猪圆环病毒病研究进展

猪圆环病毒病研究进展 猪圆环病毒病研究进展 疫病防治 杨晓天江岸林黄江峰(广西柳州武宣种畜场545905)李纪春(广西柳州市动物疫病 预防控制中心545005) 猪圆环病毒病(Porcinecircovirus associateddisease.PCVAD)主要是由 猪网环病毒2型(Porcinecircovirus type2)引起的断奶仔猪多系统衰竭综 合症(Post—weaningmuhisystemicwat— ingsyndrome,PMWS)以及其他相关 疾病.感染圆环病毒的猪生长缓慢, 饲料报酬率低.同时造成淋巴系统损 伤和免疫缺陷.引起其他疫病的大爆 发,给世界各国养猪业的发展造成了 严重威胁和巨大的经济损失. 1病原特征 PCV属圆环病毒科(Circovirdae) 圆环病毒属成员.为无囊膜的单股环 状负链DNA病毒,呈2O面体对称, 病毒粒子直径约为17,20nm,是迄今 发现最小的动物病毒之一.病毒以滚 环方式复制,病毒粒子的浮密度为 1.37g/era,沉降系数为52S.该病毒对 外界环境的抵抗力较强.70?时可存活 15min.56oC不能将其灭活,在pH3的 酸性环境及氯仿可以存活较长时间. 根据PCV抗原性及基因组成不同. 将其分为两种基因型(或称血清型), 即PCV1及PCV2.PCV1是1974年首 次从猪传代细胞系PK一15中作为一种 污染物分离出来的病毒[11.动物实验 表明该病毒无致病性.可广泛存在于 正常猪体内各组织器官.而PCV2是引 起PMWS的主要病原.PCV1与PCV2 的血清学交叉反应有限. 2流行病学 PMWS在1991年首先发现于加拿 大西部,随后,美国,法国,北爱尔 兰,墨西哥等国也确认了该病的存在. 郎洪武等闭应用EHSA法对我国7省 (市)22个猪群559份猪血清样品进行 检测.总阳性率达42.9%.表明我国猪 群中存在PCV2感染. PCV2可经口腔,呼吸道等途径感 染不同年龄的猪.感染母猪体内的病 毒亦可经胎盘垂直感染仔猪.病猪或 带毒猪可以通过粪便,分泌物将病毒 排}}j,造成病毒在猪群中的蔓延和扩 散.PCV2主要易感动物是猪.但Tis— cher等131应用EUSA和间接免疫荧光 试验(IIF)检测发现:在人,牛和鼠 血清中也存在能与PCV发生群特异性 结合的低水平抗体. 3致病机理 Rosell等研究发现.PCV2从猪 的鼻,口腔侵入体内.在扁桃体,局 部淋巴结增殖后.向其他淋巴组织, 肺,肝,肾扩散.受慢性感染的影响, 诱发免疫抑制,肠炎,问质性肾炎及 肝损伤.MeNeilly等研究了PCV感染 对猪肺巨噬细胞体外免疫功能的影响, 结果发现PCV感染对抗体Fc和补体受 体或吞噬作用无任何影响.但他们观 察到PCV感染4d对细胞MHC—I类抗 原的表达有上调作用.而感染后8d可 降低细胞MHC一?类抗原的表达.并 且对巨噬细胞介导的,分裂素诱导的 淋巴细胞增生有明显抑制作用.Shiba— har等证实PCV诱导了淋巴系统中B 细胞凋亡,使患猪处于免疫抑制状态. Krakowka等研究表明,PMWS症状的 出现不仅需要PCV2,而且PPV也具有 重要的作用.PMWS和PRRS具有很多 相似的病理变化.猪的皮炎与肾病综 合症(PDNS)与PCV感染有一定相关 性;在PCV2感染猪群中,很容易发生 副猪嗜血杆菌等细菌的继发感染. Segales等阁用流式细胞计数器分析感 染猪外周血液中自细胞变化.发现单 核细胞增加,T淋巴细f主要是CD4+1r 和B淋巴细胞减少.不成熟粒细胞的 密度偏低.以上表明.PCV引起了淋 巴细胞凋亡,APC递呈抗原能力的减 弱,同时降低了B淋巴细胞和CD4CF 细胞的机能.因此使患者猪处于免疫 抑制状态,导致患猪抵抗力下降. 4诊断方法 首先,根据临床症状和病理剖检 变化进行初步诊断.但PCV2感染的临 床症状和其它疾病难以区分.