D5_PICCS120006_CN200910044965.X_硼替佐米耐药骨髓瘤细胞株及其构建方法与应用_CN101613675

口9J 中华人民共和国国家知识产权局 [51 J Int. Cl. [12 ]发明专利申请公布#说明# C12N5/G施。α76.01 ) C12Q 1/68 (J伽~ 01 ) C12Q ν倪。制~ 01 ) [21J 申请号 200910044965. X ω1N27/447 (J脱~ 01 ) ω1N27/64 (21α76.01 ) [43J 公开日 2009 年 12 月 30 日 [22J 申请日 2009. 1. 7 [21J 申请号 200910044965. X [71J 申请人 中国人民解放军第三军医大学 地址 200433 上海市翔殷路 800 号 [72J 发明人朱蓉侯健姜华顿晓熠 屈晓燕马仰丽 [54 J 发明名称 跚替佐米耐药骨髓瘤细胞株及其构建方法与 应用 [57J 摘要 本发明涉及生物医药技术领域。 蛋白酶体抑制 剂棚替佐米对多种血液系统肿瘤有显著作用，己被 批准用于多发性骨髓瘤及淋巴瘤的临床治疗。 临床 研究发现部分 MM 患者对跚替佐米产生了耐药反应 或在初期治疗有效的 MM 患者中出现耐药及疾病的 复发。 本发明的目的是提供棚替佐米耐药骨髓瘤细 胞株及其构建方法与应用。 本发明通过构建跚替佐 米耐药骨髓瘤细胞株，对该细胞株进行的基因芯 片、蛋白电泳、实时定量 PCR 等检测，证实耐药细 胞株与亲本骨髓瘤细胞株之间存在多个基因达差 异及蛋白表达差异:这些差异基因和蛋白可用于研 究棚替佐米在骨髓瘤中的耐药机制。 本发明可用于 筛选抗棚替佐米耐药药物。 [l1 J 公开号 CN 101613675A [74J 专利代理机构 上海德昭知识产权代理有限公 司 代理人 I振英 权利要求书 2 页说明书 15 页附图 3 页 200910044965.X 权利要求书 1、一种棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株，其特征在于是按照以下方法构建 的: A、取生长期的骨髓瘤细胞株 NCI-H929，采用浓度为 1-10nmollL 的棚替佐米诱导; B、逐步增加棚替佐米浓度至 200nmollL，获得棚替佐米耐药骨髓 瘤细胞株。 2、根据权利要求 1 所述的一种棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株，其特征在 于是按照以下方法构建的: 取生长期的骨髓瘤细胞株 NCI-H929，采用浓度为 10nmolIL 的棚 替佐米诱导; 2-3 天半量换液一次，每 1-2 周浓度提高 10nmollL，直至 终浓度达到 200nmollL，培养时间为 8 个月，获得棚替佐米耐药骨髓 瘤细胞株。 3、如权利要求 1 所述的棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株的构建方法，其特 征在于该方法包括以下步骤: A、取生长期的骨髓瘤细胞株 NCI-H929，采用浓度为 1-10nmol尼 的棚替佐米诱导: B、逐步增加棚替佐米浓度至 200nmol几，获得棚替佐米耐药骨髓 瘤细胞株。 4、根据权利要求 3 所述的棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株的构建方法，其 特征在于该方法包括以下步骤: 取生长期的骨髓瘤细胞株 NCI-H929，采用浓度为 10nmolIL 的棚 替佐米诱导; 2-3 天半量换液一次，每 1-2 周浓度提高 1OnmollL ，直至 终浓度达到 200nmollL，培养时间为 8 个月，获得棚替佐米耐药骨髓 瘤细胞株。 5、根据权利要求 4 所述的棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株的构建方法，其 特征在于该方法为: 取指数生长期的 NCI-H929 骨髓瘤细胞株 lxl091L 接种于 6 孔板， 加入含棚替佐米终浓度为 10nmolIL 的 RPMI1640 培养液+10%胎牛血 2 第1/2页 200910044965.X 权利要求书第2/2页 清，置于 37 0C 、含 5%C02、饱和湿度的培养箱中培养， 2-3 天半量换 液至细胞生长恢复正常，再次加入终浓度为 10nmol几的棚替佐米，反 复三次后棚替佐米的终浓度增加至 20nmolIL ，逐步增加浓度至 200nmollL，培养 8 个月，获得棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株。 