β-环化酶反义基因对胡萝卜茄红素含量的影响

β-环化酶反义基因对胡萝卜茄红素含量的影响 β-环化酶反义基因对胡萝卜茄红素含量的 影响 西北植物,2007,27(11):2228—2232 ActaBot.Borea1.-Occident.Sin. 文章编号:1000—4025(2007)1卜2228—05 茄红素一I];一环化酶反义基因对 胡萝卜茄红素含量的影响 梁燕,陈大明,王鸣,陈杭 (1西北农林科技大学,陕西杨陵712100;2国家蔬菜系统工程中心,北京100081) 摘要:以根癌农杆菌GV3101为介导,用茄红素一pI环化酶(1ycopenebatecyclase-LYC—B)5端反义基因对胡萝卜 (DaucuscarotaL.var.sativa)进行了遗传转化,经胚发生途径得到抗性植株.GUS检测和Southern杂交表明LI的 基因已整合到胡萝卜基因组中,DotBlot显示目的基因在受体植株中已表达,茄红素和胡萝卜素检测结果表明,转 基因愈伤组织茄红素含量高于胡萝卜素含量. 关键词:胡萝卜;茄红素一B一环化酶;反义基因;茄红素含量 中图分类号:Q789文献标识码:A InfluenceofAnti—SenseLYC-BGeneonLycopeneSynthesisinDaucuscarota LIANGYan,CHENDa—ming,WANGMing.CHENHang (1NorthwestA&FUniversity,Yangling,Shaanxi712100,China;2NationalVegetable SystemEngineerCenter,Beijing100081. China) Abstract:Hypocotylsofcarrot(DaucuscarotaL.var.sativa)wereinfectedwithAgrobacteriu mtumefaciens GV31Olcontaininganti—senseLYC-Bfragmentat5end.TheregeneratedplantswereobtainedthroughSO— maticembryogenesis.GUSstainingandSouthernhybridizationindicatedthatthetargetgene hasbeenin— troducedintothegenomeofcarrot.RNAdotblotshowedthattheintroducedgenehasexpresse dintrans— genicplants.Thelycopenecontentishigherthanthatofthecaroteneinthetransgeniccalli. Keywords:Daucuscarota;lycopenebatecyclase(LYC—B);anti— sensegene;lycopenecontent 茄红素的强抗氧化特性对人类的营养和保健及 一 些癌症的预防具有很高的价值],但在自然状态 下,多数植物中的茄红素含量均较低.因此,如何提 高植物中茄红素的含量受到普遍关注.对于茄红素 合成代谢途径以及影响因素,合成过程的关键酶以 及酶之间的相互作用关系都有大量研究].由于 茄红素是植物类胡萝卜素代谢的中间产物,类胡萝 卜素代谢属于植物类异戊二烯合成代谢的一部分. 类异戊二烯合成代谢是一个极其复杂而庞大的代谢 系统,受到发育阶段和生长环境等诸多因素的影 响].通过基因工程技术实施茄红素合成关键酶基 因调控以提高植物中茄红素含量成为近年来研究的 热点. 八氢番茄红素脱氢酶是茄红素合成上游关键酶 之一,有人将光合细菌八氢番茄红素脱氢酶基因 (crtI)转入番茄中,使得胡萝卜素的含量比对照提 高了3.5倍,而茄红素的含量没有提高].在类胡 萝卜素代谢链上,茄红素是胡萝卜素的合成前体物, 这项研究结果表明,如果只是增强有关茄红素合成 酶基因的表达,而不阻断茄红素向胡萝卜素的转化, 收稿日期:2007—01—04;修改稿收到日期:2007—09—19 基金项目:国家自然科学基金项目(30070525);北京市科技新星项目(9558101400) 作者简介:梁燕(1963--),女(汉族),博士,教授,博士生导师,主要从事番茄育种与蔬菜 种质资源研究. l1期梁燕,等:茄红素一B一环化酶反义基因对胡萝卜茄红素含量的影响 就很难达到提高茄红素含量的目的. 反义技术是抑制基因表达的有效途径.],在 蔬菜方面,番茄1一氨基环丙烷基羧酸(ACC)合成酶 的反义研究较多且取得一定成效l_8].