针刺促进五味子肝趋向性效应的研究

针刺促进五味子肝趋向性效应的研究 . : :,, 学号: 硕士学位 针刺促进五味子肝趋向性效应的研究 申请学位级别医学科学硕士学位 作者姓名 黄致君 陆兔林 职 称教授 指导教师姓名 研究方向中药炮制研究 学科专业中药学 日止 学习时间自 年月日 起至年月 论文答辩日期年月?日 论文提交日期年月口 学位类型医学科学硕士学位 学位授予单位南京中医药大学原创性声明 本人郑重声明:所呈交的学位论文,是本人在导师的指导下,独立进行研究工 作所取 得的成果。除文中已经注明引用的内容外,本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或 撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体,均已在文中以明确方式标 明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者需亲笔签名:季彰强 ?上年二月哆日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定,同意学校保留并向国 家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版,允许论文被查阅和借阅。本人授权南京中 医药大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索,可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 保密,在 年解密后适用本授权书。本学位论文属于不保密口。 请在以上方框内打“、/” 学位论文作者需亲笔签名: 年 月 日 导师需亲笔签名: 年 月 日南京中医药大学硕士学位论文 目 录 目录....??..?.??.......??......?...?....??. 摘要??? ?.?..??......??.?......?..??...........? 前言??..?..........??..?.. 刖吾??..?..........??..?.. 第一部分文献研究 .针药结合概述.??.??.. .针灸治疗.药物治疗.针灸与药物治疗性质和作用途径的差异是针药结合的 基础.五味子木脂素对胆汁排泄的研究? .针灸结合的机理研究 .经络腧穴理论 .小结.五味子的化学成分研究 .木脂素 .挥发油? .多糖.其他成分.五味子药代动力学研究 .五味子木脂素的药动学研究进展? .五味子木脂素在组织分布的研究? .五昧子木脂素对肝脏内代谢酶的研究??一 .五味子木脂素对胆汁排泄的研究? . 在五味子醇甲药动学研究中的应用一 . .在五味子乙素药动学研究中的应用 第二部分针药结合对急性肝损伤小鼠的保护作用的研究.材料、试剂和仪器. 实验动物.主要试剂.仪器和器材? .数据统计.实验方法 .样品溶液的制备.小鼠针刺方法和穴位选择? .动物实验方法 .肝损伤实验数据结果 .小结和讨论.,、结?. .讨论?. 第三部分针药结合对五味子木脂素药代动力学影响的研究??. .材料、试剂和仪器.. .实验动物 .主要试剂 .仪器和器材.数据统计 .实验方法?.. .对照品溶液和内标溶液的制备 .大鼠针刺方法? .标准曲线的绘制 .针刺足三里对五味子木脂素在大鼠血浆浓度的影响 .小结? 第四部分针药结合对五味子组织分布的研究??. .材料、试剂和仪器.. .实验动物 .主要试剂 .仪器和器材.数据统计 .实验方法?.. .对照品溶液和内标溶液的制备 .大鼠针刺方法? .标准曲线的绘制 .针刺足三里对五味子木脂素在大鼠血浆浓度的影响 .针刺足三里对五味子木脂素在大鼠各主要组织浓度的影响 .结果和讨论.. .大鼠血浆和组织药物浓度的测量.药代动力学.大鼠血浆和组织的采集和处 理 .小结?.. 第五部分针药结合对大鼠酶效应的研究?一 .材料、试剂和仪器.. ~ ~~ ~~ ~ ~~~ ~ ~ ~ ~ ~~~~~~~~~~~~~?~ ~ ? 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 ~ ~ ~~ ~ ~~~ ~ ~~ ~ ~ ~~~~ ~~ ~~~ ~~~~ ~ 『: ? 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一一 .~ ~~~ ~~ ~ ~~~ ~~~~~ ~~~~~~~~ ~~~~ ~ ~ 一材 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 ~~ ~~ ~~ ~ ~~~ ~~~~ ~ ~ ~~ ~~~~~~ ~ ~ ? ? ”铂娟 实主仪数 验要器据 动试和统物剂器计 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一南京中医药大学硕士学位论文 .实验方法 .样品溶液的制备?。 .大鼠针刺方法??一 .动物实验方法 .超速离心法制备肝微粒体.. .肝微粒体蛋白的测定 .细胞色素酶含量测定. .数据处理和统计.结果和讨论.牛血清蛋白标准曲线??.. .肝脏系数、肝微粒体蛋白含量和的含量比较? .刊、结?. 第六部分针药结合对大鼠胆汁排泄的影响?一 .材料、试剂和仪器.实验动物?.. .主要试剂?.. .仪器和器材.. .实验方法 .