6、如权利要求 1 或 2 所述的棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株在筛选抗棚替 佐米耐药药物中的应用。 3 200910044965.X 说明书 第1/15页 棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株及其构建方法与应用 技术领域 本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种蛋白酶体抑制剂棚替佐米 耐药骨髓瘤细胞株，及其构建方法，在筛选抗棚替佐米耐药药物中的应用。 背景技术 蛋白酶体抑制剂是近年来抗癌新药的研究热点，临床前期研究己正式 蛋白酶体抑制剂棚替佐米对多种血液系统肿瘤有显著作用，己被批准用于多 发性骨髓瘤及淋巴瘤的临床治疗。棚替佐米为哺乳动物细胞中26S蛋白酶体 廉蛋臼酶样活性的可逆抑制剂，化学名为: [(1R)-3-甲基-1-[[(2S)-1-氧-3-苯基 -2-[(毗嗦竣基)氨基]丙基]氨基]丁基]棚酸，分子式C19H25BN404' 相对分子量 384.240 它是一特异性强效、高效蛋白酶体抑制剂。 Mateos等报道，采用棚 替佐米联合MP(VMP方案)治疗60例65岁及以上的老年初诊多发性骨髓瘤 C Multiple Myeloma，岛岱1) 患者，总反应率为89% ， CR率为32% ， 16个月的 无事件生存率(EFS)为930/0; 而历史对照的MP方案总反应率为420/0 ， 16个月的 EFS为51%0 2008年美国国家综合癌症网络 CNational Comprehensive Cancer Network，NCCN) 骨髓瘤诊疗指南中也推荐将棚替佐米+地塞米松(简称VD 方案)、棚替佐米+地塞米松+阿霉素(简称PAD方案)、美法仑+强的松+棚替 佐米(简称MPV)用于初发及移植候选的h⑩f患者。对于难治/复发的肌岱f患者 2008年NCCN指南中将棚替佐米单药及棚替佐米联合脂质体阿霉素作为I类 推荐，石朋替佐米+地塞米松方案作为2A类推荐。然而，随着其临床应用范围 的扩大和时间的推移，国内外临床研究已发现部分h矶4患者对棚替佐米产生 了耐药反应或在初期治疗有效的MM患者中出现耐药及疾病的复发 CRichardson PG, Barlogie B , Berenson J, et al. A phase 2 study of bortezomib in relapsed, re仕actory myeloma. N Engl J Med, 2003;348:2609-2617.) 。 目前，国内外关于棚替佐米的耐药机制研究尚少，其耐药机制尚不明 确。有研究国外分析了多药物耐药蛋白他眼趴在h也4细胞中的表达与棚替 佐米诱导岛岱f细胞凋亡间的相关性，研究显示h仪的和h饭时的表达不足以遏 4 yqp 线条 yqp 线条 yqp 线条 yqp 线条 yqp 线条 yqp 线条 yqp 线条 yqp 线条 200910044965.X 说明书第2/15页 制棚替佐米诱导产生的凋亡作用，从而提示棚替佐米可能并非为多药耐药转 运蛋白的底物。这就提示，棚替佐米的耐药不同于现有肿瘤治疗中经典的多 药耐药。 另外， Selga等采用基因芯片技术分析了甲氮喋岭(Methotrexa饵， MTX) 敏感与耐药的人HT29肠癌细胞株，结合实时定量PCR、基因转染及小RNA 干扰等技术研究发现Caveolin-1和E-cadherin在MTX耐药的HT29细胞中表达 下调，可能与耐药有关，提示其可能为潜在的治疗靶点( Selga E, Morales C, Noé V, Peinado MA, Ciudad CJ.Role of Caveolin 1, E-Cadherin, Enolase 2 and PKCalpha on resistance to methotrexate in human HT29 colon cancer cells. BMC Med Genomics,2008;1 :35. ) 0 Shen等采用二维电泳技术分析了阿霉素 CAdriamycin , ADM) 敏感和阿霉素耐药的K562白血病细胞株，共鉴定发 现了9个差异表达的蛋白，其中CRKL在ADM耐药K562细胞中表达明显上调， 而通过转染重组慢病毒psc-2 LVshCRKL可下调该蛋白的表达。