着炎 症的产生,表达水平逐渐下降,时的 海马 表达量与正常组或阴性对照组相比,差异有统计学 意义 . 、 .,均.,至时达最 低点 .、 . ,均.。的表达 图 免疫荧光双标检测炎症反应前后阳性细胞定位情 在第 天时开始上升,第 天时的表达与 况。阳性细胞与小胶质细胞和星形胶质细胞均无共定位 时的差异有统计学意义 .,.,至、 ,而与神经元共定位几乎完全一致 年 月第 糟第 期 , , . , . 谷氨酸盐 .过表达后抑制神经元凋 正常 谷氨 谷氨酸盐 正常 过 空质粒 对照 酸盐 空质粒 过表达质粒 对照 表达质粒 亡:使用谷氨酸盐刺激细胞后,随着谷氨酸盐浓度的增加,神经元发 生显著凋亡,在谷氨酸盐浓度为 棚 ./ 时神经元凋亡最为显著 。..,. ,图。同时的 魏 著. 宕 . 表达水平也随之不断下降,同样也是 窘黯 砉..? . 。 在谷氨酸盐浓度为 / 时表达 靛 . 水平最低 .,. ,图。 我们构建了过表达质粒,并将其 过表达质粒 转染入 细胞中,结果发现转入过表达质粒与转入空载体组或正 ? 与正常对照组比较,. ; 与谷氨酸盐 空质粒组比较,. 常对照组相比,在谷氨酸盐刺激后, 图 方法检测过表达质粒的构建,的过表达对谷氨酸盐 。 如 的减少量差异有统计学意义 诱导神经元凋亡有抵抗作用,的表达较谷氨酸盐刺激组和谷氨酸盐 空质粒 组 高 . ,. ,图 ,同时神经元凋 亡的减少差异也有统计学意义 果发现 的干扰效率最高,干扰效率达 %左右, .,. ,图 。 与正常对照组比较差异有统计学意义 : ., . . ,图 。在谷氨酸盐刺激下,转入 干扰 . 质粒组与转入空载体或正常对照组相比,引起神经 赧 . 元等量凋亡所需的谷氨酸盐浓度大大降低,差异有躲 . 统计学意义.,. ,图 。 彀 饔 .... 巅 正常 . 对照 谷氮酸盐浓度 霉 . / 餐 . 罂 正常对照 .. . 谷氨 谷氨 谷氨 正常 谷氨酸盐 谷氨酸盐 酸盐 酸盐 酸盐 对照 乱序过表达质粒 空质粒 干扰质粒 特异性 干扰质粒 “与谷氨酸盐 空质粒组比较,. ; 与谷氨酸盐 特 琵 异性干扰质粒组比较,. 量. 图凋亡试剂盒检测过表达和将干扰两种不 同情况下谷氨酸盐诱导神经元凋亡的情况。的过表达对谷 鞲 氨酸盐诱导神经元凋亡有抵抗作用,神经元凋亡数减少 讨 论 与正常对照组比较,. 图 不同浓度谷氨酸虢对细胞的促凋亡作用,/ 主要定位于脑组织中 ,目前研究较多的 谷氨酸盐作用下神经元凋亡最为显著;的表达随着 是其在乳腺癌中的作用,在乳腺癌中通过抑制 细胞凋亡逐渐减低, / 谷氨酸盐作用时表达最低/信号,从而抑制乳腺癌的发生发 展 。也有研究发现,能抑制某些转录因子 .干扰表达后增加神经元的凋亡:为了 的活性,包括核因子一 等一些与炎症相关的因 进一步验证抑制神经元凋亡的功能,我们还构 子? 。在本组研究中,我们发现在后续的神 建了的?质粒,首先检测了的干扰 经元凋亡过程中发挥抑制神经元凋亡的作用。效率,将质粒转入细胞并检测的表达,结 抑制神经元凋亡的分子机制研究得还不清楚。在中