样品溶液的制备?.. .动物实验方法??.. .结果和讨论.大鼠胆汁的收集?.. .小结?. 全文小结.. .小结? .创新点 .展望?一 参考文献?摘要 中医历史上,一直有针药并用、杂合以治的观点。《内经》从理论上对针药 结合进行了初步的总结,提出针药各有所宜、针药结合相须为用的学术观点,对后 世产生了深远的影响。唐代孙思邈积极倡导针药兼用,从临床角度要求医生掌握 针灸和药物两种治疗方法,达到相须为用的境界。现代研究发现通过针药结合, 能产生新的更有利于各自作用发挥的因素。针灸调动机体内各种因素参加机体平 衡的恢复过程,为药物的作用提供较好的基础状态增加靶向性、提高药物与靶 器官的亲和力,有利于协同发挥机体平衡的恢复作用。 五味子为木兰科多年生落叶木质藤本植物【 ..的成熟果实。五味子果实味酸、甘,性温。具有收敛固涩、 益气生津、补肾宁心的功效。临床常用于治疗无黄疸型肝炎及慢性迁延性肝 炎等 肝部病症,同时用于保肝护肝,其效用为临床所验证。研究显示:五味子醇提物 及五味子乙素、醇甲等成分对化学毒物引起的动物肝细胞损伤有明显保护作用, 可抑制转氨酶的释放,使活性降低;能明显诱导小鼠和大鼠肝微粒体细胞 色素.活性,增加肝脏解毒能力;五味子对经肝微粒体代谢转化后生 成的一氧化碳及其在代谢过程中对的消耗亦能有抑制作用;五味子有助 于肝细胞蛋白质的合成,从而使线粒体恢复和增加,相应的酶活性增高,肝细胞 得以恢复和再生,发挥降酶保肝作用。 近年来。国内一些学者认为,每个穴位都有之相联系的特定的器官系统。当 该穴位受刺激后,只有与之相联系的特定器官系统会受到更大的影响。有研究发 现针刺“内关”和“太冲两穴能明显增加心脏和肝脏中川芎嗪的含量。足三里 穴位和肝脏关系密切,目前大多文献还是集中在针灸保肝护肝的作用,对机制研 究较少,如电针“足三里”等穴位能有效的保护四氯化碳、内毒素、酒精中毒、 肝脏缺血等所致的大鼠肝损伤,效果较突出。 本研究以五味子为研究对象,针灸与其联用后效应物质基础的变化,系 统开展肝靶向性分布、代谢酶活性、胆汁排泄等研究。阐明针灸能增强五 味子的肝趋向性与效应物质基础变化的相关性,从细胞和分子水平对针药结合进 行生物药剂学与药物动力学等研究,以创新性建立针药结合增强药物作用效应理 论的研究方法,为针灸促进药物趋向性理论研究建立科学的体系。 南京中医药大学硕士学位论文 本研究主要包括以下内容: 将小鼠分为空白组、模型组、阳性组、先针后药组、针药同时进行组和单 给药组。除了空白外和模型组外注射橄榄油溶液造成急性肝损伤。后 摘除一侧眼球取血,分离血清,测天门冬氨酸氨基转移酶及丙氨酸氨 基转移酶活力。结果表明:经五味子和针刺治疗,及值明显 降低,先针后药组,单给药组,针药同时进行组对小鼠的急性肝损有明显保护 作用,而且针药同时进行组效果最好。同时针药同时进行结合的实验方法操作 更简便,需要时间的更少,效率更好,因此以后的针灸方法为针药同时进行。 取针药结合的大鼠,给药前采血作为空白样品,在灌胃给药后绘制的一 个完整的血药浓度.时间曲线,包括药物的吸收相、平衡相和消除相。整个采样 时间至少应持续到个半衰期,或持续到血药浓度为的/~/。 采用./仪测定血药浓度。然后采用中国药理学会推荐软件进行数 据处理。将试验中测得的各受试动物的血药浓度.时间数据分别进行药物动 力学 参数的估算,计算标识成分的药物动力学参数,包括有:、实测值、 实测值、梯形法求算、、、/和等。大鼠给药后, 以药时曲线作参考,选个时间点分别代表分布相、平衡相和消除相的药物分布。 测定药物在心、肝、脾、肺、肾等组织的浓度。结果发现木脂素的药时曲线亦呈 开放型二室模型,具有二次吸收。五味子木脂素成分在大鼠各脏器分布中最多的 是肝,其次是肺和肾。结果表明五味子中的木质素成分在经过针灸后具有一定的 肝靶向性。 将针药结合的大鼠处死取出肝脏,超速离心法制备肝微粒体,法进 行微粒体蛋白含量测定绘制标准曲线。采用还原差示光谱法测定酶的 含量。结果显示,大鼠肝微粒体水平均显著提高,其对丙咪嗪的体外代 谢速率显著加快。结果表明五味子对大鼠有诱导作用,且与剂量或诱导 时间有关,并且针灸增加了这种效应。 取清洁级大鼠禁食后进行实验,给大鼠腹腔注射乌拉坦麻醉,右颈 动脉插管,并沿腹白线于剑突下划开腹部肌层约做胆管插管,最后切开左 腿皮肤暴露股静脉待其呼吸平稳后给药取血,收集胆汁。胆汁样品于给药前和给 药后不同时间点收集,比较单给药组和针药结合组的胆汁收集量。结果显示 经过 针药结合的大鼠胆汁最多,其次是单给药组。以上结果显示,针药结合比单给药 组更能增强胆汁排泄。 综上所述,本研究论文以五味子为研究对象,对经过针灸“足三里”穴位后 其主要有效成分木脂素成分进行肝损伤、组织分布及代谢排泄等方面的研究。建 立了血浆和主要组织中三种木脂素成分的.分析方法,结果表明, 五味子经过针灸“足三里’’穴位联用后,能有效保护四氯化碳所致的肝损伤,促 进有效成分在主要组织的分布,增强酶的诱导效应,促进大鼠的胆汁排泄。 本实验结阐明针药结合五味子相应物质基础与肝趋向性的关系,为针灸促进药物 趋向性研究建立科学的研究体系。 关键词:五味子木脂素,针药结合,组织分布,酶,胆汁排泄 南京中医药大学硕士学位论文,. ,, ’ ”‖ ,”, . ,., . ., ... ,, . ., ,,.: , , , ,?, , ; 一 , ; , ; ,. . , . 