此外，采用 RNA干扰技术沉默了CRKL基因的表达后ADM的耐药可被逆转，提示CRKL 与多耐药相关，该蛋白可望作为反义治疗技术的作用靶点 (Shen SH, Gu LJ, Liu PQ, Ye X, Chang WS, Li BS.Comparative proteomic analysis of differentially expressed proteins between K562 and K562/ ADM cells.Chin Med J (Engl),2008 ; 121(5):463-8.)。这些文献均给出通过耐药细胞株找到差异蛋白 后筛选耐药药物的启示。 因此，如果能建立棚替佐米耐药的骨髓瘤细胞株，可以深入研究棚替 佐米可能的耐药机制，为临床应用蛋白酶体抑制剂治疗多发性骨髓瘤，监测 和避免治疗中耐药的发生提供实验依据:同时，为抗耐药药物的筛选提供细 胞模型，以期达到逆转耐药提高疗效的目的。 目前尚未有棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株的报道。 发明内容 本发明的目的是提供一种棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株，及其构建方法与 应用。 本发明提供了一种棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株。 本发明还提供上述棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株的构建方法。 本发明的具体技术方案是:一种棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株，是按照以 5 200910044965.X 说明书第3/15页 下方法构建的: A、取生长期的骨髓瘤细胞株 NCI-H929，采用浓度为 1-10nmollL的棚 替佐米诱导; B、逐步增加棚替佐米浓度至 200nmollL，获得棚替佐米耐药骨髓瘤细 胞株。 本发明也可以是其他骨髓瘤细胞株，由于 NCI-H929 是目前国际上公认 的一株骨髓瘤细胞株，生物学及遗传学形状己研究的较为明确了，是国内外 实验中较为常用的骨髓瘤细胞株之一，因此本发明选用该细胞株。 上述棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株，较佳地，是按照以下方法构建的: 取生长期的骨髓瘤细胞株 NCI-H929，采用浓度为 10nmolIL 的棚替佐米 诱导; 2-3 天半量换液一次，每 1-2 周左右浓度提高 10nmollL，直至终浓度 达到 200nmollL，然后停药 1 月后进行相关检测，培养时间为 8 个月，获得 棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株。 本发明还提供上述棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株在筛选抗棚替佐米耐药 药物中的应用。 本发明构建棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株之后，利用该细胞株进行基因组 学、蛋白组学等方面的研究。通过研究，进一步了解棚替佐米在骨髓瘤中耐 药可能的机制，以及为筛选可逆转耐药的基因及蛋白提供实验室依据。 棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株的生物学特性的观察及耐药机制的研究，具 体包括: 1.取指数生长期的亲本 H929 细胞及耐药 H929 细胞，进行流式细胞术细 胞周期分析: 2. 取指数生长期的亲本 H929 细胞及耐药 H929 细胞，提取 RNA 行表 达谱基因芯片分析: 3.采用分析软件结合基因通路相关网站，分析基因芯片结果，初步确定 差异基因及与耐药相关的可能的信号通路: 4. 