茄红素一J3一环 化酶是茄红素向胡萝b素转化的关键酶,在增加上 游合成酶提高茄红素含量无效的情况下,研究的方 向和重点转移到了抑制茄红素向胡萝b素的转化的 关键酶——茄红素一p一环化酶活性上,几种蔬菜的茄 红素一p一环化酶基因先后被克隆l_gj,利用反义技术抑 制该酶的研究业已展开l1.'"j. 作者于2002年构建了胡萝b茄红素一J3一环化酶 反义基因表达载体并对烟草进行了遗传转化口,在 验证了载体正确性和抑制有效性的基础上,开展本 项研究.将茄红素一p一环化酶(LYC—B)反义基因转 入胡萝b中,通过转基因组织茄红素和胡萝b素含 量变化的比较,研究LYC—B反义基因对茄红素含量 的影响,以期为利用反义技术对茄红素合成代谢进 行人为调控提供理论与基础. 1材料和方法 1.1植物材料 胡萝b(Daucuscarotavat.sativa)品种'华育二 号',种子由北京市蔬菜研究中心提供.将胡萝b种子 去毛,于1AgNO3中浸泡30min,无菌水冲洗3,4 次,用无菌滤纸吸干种子表面的水分,于1/2Ms固体培 养基上,28~C,暗培养5,7d,使下胚轴充分伸长. 1.2载体构建与农杆菌的转化 利用国家蔬菜系统工程中心品质改良实验室克 隆的胡萝b茄红素一p一环化酶基因5端非编码区在 内的397bp反义基因和GUS报告基因的植物表达 载体(anti—LYC-b5+GUS)/pBINPLUS(图1),大 约12.8kb,采用三亲杂交法转化到根癌农杆菌 [Agrobacteriumtumefaciens(SmithetTownsend) Conn.]GV31Ol中. anti.LYC—b5'Nos—terCaMV35S HindIIISphIPstIXbaIBamHISmaISacIXbaIBamHISmaISacIEcoRI 图1(anti—LYC-b5+GU5)/pBINPLUS质粒图谱 Fig.1Thediagramof(anti—LYC-b5+GUS)/pBINPLUS 1.3遗传转化与植株再生 1.3.1农杆菌的培养与遗传转化挑取含有(anti— LYC-b5+GUS)/pBINPLUS的GV3101单菌落, 于含有100mg/L利福平,300mg/L链霉素和100 mg/L卡那霉素的YEB液体培养基中,28?,150r/ min恒温培养过夜,当OD..约为0.5左右时,4?,5 000r/min离心10min,弃上清,沉淀菌体重悬于1/ 2MS液体培养基中. 将5,7d苗龄的胡萝b下胚轴切成1cm左右 的小段,浸入重悬的农杆菌液中10min后,用无菌滤 纸吸去多余的菌液,接种到共培养基(B5+1mg/I NAA+0.5mg/LBA)上,28?,暗培养2,3d. 1.3.2抗性愈伤组织的诱导与抗性植株的再生 将外植体转接到含有抗生素的抑制培养基(B+1 mg/LNAA+0.5mg/LBA+500mg/LCarb)上, 28?暗培养,2周后转入选择培养基(B+1mg/L NAA+0.5mg/LBA+100mg/LKan+250mg/L Carb),25?光照培养,诱导抗性愈伤组织. 愈伤组织在选择培养基上每2,3周继代1次, 3,4次继代后转入分化培养基(B+25mg/LKan +100mg/LCarb)中,诱导愈伤组织分化形成胚状 体进而发育成苗.抗性植株在三角瓶中长出3,4 片叶时转入蛭石中,待长出7,8片叶时移入盆中于 温室生长. 1.4转基因植株的检测与鉴定 1.4.1GUS检测口用甲醇:X—gluc贮存液体积 比为1:4配制成X—gluc工作液,从植株上随机取1 片叶子,加入适量的工作液于37?过夜,用70的 酒精脱色. 1.4.2Southern杂交口取盆栽的GUS检测阳 性株和未转化的胡萝b叶片5,8g,采用CTAB法 提取总DNA[].取8btgDNA用Hind?消化过 夜,阳性对照质粒(anti—LYC-b5+GUS)/pBIN— PLUS同样用Hind?消化,消化完全的酶切液经 0.7琼脂糖凝胶于30V电泳过夜.用碱转移 法转至Nybond—N尼龙膜上.用放射性标记的 西北植物 397bpLYC-b5片段为探针进行杂交,杂交在中国 科学院遗传研究所完成. 1.4.3RNAblotl1分别取0.1gSouthern杂交 阳性植株和未转化的胡萝卜叶片,采用Tripure (Roche)一步法提取总RNA并沉淀于1mL75乙 醇中,于一80C保存备用.RNAblot时,首先测定 RNA含量,计算加样量.然后进行RNA变性,点 样,杂交时用DIG标记的LYC-b5作探针,Nybond— N尼龙膜作为载体,x一光片曝光,显影. 1.4.4转基因植株愈伤组织的诱导以Southern 杂交阳性植株的无菌新生叶片和叶柄作为外植体, 于培养基(B+lmg/LNAA+0.5mg/LBA)上诱 导愈伤组织,愈伤组织形成以后,给培养基中加入 25mg/LKan培养2周后,进行茄红素和胡萝卜素 含量的测定. 