、 . ;,, ,. , . . :, , , , . , ? . .: . . , , , ,. , . ,. ,? ,, , ./ ~/.?/. .. :,’ , ./... ,,. , .,。 南京中医药大学硕士学位论文? . ,... ., . .,. . . , . . , , . , ,.,? . . ; :; ; 刖 吾 针药结合是中医延续数千年传统的医疗模式,对于提高疗效、减轻药物毒副 作用发挥重要作用。针灸、药物作为治疗疾病的两种措施,均是调节机体平衡的 方法,但在治疗性质、作用途径等方面各有特点。针灸是以针刺、艾灸及其他物 理方法作用于体表特定部位用以防治疾病的一种方法,是依赖于机体自身调节机 能发挥作用的。药物是一种以药物自身的化学性质作用于特定靶点发挥对机体调 节作用的物质。药物针对病变靶点的调节作用,并不仅仅在病变部位起作用,而 是整体发挥效应。研究表明:针灸能增强体质,提高机体的抗病机能,使机体以 最佳的状态,积极的配合药物清除和消灭机体内的病原物质,达到针药协同增效 的治疗目的;能通过改善药物的代谢过程,增加药物有效成分的作用时间,从而 提高疗效;针灸特异性地调整靶器官的功能,增加器官对药物的亲和力,增加了 药物在机体的靶向效应。 药物归经是建立在脏腑经络学说及药物本身性能等理论基础之上的,强调药 物作用的选择性定向、定位,对于完整地阐释药物的作用原理及指导临床用药具 有重要意义。金元时期张元素在对脏腑辨证和遣药制方研究的基础上,提出了分 经分部用药,如“脏腑虚实标本用药式、“引经报使等,认为取各药性之长, 各归其经,则力专效著。现代药理学也认为当药物被吸收后与机体的器官直接接 触时,并不对所有组织或器官都发生同等强度的作用,大多数药在适当剂量时, 只对某些组织或器官发生明显作用,而对其它组织或器官作用微小或无影响。药 物归经突出了药物靶向性或趋病灶性、与药物在远病灶区的调节作用,以及两 者之间的相关性。近年来有学者就针灸促进药物趋靶性进行了初步的实验研究。 经穴给药和药物归经都是经络腧穴理论和药物本草学理论的组合,临床形式是针 药结合应用。 五味子,味酸、甘,性温。具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效。临 床常用于治疗无黄疸型肝炎及慢性迁延性肝炎等肝部病症,同时用于保肝护肝, 其效用为临床所验证。 以往课题立项研究主要集中以针灸或归肝经药物单一进行。但对针药结合,尤 其针药结合对药物趋向性归经研究目前仍是欠缺。选择针灸促进五味子肝趋向性 效应机制的研究,进行肝靶向性分布、代谢酶活性、胆汁排泄等研究。阐 明针药结合前后五昧子相应物质基础变化与肝趋向效应间的相关性,从细胞和分 子水平进行生物药剂学与药物动力学等研究,多靶点、多层次、多环节分析研 究,创新针药结合研究方法。阐明针灸促进五味子肝趋向性的三个核心元素是多 靶点作用形成归经趋向、针灸后的药物体内变化物质为作用基础、机体产生的综 合效应。 南京中医药大学硕士学位论文 第一章文献研究 五味子为木兰科多年生落叶木质藤本植物,《中华人民共和国 药典》收录有两种五味子药材,分别为北五昧子 ..】 ..的成熟果实。五味子的化学成分研 南五味子 究比较深入,已报道的有木脂素、三萜、倍半萜、有机酸、挥发油和多糖等成分。 【】五味子味酸、甘,性温。具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效。临床 常用于治疗无黄疸型肝炎及慢性迁延性肝炎等肝部病症,同时用于保肝护肝,其 效用为临床所验证【培】。研究显示:五味子醇提物及五味子乙素、醇甲等成分对 化学毒物引起的动物肝细胞损伤有明显保护作用,可抑制转氨酶的释放,使 活性降低;能明显诱导小鼠和大鼠肝微粒体细胞色素.活性,增加肝脏解毒 能力;五味子对。经肝微粒体代谢转化后生成的一氧化碳及其在代谢过程中 对的消耗亦能有抑制作用;五味子有助于肝细胞蛋白质的合成,从而使 线粒体恢复和增加,相应的酶活性增高,肝细胞得以恢复和再生,发挥降酶保肝 作用。 针药结合,能产生新的更有利于各自作用发挥的因素。针灸能调动机体内各 种因素参加机体平衡的恢复过程,为药物的作用提供较好的基础状态增加靶向 性、提高药物与靶器官的亲和力,有利于协同发挥机体平衡的恢复作用。论文 研究对五味子木脂素和针药结合的相关文献进行整理分析,对木脂素和针药结合 做一综述。 .针药结合概述 ..针灸治疗 针灸【是指以针刺、艾灸及其他物理方法作用于体表特定部位腧穴用以防 治疾病的一种方法,作为物理性刺激是依赖于机体自身调节机能发挥作用的,对于 这一作用的特点,承淡先生有过精辟的论述,他认为,针术“但在体力未至十分衰弱 时有效。针术对于各种急性病症之有效,大都如是。及体力已衰,针术即不发生效 用”,这一观点有两个方面的含义:一是针灸是依赖于机体自身的调节机制发挥作 用的,只有在机体尚有调节能力或潜力的前提下,针灸才能发挥其治疗作用;二是 针灸的作用是有限的,只能在机体可能的范围内进行调节。有研究发现针刺“内 关”和“太冲”两穴能明显增加心脏和肝脏中川芎嗪的含量。电针“足三里”等 穴位能有效的保护由四氯化碳、内毒素、酒精中毒、缺血等所致的大鼠肝损伤, 有较明显的保肝护肝作用。.药物治疗 药物【们,主要是化学物质,是一种以药物自身的化学性质作用于特定靶点发挥 对机体调节作用的物质。药物治疗基于还原论,现代医学认为任何疾病的发生均 可找到解剖学上的病变,/、到分子、细胞,大到组织、器官,药物治疗就是改善这些 病变。