因此必 须结合实验室诊断方法才能确诊.无 PCV1污染的猪肾细胞系(PK15)可用 于PCV2病毒的分离培养,但PCV2在 培养细胞中不产生细胞病变.因此通 常采用免疫学或分子生物学技术来确 定pCV2存在. 4.1间接免疫荧光试验(Indirect immunofluorescenceassay,IIF) 芦银华等[61用PK一15细胞增殖猪 PCV2制备抗原建立的检测PCV抗体的 间接免疫荧光试验对64份临床血样进 行检测.结果38份呈现抗体阳性 (59%). 4.2免疫过氧化物酶单层细胞试验 (Immunoperoxidasemonolayerassay, IpMA) 该方法原理与间接免疫荧光相同, 只是检测指示系统不同.IIF应用荧光 标记的二抗进行,而IPMA则采用酶标 显色系统来进行,刘长明等同建立了 PCV2一IPMA方法.特异性及敏感性均 较好.可以用于实验室PCV2抗原和血 清抗体的检测.IPMA是一种比较实用 的方法.非特异性反应低于间接免疫 荧光.也不需要荧光显微镜.只需要 普通的倒置显微镜即可,结果保存时 间长. 4.3酶联免疫吸附试验(Enzyme— linkedimmunosorbentassay,ELISA) ELISA检测方法具有诊断速度快. 敏感性高.特异性强等优点,适合大 规模检测,是一种便于普及的技术. 4.3.1间接EUSA 张朝霞等[81以杆状病毒表达系统 表达的PCV2一Cap为包被抗原建立的 了间接ELISA用于PCV2血清抗体的 检测.以IPMA为标准检测,具有较高 的敏感性和特异性. 4.3.2竞争性EUSA 200o年,WalkerI等I91建立了竞 争性ELISA.该方法的敏感性和特异 性可达99.58%与97.14%.此方法可用 于大规模猪群的PCV快速诊断. 慝 疫病防治 4.3_3抗原捕获EUSA 抗原捕获EUSA是一种检测病原 的ELISA方法,其原理类似于双抗体 夹心ELISA,McNeilly等11o]以PCV2 特异性单克隆抗体为包被抗体,兔抗 PCV2高免血清为检测抗体建立了抗原 捕获ELISA方法用来诊断PMWS,与 病毒分离,IHC和PCR等方法比较. 除PCR外,其他方法均可鉴别PWMS 与PCV2的亚临床感染. 4.4酶免疫试验fEnzymein— nunoassay,EIA) 酶免疫试验法,即抗原抗体反应 后不必将结合的与游离的抗原或抗体 分离,就可以测定被测分子的含量, 如酶放大免疫分析技术(Enzymemulti— pliedimmunoassaytechnique,EMIT): 将小分子抗原连接在酶分子的活性位 点附近,当抗体与这些抗原结合后, 即封闭了酶催化位点,使酶失去活性, 如果被检测溶液中无响应抗体,则酶 催化第五形成产物.Shkaeva等/111利 用杆状病毒表达蛋白PCV2一Cap蛋白. 镍柱纯化后作为间接ELA的检测抗原. 建立一种EIA用于PCV2血清抗体的 检测,与IIF相比该方法具有较高的特 异性和敏感性.而且操作起来较间接 ELISA方便.不需要反复的洗板. 4.5聚合酶链式反应(Pob,merase chainreaction,PCR) PCR方法是一种快速,简便,特 异的诊断方法,经过多年的研究.国 内外已经建立了多种形式的PCR方法, 包括常规的PCR,复合PCR,竞争 PCR和套式PCR等. 4.5.1普通PCR 刘健等[121在PCV2的基因保守区 设计了一对引物.利用PCR方法可扩 增得到536bp的片段.该方法能够特 异的检测卅PCV2的DNA.而对猪细 小病毒,伪狂犬病毒及未接种PCV2的 PK一15细胞均呈阴性.该法能检测到 29ng/L的病毒DNA,特异性,敏感性 较高. 4.5.2巢式PCR(NestedPCR) 巢式PCR是利用两套引物对靶序 列进行两轮PCR扩增,该方法比普通 PCR更加灵敏与特异.Mclntosh等1131 利用巢式PCR检测自然感染猪精液中 的PCV2.