1.4.5茄红素及胡萝卜素含量的测定口.采用丙 酮提取直接比色法,以丙酮为空白对照分别测定在 470,450nm处的光吸收值. 2结果与 2.1GUS检测 用GUS染色法对抗性再生植株进行跟踪测试, 2 ?1II 图2转基因植株GUS检测结果 1,2.GUS检测阳性;3.GUS检测阴性 Fig.1GUStestofcarrotplantsinfectedby GV3101with(anti—Lye65+GUs)/pBINPLUS 1,2.LeafpositivetoGUStest;3.LeafnegativetoGUStest 随时淘汰阴性反应植株,在6棵抗性植株中4株 GUS检测呈阳性(图2),对阳性植株进一步作 Southern杂交鉴定. 2.2Southern杂交 Southern杂交结果如图3所示.可以看出,阴 性对照植株中有1条带,而在泳道3,4和6分别有 2或3条带,比阴性对照多出1条或2条带,泳道5 和阴性对照相同只有1条带.这是因为茄红素一G一 图3GUS检测阳性植株总DNA的Southern杂交结果 1.质粒(+CK);2.对照植株(一CK),3,6.GUS检测阳性植株 Fig.3SouthernhybridizationofgenomicDNAfrom carrotplantswithpositivereactiontoGUS 1.Plasmid[antiLYC-b5+GUS)/pBINPIus](+CK); 2.Un—transgenicplant(一CK);3,6.Plantswith positivereactiontoGUS 2 ?图4转基因植株RNA点杂交(每点使用5p-g叶片总RNA) 1.未转基因植株(CK);2.转基因植株 Fig.4TransgeniccarrotRNAdotblotusing 5p-gleaftotalRNAforeachdot 1.Un—transgenicplant(7cgp;2.Transgenicplant 转基冈椅株Transgenicplant末转冈楠株(cK)Un—transgenicplant 图5反义LYC-b51基因对胡萝卜植株生长的影响 Fig.5Effectofanti—LYC-b5oncarrotgrowth 1l期梁燕,等:茄红素一环化酶反义基因对胡萝卜茄红素含量的影响2231 环化酶(LYC—B)是胡萝卜自身具有的一种酶,而且 茄红素一环化酶基因(LYC-b)在胡萝卜中是单拷贝 存在的.所以,阴性对照植株和泳道5的条带是内 源基因与探针杂交的结果.其它3个泳道(泳道3, 4和6)中除与阴性对照相同的条带是胡萝卜本身具 有的单拷贝LYC-b与探针杂交的结果外,其余的杂 交带均为转人的anti—LYC-b5基因与探针杂交的 结果,说明目的基因已整合到这些泳道DNA来源 的胡萝卜植株的染色体上.不同的条带位置和数目 说明T—DNA整合到染色体上的位点和拷贝数不 同.可以看出,泳道6的拷贝数为1,泳道3,4的拷 贝数为2. 2.3反义LYC-b5基因在胡萝卜植株中的表达 反义基因转录出相应的RNA是其对靶基因实 施调控的前提.提取Southern杂交泳道4植株的 RNA,以DIG标记的LYC-b5片段(397bp)为探针 进行RNA点杂交.结果(图4)表明,转基因胡萝卜 叶片总RNA与探针的杂交信号明显强于未转基因 的阴性对照.阴性对照植株的杂交信号是胡萝卜自 身LYC-b基因转录出的RNA与探针杂交的结果, 而转基因植株杂交信号比阴性对照强,说明除胡萝 卜自身LYC-b基因转录出的RNA外,人为附加的 由花椰菜芜菁花叶病毒35S启动子驱动的反义 LYC-b5基因得到了表达,转录出了对LYC-b5特 异的RNA,与探针具有特异性的RNA的量增加, 信号增强. 2.4LYC-b5反义RNA对胡萝卜内源LYC-b表达 的影响 反义LYC-b5基因转录出的RNA如果对胡 萝卜内源LYC-b的表达有抑制作用,那么转基因植 株中茄红素一G_环化酶就不能形成或者形成量将会 降低,就会导致转基因植株中茄红素向胡萝卜素转 化被阻遏或转化量降低.为了进一步证明转人的反 义LYC-b5基因转录的产物对胡萝卜茄红素代谢 的调控作用,用+1mg/LNAA+0.5mg/LBA +25mg/LKan诱导经Southern杂交和RNA点 杂交鉴定的转基因植株形成愈伤组织,并对愈伤组 织的茄红素和胡萝卜素含量进行了测定,结果如表 1,转基因愈伤组织中茄红素含量高于阴性对照,而 且转基因愈伤组织中茄红素含量均高于胡萝卜素含 量,阴性对照愈伤组织中胡萝卜素含量高于茄红素 含量,说明LYC-b5反义RNA对胡萝卜内源LYC- b表达具有一定的抑制作用. 