根据年《科学》杂志的一篇综述报道,过去几千年来人类利用化学物 对疾病进行治疗所涉及的靶点只有个,其中接近一半是受体,四分之一是酶类, 还有其他各种离子通道和核受体等等?。这些靶点在正常状态下具有分布广、作 用途径多、效应差异大的特点,药物针对病变靶点的调节作用,并不仅仅在病变部 位起作用,而是整体发挥效应,这是药物治疗在作用针对性强的同时而又难以避 免个体差异大和毒副作用多的根本所在。 .针灸与药物治疗性质和作用途径的差异是针药结合的基础 针灸、药物作为治疗疾病的两种措施,均是调节机体平衡的方法,但在治疗性 质、作用途径等方面各有特点。针灸与药物的作用目标都是恢复机体的生理平衡, 这两者的相互结合就可产生更好的调节作用,有研究者在综述了近年的文献 的基础:针灸配合适当的药物治疗,可弥补单纯针灸调节的不足。?针药结合可 以减少药物的毒副作用,它的机理可能包括两个方面,一是针灸可以改善因副作用 引起的症状体征;二是针灸的效应可以减少药物的用量,从而达到减轻药物副作用 的目的【。。 针药结合所以能发挥针灸、药物单独治疗所无法达到的作用,是因为两者结 合后产生了新的更有利于各自作用发挥的因素。针灸作用的本质在于它可能调动 机体内各种因素参加机体平衡的恢复过程,也就是说针灸调动“内因参与机体 平衡恢复,这一“内因”的作用可以为药物的作用提供较好的基础状态增加靶向 性、提高药物与靶器官的亲和力;药物尽管是作用于体内靶点的,但对于机体来说, 仍是一种“外因”,这一外因可以强化机体衰减或抑制亢进的某种能力,但一般一 类药物产生一个方面的作用,对机体的平衡恢复来说,可能产生过与不及的现象, 而针灸可以抑制这种现象针灸抑制毒副作用,同时“外因的加入也可能强化针 灸调动“内因”的能力。所以,从调动治疗作用的因素上说,针药结合有利于“内 因”与“外因”协同发挥机体平衡的恢复作用。 .针灸结合的机理研究 也有研究者对针药结合的机理提出了自己的观点:首先,针灸能增强体质, 提高机体的抗病机能,使机体以最佳的状态,积极的配合药物清除和消灭机体内的 病原物质,达到针药协同增效的治疗目的;其次,针灸可能通过改善药物的代谢过 程,增加药物有效成分的作用时间,从而提高疗效;第三,针灸特异性地调整靶器官 的功能,增加器官对药物的亲和力,增加了药物在机体的靶向效应。因此,可以推断,南京中医药大学硕士学位论文 针药结合之所以能够增加疗效,?可能是通过神经内分泌等对体内脏器产生良性 调整,特异性的增加靶器官的兴奋性,改善其微血管循环,使单位时间内灌流靶器 官的药量增加。?可能是从分子基因水平影响相应器官细胞表面的受体,使其与 药物相适应的受体表达增多,从而增加病变器官细胞与药物之间的亲和力,这一过 程很可能是影响针灸与中药协同增效的主要因素【巧。 .经络腧穴理论 药物归经是建立在脏腑经络学说及药物本身性能等理论基础之上的,强调药 物作用的选择性定向、定位,对于完整地阐释药物的作用原理及指导临床用药具 有重要意义【嘶。金元时期张元素在对脏腑辨证和遣药制方研究的基础上,提出 了分经分部用药,如“脏腑虚实标本用药式”、“引经报使”等,认为取各药性之 长,各归其经,则力专效著。现代药理学【。也认为当药物被吸收后与机体的器 官直接接触时,并不对所有组织或器官都发生同等强度的作用,大多数药在适当 剂量时,只对某些组织或器官发生明显作用,而对其它组织或器官作用微小或无 影响。药物归经突出了药物靶向性或趋病灶性、与药物在远病灶区的调节作用, 以及两者之间的相关性。近年来有学者就针灸促进药物趋靶性进行了初步的实验 研究‘?。经穴给药和药物归经都是经络腧穴理论和药物本草学理论的组合,临 床形式是针药结合应用。 .小结 通过针药结合,能产生新的更有利于各自作用发挥的因素。针灸调动机体内 各种因素参加机体平衡的恢复过程,为药物的作用提供较好的基础状态增加靶 向性、提高药物与靶器官的亲和力,有利于协同发挥机体平衡的恢复作用。通 过实验研究,为传统中医药理论研究提供新的思路,以便更好发扬中医特色、提 高中医疗效。 五味子的化学成分研究 五味子的化学成分研究比较深入,已报道的有木脂素、三萜、倍半萜、有机酸、 挥发油和多糖等成分 .木脂素类成分 五味子中的木脂素类化合物是以:,一联苯,环辛二烯为母核,该类母核 为五味子所特有,是五味子中最主要的药理活性成分。五味子中总木脂素含量约 为%.%。周英等峙艮道,到年为止从五味子属植物中共分离鉴定了个 成分,其中包括个木脂素。宋万志等采用硅胶薄层技术,鉴定了北五味子、 南五味子均含有五味子甲素五味子素、五味子乙素 、五味子醇甲 、五味子醇乙 、五味子 等 种木脂素。除上述成分外,北五味子中还含有五味子酚 酯甲、戈米辛。等‘从南五味子中还分出一种四氢呋 】,戈米辛 喃木脂素。 .挥发油类成分 北五味子果实中挥发油含量约为%.%,其主要含有单萜类、含氧单萜类、 倍半萜类、含氧倍半萜类和少量醇、酸等含氧化合物,其中以倍半萜类为主。王 炎等【】对五味子种子挥发油与其果实挥发油的化学成分进行了比较,发现五味子 种子挥发油主要由各种萜类化合物组成,包括莰烯、蒎烯、月桂烯、松油烯等单 萜类物质和金合欢烯,榄香烯、异石竹烯、古巴烯、等倍半萜类物质,与以前报道 的果实挥发油成分有所不同。李晓宁等【采用.法从辽五味子挥发油中分 离鉴定了个化合物,其中倍半萜类约占挥发油总量的%。 .多糖 五味子多糖含量约%左右,大多只是采用水提醇沉,对粗多糖进行简 单分级。