为阐明PCV2的传播方式及 PCV2对精子质量的影响提供一种技术 112口叵囵匮盈固2011.2 手段.Lyoo等[141通过设计特异性引 物,建立了一种能够鉴别PCV,2a和 PCV一2b的巢式PCR,敏感性高于普通 PCR. 4.5.3定量PCR(QuantitativePCR) 定量PCR即是利用PCR反应来测 量样品中的DNA或RNA的原始 拷贝数量.冯志新等?设计合成了一 套引物和TaqMan探针,特异性扩增 PCV2的0R基因.在国内首次建立 了快速定量检测PCV2的实时PCR方 法,利用该法与普通PCR对PMWS人 工发病猪的lO份组织及30份血清样 品检测.结果表明所建立的实时PCR 具有更快速,灵敏,准确等优点. Mclntosh等【q根据PCV2一Rep的保守 序列设计了一对引物.建立了一种光 谱检测各种PCV2毒株的绿色荧光实时 定量PCR.利用该方法成功的从血清, 粪便,肠系膜淋巴结,心肌层,肝脏, 肾脏中检测出PCV2. 4.5.4环介导恒温扩增(Loop—me— diatedisothermalamplification,LAMP) LAMP是近年来新出现的一种PCR 技术,该方法应用方便,对设备要求 低,不需要PCR仪,只需水浴锅就行. 史利军等II根据PCV2的Rep和Cap 基因保守区设计2对引物.建立了用 于检测PCV2的LAMP方法,该方法在 63qc条件下只需反应1h.具有较好的 特异性及灵敏度.可以检测到样品中 10个拷贝的PCV2DNA含量. 4.5.5限制性片段长度多态性PCR (PCR—restrictionfragmentlengthpoly— morphism,PCR—RFLP) PCR—RFLP首先利用PCR扩增目 的基因.然后用限制性内切酶酶解样 品DNA,根据酶切片段的电泳条带或探 针杂交方法来区分样品DNA分子水平 差异.Takahagi等[根据PCV2一 ORF2建立了一种RFLP方法,该方法 可用于PCV2a和PCV2b的鉴别. 4.6基因芯片技术(Gene-Chip) 基因芯片技术是近年来分子生物 学与微电子学等多学科交叉融合而成 的一项高新技术.An等?建立了一 种可以同时检测病料中PCVl和PCV2 的DNA芯片技术.该方法具有高度敏 感性.可以检测10TCID~fmLPCV2和 PCV1.利用该方法对141份疑似病料 检测.以原位杂交为标准该方法的敏 感性和特异性分别为100%和98.9%. 4.7核酸原位杂交技术(Insite hybridization,ISH) 杂交组织(细胞)化学是应用核 酸分子间碱基互补的性质,并结合组 织化学和免疫组织化学技术.在组织 切片(或细胞片)上显示特异性核酸 (DNA或RNA)片段的一种技术. Perez—MartinE等f捌建立了检测PCV2 的原位杂交方法.利用该方法可以检 验出感染了PCV2的不同组织细胞,但 是不能鉴别组织细胞中该病原是否正 在复制增殖,Hamberg等『2l】结合免疫 组织化学技术和PCV2特异性原位杂交 技术建立了一种检测方法可以鉴别 组织切片中正在复制过程中的PCV2和 非复制状态的PCV2. 5免疫防治 本病目前主要采取综合防治措施. 重点加强饲养管理.减少和降低PCV 感染的几率,对猪群进行疫苗免疫. 目前国外有四个厂家有圆环病毒疫苗, 勃林格,富道,INTERVET和梅里亚, 在国内上市的是勃林格的重组亚单位 疫苗,这个苗可用到仔猪身上.我国 生产PCV疫苗的厂家主要是洛阳普莱 克,其产品为灭活疫苗.随着分子生 物学技术的发展,核酸疫苗,活载体 疫苗等新型疫苗正在积极研究中.成 为目前的主要研究热点. 6小结 虽然国内外许多学者已做了大量 研究.但PCV2引起的相关猪病的病原 和发病机制还未完全清楚.如何预防 和控制该病毒引起的各种疾病以及一 些潜在的问题还缺乏全面的了解.