2.5转基因胡萝卜的表现型 反义LYC-b5基因转人胡萝卜基因组的结果 不仅使转基因细胞茄红素的含量增加,而且也引起 了转基因植株表型的变化.对胡萝卜转基因植株进 行系统观察发现,在幼苗期,阳性株与阴性株在生长 势,叶片颜色等方面的区别没有观察到,但是随着植 株年龄的增长,两者之间出现了表型上的明显不同, 转基因植株新生叶片呈褪绿状,有些叶片整片叶呈 黄色,有些叶片出现黄色斑驳,整个植株的生长势减 弱(图5). 表1反义LYC-b5基因对胡萝卜愈伤组织 茄红素和胡萝卜素含量的影响 Table1Effectofanti—LYC-b5onlycopeneand carotincontentsofcarrottransgeniccalli 项目 Item 吸光值Absorptionvalue 转基因愈伤未转基因愈伤(cK) TransgeniccallusUn—transgeniccallus 注:*转基因愈伤组织在470nm处的光吸收值显着高于未转基因愈伤 组织. Note:*meansthattheAbs470nmoftransgeniccalliissignificanthigh— erthanthatofun—transgeniccalliat5leve1. 3讨论 茄红素是植物类胡萝卜素代谢的中间产物,类 胡萝卜素代谢属于植物类异戊二烯合成代谢的一部 分.类异戊二烯合成代谢是一个极其复杂而庞大的 代谢系统,受到发育阶段和生长环境等诸多因素的 影响Ig].因此,通过外部因子来调节类胡萝卜素代 谢进行茄红素代谢调控提高茄红素含量很难奏效. 基因工程技术使通过基因操作来调节植物类胡 萝卜素代谢提高茄红素含量成为可能.有人将光合 细菌八氢番茄红素脱氢酶基因(crtI)转人番茄中, 使得转基因番茄中胡萝卜素的含量比对照提高了 3.5倍.八氢番茄红素脱氢酶是茄红素和胡萝卜 素合成的上游合成酶,它的过量表达正向提高了茄 红素和胡萝卜素的合成前体物合成量,进而提高了 胡萝卜素的含量.由于茄红素是胡萝卜素合成的直 接前体物质,所以从这个实验结果同时可以看出,如 果顺向增强有关茄红素合成酶的表达,而不阻断茄 红素向胡萝卜素的转化,就很难达到提高茄红素含 量的目的.胡萝卜是蔬菜中类胡萝卜素代谢最为旺 盛的作物之一,可以积累大量a一和[}_胡萝卜素,所以 2232西北植物27卷 对胡萝卜实施阻断调控就有可能得到高产茄红素的 品系或材料.为此,本实验进行了反义基因的遗传 转化和表达研究,得到了转基因植株,通过South— ern,Northern杂交和茄红素与胡萝卜素的含量分 析,证明了目的基因的整合,转录和表达. LYC-b是类胡萝卜素代谢中具环类胡萝卜素形 成的关键酶,具环类胡萝卜素是植物光合作用的重 要色素,如果这类色素不能形成,植株的生长将受到 影响,严重时会导致死亡[1.如果这类色素的合 成受阻,或者某个基因突变,叶片将会出现褪绿的斑 点.本实验中转基因胡萝卜植株出现的叶片褪绿和 致谢:对曹宛虹和刘敬梅女士在杂交方面的帮助特表谢忱. 黄化现象进一步说明这种对茄红素代谢调控方法的 有效性.同时也提示我们要培养高产茄红素的胡萝 卜品种最好选用器官特异性启动子(胡萝卜根部特 异性启动子),以避免影响植株的正常生长. 本实验创制的材料可以用于茄红素代谢细胞工 程,离体培养条件下,细胞由自养型转化为异养型, 光合作用受阻不会危及细胞的存亡.为了进一步证 明这一点,在对转基因愈伤诱导再生植株的同时,进 行了悬浮培养和固体培养,结果表明转基因愈伤和 转基因悬浮细胞生长正常. 参考文献: [1]GERSTERH.Thepotentialroleoflycopeneforhumanhealth[J],J,Amer.Col1.Nutr.,199 7,16:109—126. [2]BRITTON,G.Biosynthesisofcar0ten0ids[A].InChemistryandBiochemistryofPlantPi gments(Vo1.1)[M].T,W.Goodwin,ed,Aca— demicPress,London,1986:262—327. [3]CUNNINGHAMFXJR,GANTTE.Genesandenzymesofcarotenoidbiosynthesisinpla nts[J].Annu,Rev.PlantPhysio1.PlantMo1. B0Z.,1998,49:557—583. 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