如吕子涛等【】在多糖溶液中加入无水乙醇,使母液中乙醉浓度依次达到 %、%、%、%从而得到五味子多糖的一、二、三、四级级分。将最后 的所剩母液水浴加热蒸干,得到的固体为五味子多糖的第五级级分。并以葡萄搪 为标准品,用硫.酚法测定了各级分的含量。同时发现粘稠性多糖,在室温下 最佳沉 淀区的乙醇含量是%%之间,这部分多搪含量占总多塘的.%。 .其他成分 五味子果实含有柠檬酸、苹果酸、琥珀酸酒石酸、乌索酸?】、安五酸、 、【等多种有机酸,具有明显的祛痰作用。此外, 五味子果实还发现了甾醇、维生素、,树脂,鞣质及铁、锰、硅、磷等矿物 质。北五味子干果全氮含量为.%,总氨基酸含量为.%。在分析的种 氨基酸中,人体必需氨基酸有种,总含量为.%。 .五味子药代动力学的研究 .五味子木脂素的药动学研究 五味子,味酸、甘,性温。具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效。 临床常用于治疗无黄疸型肝炎及慢性迁延性肝炎等肝部病症,同时用于保肝护 肝,其效用为临床所验证【。研究显示:五味子醇提物及五味子乙素、醇甲等 成分对化学毒物引起的动物肝细胞损伤有明显保护作用,可抑制转氨酶的释放, 使活性降低;能明显诱导小鼠和大鼠肝微粒体细胞色素一活性,增加 肝脏解毒能力【;五味子对经肝微粒体代谢转化后生成的一氧化碳及其在 代谢过程中对的消耗亦能有抑制作用;五味子有助于肝细胞蛋白质 的合成,从而使线粒体恢复和增加,相应的酶活性增高,肝细胞得以恢复和再生, 。 发挥降酶保肝作用南京中医药大学硕士学位论文 近年来,随着细胞、分子水平的生物药剂学与药物动力学等的研究发展迅速, 生命活动的许多微观生理生化机制被不断揭示,介导药物作用的许多酶、细胞摄 取、转运、分布、代谢、排泄过程中的生物活性分子被分离、纯化、阐明,并作 为研究和筛选药物活性成分的靶标,为针药结合的实验研究提供了有力的技术支 撑。 五味子乙素是从五味子中分离出来的具有保肝作用的活性成分之一,具有明 显的清除自由基和抑制脂质过氧化作用【。王飞等【选择血清中的和作为肝功 能受损的指标,它们在肝脏中的含量很高,少量组织坏死或者细胞膜通透性增高时 即可释放。 干预组可以恢复肝.、活性,减少生成,从而有 效减轻镉的急性肝损伤,使血清和【活性显著降低。可激活肝谷胱甘肽 .转移酶和谷胱甘肽还原酶及葡萄糖..磷酸脱氢酶的活性, 明显升高细胞内的含量,增强肝抗氧化系统的能力,进而发挥其抗氧化的作 用引。综上所述,和对急性染镉所致的肝脏氧化损伤有一定的拮抗作用。 另外,五味子乙素具有降低胶原基因表达合成作用。对于培养活化的 ,五味子乙素对摄取.没有明显影响,但在/时,剂量依赖 地抑制摄取.,并在/降低型前胶原基因表达【制。 赵稳兴等【】建立一种与引起人体酒精性肝损伤发生机制类似的小鼠动物模 型,并研究五味子酒精提取物对其影响及作用。结果显示混合酒精液体饲料联合 细菌酯多糖成功制作了小鼠酒精性肝损伤模型,显著升高;五味子酒精 提取物能显著地抑制血清的升高;肝组织病理切片显示局部肝细胞变性,注射 后细胞核增大、核浓染,其余未见明显改变。表明五味子酒精提取物具有降 低酒精性肝损伤作用。 ‘。五味子提 此外,五味子对中毒大鼠肝细胞核基质蛋白和结构的保护作用 取物治疗后大鼠肝细胞病理改变明显减轻。五味子提取物促进了中毒大鼠肝细胞 蛋白的表达、并有调节大鼠肝细胞核基质蛋白代谢的作用。提示五味子 可能通过促进中毒大鼠肝细胞 蛋白的表达和影响核基质蛋白的代 谢而促进损伤肝细胞修复,对于中毒大鼠肝细胞核基质蛋白和结构具有保护 作用。 .五味子木脂素在组织分布的研究 药物口服进入体内后,在胃肠道吸收进入血液循环,进而发挥全身作用。肝 脏血流较丰富,血流量大,药物分布较快,浓度较高。如果药物与肝细胞成分有 特殊的亲和力,使肝组织中的药物浓度高于血浆游离药物浓度,则药物的分布对 。。 肝脏具有一定的选择性 一五味子酯甲小鼠灌胃吸收差,生物利用度低。静脉给药在血中分布迅速,主要分布在肝、胆、脾。主要在肝脏代谢,形成大量脂溶性代谢产物,排泄缓慢。 药时曲线呈开放型二室模型【?。 五味子醇甲【】胃肠吸收快而完全,五味子醇甲在小肠上部吸收较好,吸收速 率按十二指肠、空肠、结肠、回肠、依次下降,吸收速率常数依次为.、.、 .、.;肠道吸收呈一级吸收动力学特征,吸收机制为被动吸收;主要吸收 部位为十二指肠和空肠。组织分布广,肺浓度高,其次为肝、心、脑、肾、脾, 脑内分布以下丘脑、纹状体、海马浓度最高。代谢与排泄均较快,静脉给药药时 曲线亦呈开放型二室模型。 .五昧子木脂素对肝脏内代谢酶的研究 细胞色素酶是肝脏中一种重要的酶,人体中有多种同工酶, 酶在肝和肾上腺的微粒体中含量最多,参与类固醇激素、胆汁酸及胆色素等的生 成,以及药物、毒物的生物转化过程【 。由于肝脏是药物代谢的主要场所,其进 混合功能氧 行生物转化依赖于微粒体中的多种酶系,其中最重要的是 化酶系统。欧美国家将及其同功酶测定用于新药的筛选及代谢研究,并 把它列为新药申报必须进行的一项试验。通过比较各醋制药物对活性的调 节作用,以分析研究药物醋制前后对肝代谢效应的影响。 张锦楠等【】考察了甘草和五味子对大鼠肝微粒体的诱导作用及其 对丙味嗪体外代谢的影响。大鼠分别给予甘草或五味子的水提物连续或, 然后制备肝微粒体并测定其的水平;以丙眯嗪为底物,采用体外温孵法,用 测定丙咪嗪及其主要代谢物的量以考察其代谢情况。结果显示,给予中草 药的大鼠肝微粒体水平均显著提高,其对丙咪嗪的体外代谢速率显著加 快。