但 随着研究的深入.这些问题将逐一解 决.新的行之有效的疫苗也将被发现. 这将对降低全球养猪业的经济损失起 着不可估量的作用. 参考文献: [1】ClarkEG.Postweaningmultisystemic wastingsysdrome【c】.Proceedingsofthe AmericansAssociationofSwinePractitioners, 28thAnnualMeeting.QuebecCity:Canada, 1997:499-501. 1郎洪武,张广川,昊发权,等.断奶猪 多系统衰竭综合症血清抗体检测【I1.中国兽 医科技,2000,30(3):3-5. [3】TischerI,BodeL,ApoaacaJ,eta1. PresenceofantibodiesreactingwitIlporcine 用土豆汁治疗家畜疾病 胡海梅(青海省互助县五峰畜牧兽医服务中心810500) 土豆又名马铃薯,洋芋等.为茄 科草本植物,它的块茎具有很高的营 养价值和药用价值.据《中华本草》 药典记载:生土豆汁有治胃炎,胃溃 疡,十二指肠溃疡等效果.我国医学 认为:土豆昧甘性平,具有补脾益气, 健脾和胃,养脑恰神,消炎散结,延 年益寿的功效.土豆中的纤维素细嫩, 对胃肠勃膜没有刺激性.所以肠胃病 吃煮烂的土豆效果良好:常吃土豆还 可治习惯性便秘,皮肤湿疹等.土豆 中的钾可使肾脏血管收缩.有利尿作 circovirusinseraofhumans,mice,andcatde D】.ArchVirol,1995,140(8):1427—1439. 【41R.oseUC,SegalesJ,PlanaDuranJ,eta1. 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S.eta1.Developmentandvalidationofa SYBRgreenreal一吐mePCRforthequantifi— cationofporcinecircovimstype2inserum, bucoat,feces,andmultipletissues?】.Vet Microbiol,2009,133:23—33. 【l7】史利军,张锦秀,章金刚,等.猪圆环 病毒2型LAMP检测方法的建立与评价U1. 中国兽医,2010,30(2):174—176. 【18】TakahagiY,NishiyanaaY,Tokis,et a1.Genotypicchangeofporcinecircovimstype 2onJapanesepigfarmsasrevealedbyrestric- tionfragmentlengthpolymorphismanalysis?】_J VetMedSci,2008,70(6):603-606. [19】AnDJ,SongDS,ParkyY,eta1.A DNAminiarraysystemforsimultaneousvisual detectionofporcinecircovirustype1(PCV1) and2(PCV2)inpigs.VetResCommun, 2009,33(2):139—147. [20】Perez,MartinE,KoviraA,Cal— samiaM,eta1.Anewmethodtoidentify celltypesthatsupportporcinecircovimstype2 rephcadoninformalin—fixed,paraffin—embed- dedswinetissues[[].JVirolMetho~,2007,146: 86-95. 121】HarnbergA,RJnglers,KrakowkaS. 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