说明甘草和五味子对大鼠有诱导作用,且与剂量或诱导时间有关。 .五昧子木脂素对胆汁排泄的研究 中医学认为胆附于肝,两者互为表里。肝的功能为分泌胆汁,藏血;胆囊则 负责胆汁的贮存和排泄。胆汁由肝之精气所化生,汇集于胆,泄于小肠,以助饮 食之消化。胆汁的化生、排泄由肝的疏泄功能来调节。肝脏是人体重要的排泄器 官,无论是体内代谢物如胆红素和胆汁酸,或是外源性药物,均首先由肝细胞摄 取,然后在肝细胞内转化或结合,在肝细胞和胆管上皮细胞共同作用下,最后经 肝细胞微细胆管转运系统排泄至胆管,形成胆流,从而分泌出胆汁。因而胆汁排 泄与肝的功能效应密不可分【。引。 . 在五味子醇甲药动学研究中的应用 刘红掣用法测定五味子醇甲浓度的经时变化,以药代动力学软 件进行分析,计算药动学参数。结果五味子醇甲在大鼠体内药动学参数分别 是:/为.,/为.,为.,为。。./,为南京中医药大学硕士学位论文 .?。?。结论生脉散中五味子醇甲可吸收进入体内,其在体内吸收和消 除速度均比较快,符合线性动力学规律。 . .在五味子乙素药动学研究中的应用 陈玮莹等应用.方法测定大鼠血浆中五味子乙素的浓度,分析大鼠 血浆中五味子乙素的浓度.时间数据,建立.联用测定血浆五味子乙素的 方法,观察五味子乙素在大鼠体内的药代动力学作用。应用药代动 力学分析软件计算大鼠体内五味子乙素的药代动力学参数。本法简单快速,可应 用于不同样品中五味子乙素含量的测定。五味子乙素的保留时间为.,血 浆平均最大浓度为.嵋/,灌胃后达峰时间为.,浓度时间曲线下的平 均面积为./?,平均清除率为./。本方法可应用于不同样本中五 味子乙素的检测和实验动物体内五味子乙素的药代动力学分析。第二章针药结合对急性肝损伤小鼠的保护作用的研究 五味子,味酸、甘,性温。具有收敛固涩、益气生津、补肾宁心的功效。临 床常用于治疗无黄疸型肝炎及慢性迁延性肝炎等肝部病症,同时用于保肝护肝, 其效用为临床所验证。研究显示:五味子醇提物及五味子乙素、醇甲等成分对化 学毒物引起的动物肝细胞损伤有明显保护作用,可抑制转氨酶的释放,使 和活性降低;能明显诱导小鼠和大鼠肝微粒体细胞色素.活性,增加 肝脏解毒能力;五味子对经肝微粒体代谢转化后生成的一氧化碳及其在代 谢过程中对的消耗亦能有抑制作用;五味子有助于肝细胞蛋白质的合 成,从而使线粒体恢复和增加,相应的酶活性增高,肝细胞得以恢复和再生,发 挥降酶保肝作用。 针刺足三里穴位能双向调节神经.内分泌.免疫系统,保护脏器。针药结合后 能产生新的更有利于各自作用发挥的因素,能更好起到保护肝脏的作用,目前针 药结合的方式主要有两种:.针药同时进行;.先针后给药。目前这两种形式并没 有明确的定论。 现以针刺足三里穴位和五味子联用,以小鼠为研究对象,造成急性肝损伤模 型,测得及值,比较针药同时进行组和先针后给药组,单给药物组的 及值是否存在统计学差异,以考察针药结合的方法对小鼠急性肝损伤 的影响,为后续试提供科学理论依据。选出最优的针药结合方法。 .材料、试剂和仪器 .实验动物动物 健康小鼠只,体重:,雌雄各半。由上海斯莱特实验动物有 限责任公司提供,实验前于动物房饲养三天以适应本实验室环境,实验室温度维 持~?,相对湿度控制在%左右。 .主要试剂 五味子饮片安徽铜陵饮片厂 四氯化碳。为分析纯,临用时配置成.%的橄榄油溶液; 天门冬氨酸氨基转移酶测定试剂盒世诺临床诊断制品上海贸易有限公 司,批号:; 丙氨酸氨基转移酶测定试剂盒世诺临床诊断制品上海贸易有限公司, 批号:; 联苯双酯新昌制药厂,产品批号:; 仪器和器材 日立全自动生化仪分析仪日本;高倍显微镜泰州市可达南京中医药大学硕士 学位论文 锌业有限公司;恒温水浴箱巩义市英峪予华仪器厂;电子分析天平天津市 天马仪器厂;离心机上海安亭科学仪器厂。 .数据统计 计量资料用牙?表示,比较给药组和对照组间的差别用检验其显著性,计 数资料用检验对照组与给药组之间的差别。.表示该剂量药物与对照组 比较有显著意义;.则表示该剂量药物与对照组比较有非常显著意义 实验方法 .样品溶液的制备 取五味子饮片适量,打粉机粉碎,加入倍量%乙醇。提取次,每次., 合并滤液,水浴挥发至无醇味,得浸膏。添加.%羧甲基纤维素钠混合,超声 溶解,制得每含.生药的混悬液。 .小鼠针刺方法和穴位选择 用自制鼠夹固定小鼠,根据动物穴位定位图谱,选取小鼠后肢双侧“足三里” 穴于膝关节后外侧、腓骨小头下约处直刺,针刺后连接. 针灸治疗仪持续电针刺激,电针治疗仪参数设定为疏密波,强度以小鼠安 静耐受为度,约,保持小鼠清醒状态,以双下肢轻微抖动为宜。见图?、 图.小鼠足三里穴位图. .动物实验方法 取小鼠只,雌雄各半,体重土:,随机分成组,每组只:组别分 别为?空白对照组;?模型对照组;?五味子单给药组;?先针刺后给药组; ? 针刺给药同时进行组;?联苯双酯阳性对照组。空白对照组及模型对照组给 予等 量的羧甲基纤维素钠。五味子单给药组灌胃给药./,每日一次,连续 天。先针刺后给药组均在每天同一时间针刺治疗,持续天。然后灌胃给药五 味 子,剂量同单给药组,每日次,持续天。针刺给药同时进行组均在每天同一 时间针刺治疗后立即灌胃给药五味子,剂量同单给药组。每日次,持续天。 联苯双酯阳性对照组灌胃给药联苯双酯溶液.~,每日次,持续天。 所有各组在末次给药后后,除空白对照组给予橄榄油外,其余组均腹腔注射 .%榄油溶液.造成急性肝损伤。后摘除一侧眼球取血,分 ,及丙氨酸 离血清,测天门冬氨酸氨基转移酶 氨基转移酶 ,活力,断头处死小鼠。 .肝损伤实验数据结果 各干预组对急性肝损伤小鼠和的影响见表.,图.。由表 可知,模型组的和值明显高于空白组。针药同时进行组、先针后给药 组、单给药组都能显著降低四氯化碳致急性肝损伤血清和水平。 表.针药同时进行组、先针后给药组、单给药组对致急性肝损伤小 鼠和的影响?, . .,? . . 牙?. 注:与模型组比较术.,与先针后药组比较.,与单给药组比较. 南京中医药大学硕士学位论文 图.针药同时进行组、先针后给药组、单给药组对致急性肝损伤小 鼠和的影响, .? .. ?’????。’‘“? 、 。 二 ~ . . . . . 。. ?平均值/ . . ???平均值/ 。 ? .模型组的值为.:.。表明可通过注射的方法来建立小鼠急性 肝损伤的模型。三种干预方式针药同时进行组、先针后药组合和单给药组都 能改 善小鼠急性肝损伤表.,针灸和给药同时进行为最佳的干预方式。模型组的 值为..,针药同时进行组、先针后给药组、单给五昧子组的 值为..、. .、..。模型组的值为,: .,针药同时进行组、先针后给药组、单给五味子组的值为..、 ..、.土.。 .讨论 ..模型 本实验采用造成小鼠急性肝损伤模型。并观察了单给五昧子,针灸与五 味子联用对致小鼠急性肝损伤的保护作用。是一种强烈的可诱发肝 细胞坏死的化合物,常被用来诱发各种肝损伤模型来解释某些药物的肝毒性 或是 肝保护机制。 进入体内后,被肝细胞色素激活,生成三氯甲基自由基,与细胞膜 及细胞内的大分子发生共价结合,破坏酶的功能从而导致膜的脂质过氧化,胞浆 内浓度升高,继而引起膜结构和功能完整性破坏。并且还能导致肝细 胞坏死,升高血清中的转氨酶。 ..效应讨论 本实验将及值作为小鼠急性肝损伤的保护程度评价指标。经天干 预后发现:经统计分析先针后药组,针药同时进行组,单给药组与模型组相比有 统计学意义.,针药同时进行组与先针后药组和单给药组相比,有统计 学意义.,说明经过天干预治疗后,针药同时进行组、先针后药组、 单给药组的急性肝损伤情况有所改善,且针药同时进行组程度最好。提示:针药 同时进行的干预治疗对小鼠急性肝损伤的治疗效果最好,其次为先针后药组,再 次为单给药组。 ..足三里穴位分析 肝脏是清除细菌和毒素的场所同时也是最易受损的器官之一,许多毒性物质 都能激活肝脏单核.吞噬细胞释放促炎因子引起肝组织的急性肝损伤。足三里穴, 又称胃的下合穴,在膝下三寸,胫骨前棘旁开一横指,属于足阳明胃经,为足阳 明脉气所入,为合穴。临床治疗作用广泛,现代研究和传统中医认为,足三里穴 不但是抗炎及免疫调节的要穴而且还是足阳明胃经的合穴,五行属土,故为土中 土穴,所谓土生万物,胃与脾相表里,故可用来调节脾胃,治疗胃肠疾病。针刺 足三里能双向调节神经.内分泌.免疫系统,保护脏器功能还有通腑攻下以存阴的 作用,攻下可以排毒解毒,荡涤积滞,使大量细菌和毒素能排出体外,减少其吸南京中医药大学硕士学位论文 收。本实验中观察到,电针的小鼠多有泄泻情况,味腥臭。表明电针足三里可能 促进小鼠胃肠蠕动和排毒作用。这与针刺足三里的中医理论相符合。第三章针药结合对五昧子木脂素在大鼠药代动力学的研究 随着科学技术的不断进步。越来越多的科学分析技术如.进入到科 研人员的视野之中。为进一步研究中药药效成分的变化规律提供了新的手段,对 阐明中药的物质基础和传统中医理论的关联具有重要的意义。目前关于五味子的 药代动力学的参考文献较少,大多是五味子有效部位和提取物中的有效成分木脂 素。结合第二章的内容。本章实验采用五味子木脂素中五味子甲素、五味子乙素 和五味子醇甲作为标志性成分。观察五味子木脂素经针灸足三里联用后在血浆中 的浓度的情况。运用.药物代谢动力学专业软件对测定结果进行处理,得 出上三种木脂素成分在大鼠的药物代谢动力学参数和血药浓度时间曲线。并建立 血浆样品中同时检测三种木脂素成分的.分析方法。通过上述实验过程 研究三种木脂素成分在大鼠体内的动态变化规律,确定给药方式,针灸方法和给 药剂量。为针灸足三里促进木脂素在大鼠体内吸收提供理论依据。又为后续的三 种木脂素成分在体内分布的研究提供方法参考和实验依据。 .材料、试剂与仪器 .实验动物 健康成年的清洁级大鼠,雌雄各半,体重在 。由上海斯莱特实 验动物有限责任公司提供,合格证号:沪.,实验前于动物房饲 养三天以适应本实验室环境,实验室温度维持~。,相对湿度控制在% 左右。实验开始前禁食,自由饮水。 .主要试剂 乙腈、甲酸和甲醇:色谱纯,江苏汉邦生物制药公司提供 乙酸乙酯:分析纯,江苏汉邦生物制药公司提供; 丙二醇:江苏汉邦生物制药公司提供; 氯化钠:江苏汉邦生物制药公司提供; 肝素钠注射液:江苏万邦生化医药股份有限公司 . 五味子醇甲批号: 五味子甲素批号:. 五昧子乙素批号: .对照品均购自中国药品生物制品检定所 内标物睾丸酮购白德国.公司生产编号..% 五味子饮片安徽丰原铜陵中药饮片有限公司供原药自制;批号: 经南京中医药大学药用植物教研室巢建国教授鉴定均为木兰科植物五味子 ,的干燥成熟果实。南京中医药大学硕士学位论文 .仪器和器材 美国公司?型单重四级杆液质联用色谱仪,配 双元泵,真空脱气机,柱温箱,自动进样器, 柱. 检测器和电喷雾离子源,色谱柱:依利特 ,大连依利特分析仪器有限公司;电子天平:, 德国;电子天平:,德国;冷冻离心机:德国; 冷冻离心机:德国;真空浓缩装置:,美国; . 超纯水机:,美国。.型超声波清洗器昆山 . 市超声仪器有限公司;? 超纯水器 .统计和图表.版统计学分析软件进行统计学分析; .药理学软件对药 代动力学参数进行分析并使用制作图表。 实验方法 .标准溶液的制备 ..对照品溶液的制备 精密称取对照品五味子酯甲、五味子甲素、五味子乙素适量,用甲醇溶解 配制成单一照品储备液。另精密吸取各储备液适量,配制成每含五味子醇甲 .甥、五味子甲素.肛、五味子乙素.的混合对。稻、。日储备液。再分别 精密吸取储备液适量,用甲醇稀释成五味子醇甲质量浓度为.、.、.、 .、.、.??~,五味子甲素质量浓度为.、.、.、.、 .、.?~,五味子乙素质量浓度为.、.、.、.、.、 ..?。的混合对照品系列溶液。 ..内标溶液的制备 精密称取睾丸酮,用乙腈溶解配制成每含睾丸酮.的内标物储备 液;再吸取储备液适量,再稀释成每含.的内标溶液。 .大鼠针灸方法 经预实验结果,最终采用自制鼠夹固定大鼠,将块黑布包裹住大鼠的头部使 其安静分钟。空白组和单给药组的大鼠在每天同一时间进行此操作。针药结 合 组的大鼠根据动物穴位定位图谱,选取大鼠后肢双侧“足三里穴于膝关节后 外侧、腓骨小头下约处直刺,进针后平补平泻分钟后,接电针正 极,电针负极给予生理盐水纱布作为假电极,连接一针灸治疗仪持续电针 刺激,电针治疗仪参数设定为疏密波,强度以大鼠安静耐受为度,不超过 ,保持大鼠清醒状态,以双下肢轻微抖动为宜。持续电针。大鼠针刺足 三里见图.图.大鼠针刺足三里穴位图.南京中医药大学硕士学位论文 .血浆中三种木脂素成分标准曲线的绘制 ..血浆样品处理方法 经预试验比较,将甲醇为处理血浆的沉淀剂,处理方法为:吸取血浆 , 精密加入甲醇,涡旋混合,精密加入内标液,涡旋混合,再精 /离心 吸取上清液 密加入甲醇沉淀蛋白,涡旋, 进样测定。将样品和内标峰的面积对比进行定量分析。 ..色谱条件和质谱检测参数 色谱柱为依利特 柱. ,;流动相:乙腈.‰甲 酸,.水.‰甲酸,,梯度洗脱,为%;~,为 /~%;~,为%;流速:.?~;柱温:?;进样量,检测波长:。 .的质谱离子化方式:电喷雾离子化;离子极性:正离子;检测 模式:选择性反应离子监钡;定量分析离子质荷比/:五味子醇甲 /.,五味子甲素/.,五味子乙素/.和睾丸酮内标 /. 碎裂电压:五味子醇甲,乙素和睾丸酮为,五味子加速为;干燥气 流速:/;干燥器温度:。;毛细管电压:;雾化器压力: ..方法的专属性 取大鼠的空白血浆、空白血浆加入适量混标溶液以及大鼠灌胃给予五味子提 取液后的血浆样品 ,按相应“..生物样品的处理”方法进行处理并按 照上述色谱条件进行.分析。所得的质谱图见图.。 二 二 二二 陌 ~矿 ,一 芸 五 ~一 一 一 ? 图.大鼠血浆中专属性实验的相关质谱图 .空白血浆,.空白血浆混标溶液内标物,.大鼠灌胃后 的血浆样品内 标物 .睾丸酮;.五味子醇甲;.五味子甲素;.五昧子乙素 . .,,. ...,.,.,. 结果表明:五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素和内标物睾丸酮的保留时 、. 、. 和. 间分别为. ;血浆样品中各待测峰的分离度 良好,内源性物质不干扰五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素和内标物睾 丸酮 的含量测定。 ..线性关系考察 取大鼠空白血浆 ,分别精密加入不同浓度的混合对照品系列溶液 、.、.、 ,配制成五味子醇甲浓度为. ..项下配制 ,涡旋 、.、.、 .、.、.嵋?一,五味子甲素浓度为.、.、. .“?~,五味子乙素浓度为.、.、.、.、.、.嵋’一 的系列对照品混合血浆,按相应“.生物样品的处理”方法进行处理并按照上 述色谱条件进行.分析,每个浓度平行处理份。以各对照品峰面积与 内标峰面积的比值对相应的对照品浓度进行线性回归,得相应的回归方程。 并对 混合血浆逐步进行稀释处理后分析,得出各对照品的最低定量浓度。 结果见表.和图.、.、.。 表.大鼠血浆中被测木脂素成分的线性关系、线性范围和最低定量限.? .南京中医药大学硕士学位论文 . . 蝈墓 丑立. 口 。 厶. . . . . . . 浓度‖ 鲈 图大鼠血浆中五味子醇甲标准曲线 . 迥翌 暑盘时时时 ,. . . . . . 浓度‖ ‖止 图大鼠血浆中五味子甲素标准曲线. .蜃时 遥丑 意. . . . . . 浓度/ / 图.大鼠血浆中五味子乙素标准曲线 . 结果表明:血浆样品中五味子醇甲、五味子甲素和五味子乙素在各自测定的 线性范围内线性关系良好,.,符合生物样品含量测定指导原则.。 ..稳定性试验 取大鼠空白血浆 .,分别精密加入不同浓度的混合对照品系列溶液 ,配制成五味子醇甲浓度为.、.、. ..项下配制 ,涡旋 ?~,五味子乙素浓度为.、 ??~,五昧子甲素浓度为.、.、. .、.“?‘的低、中、高质控样品,按相应“.生物样品的处理”方 、 、 后,按照上 法进行处理,每个浓度平行处理份,室温下放置 述色谱条件下进行.分析,测定血浆质控样品中五昧子醇甲、五味子甲 素、五味子乙素和睾丸酮色谱峰的峰面积,并计算各待测峰与内标峰的峰面 积比 值,根据比值计算其日内稳定性和日间稳定性的。测定结果见表.。 表.大鼠血浆中被测木脂素成分的日内稳定性和日间稳定性. ? 南京中医药大学硕士学位论文 结果表明:血浆样品,低、中、高三种浓度的质控样品中五味子醇甲、五味 子甲素和五味子乙素的日内稳定性和日间稳定性的值均小于%,符合生 物样品