进行实时定量 PCR 检测可能与耐药相关的差异基因，进一步验证基 因芯片结果: 5.取指数生长期的亲本 H929 细胞及耐药 H929 细胞，提取蛋白进行双相 二维电泳，结合质谱分析确定差异基因。 本发明通过对棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株进行的基因芯片、蛋白电泳、 6 200910044965.X 说明书第4/15页 实时定量 PCR 等检测，证实耐药细胞株与亲本骨髓瘤细胞株之间存在多个 基因表达差异及蛋白表达差异。这些差异基因和蛋白作为研究棚替佐米在骨 髓瘤中的耐药机制，并为筛选抗耐药药物提高实验依据。从而达到逆转耐药 提高疗效的研究目的。 附图说明 图 1 为本发明的棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株与亲本的流式细胞周期图。 A 亲本流式细胞周期图 B 本发明的棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株流式细胞周期图 图 2 为本发明的棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株基因芯片数据分析图。 图 3 为采用实时定量 PCR法验证基因芯片差异表达基因图。 图 4 为采用二维电泳法，对亲本及棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株间存在的差异 蛋白进行鉴定结果图。 具体实施方式z 下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。 实施例 1: 砌替佐米耐药骨髓瘤细胞株的建立 取指数生长期的 NCI-H929 骨髓瘤细胞株(购自美国菌种保藏中心 (ATCC) ，可用长期液氮保存，实验时复苏后使用的) lxl09/L接种于 6 孔板， 加入含棚替佐米(由西安杨森公司提供原药)终浓度为 10nmol/L的 RPMI1640 培养液(购自 Gibico 公司) +10%胎牛血清，置于 37 0C、含 5%C02、饱和湿 度的培养箱中培养 ， 2-3 天半量换液至细胞生长恢复正常(大约为 1-2 周)， 再次加入终浓度为 10nmol几的棚替佐米，反复三次后棚替佐米的终浓度增 加至 20nmol/L。如此逐步增加浓度至 200nmolι 培养 8 个月，获得棚替佐 米耐药骨髓瘤细胞株(以下称 NCI-H929B) 。 实施例 2: 采用 MTT 法测定亲本及耐药骨髓瘤细胞株的 IC50 MTT 法参考工具书:薛庆善，体外培养的原理与技术，科学出版社， 2001; 343 。 棚替佐米相对分子量 384.24，且根据本申请人测得 NCI-H929 对于棚替 佐米的 IC50 约为 20.7nmol/L，以此为参考实验浓度分别为 lnmol/L、 10 nmol/L、 50 nmol/L、 100 nmol/L、 500 nmol/L及 1000 nmol/L六个浓度。取 7 200910044965.X 说明书第5/15页 停药至少 2 周以上的 NCI-H929B 细胞，取指数生长期的细胞悬液，浓度调 整为 lxl051L，分别接种于 96 孔板，每孔含 90ul，置于 37 0C 、含 5%C02、 饱和湿度的培养箱中培养 24h 后，分别加入六个浓度的棚替佐米，每孔 10时， 每一浓度均设 3 个复孔。培养 20 小时后，加入 10ulMTT 液，共同培养 4 小 时每孔加入酸化异丙醇 100时，将其完全溶解，采用波长 570 run，进行酶标 仪检测，测定半数抑制率。根据测定结果， NCI-H929B IC50 为 487 .4runollL, 耐药倍数=耐药细胞 IC50/亲本细胞 IC50=487.4/20.7=23.5 。 实施例 3: 流式细胞术分析细胞周期 取指数生长期的 NCI-H929 、 NCI-H929B 细胞悬液，分别计数，取 lxl061L，离心、去上清，加入 70%冰乙醇打匀固定， 0-4 0C过夜。次日，再 次离心去上清， PBS 洗涤 2 次， RNA 酶作用 15 分钟，加入腆化丙徒、精胶 作用 15 分钟，调整细胞浓度为 lxl061L，上流式细胞仪做细胞周期分析。 结果如图 1 所示，图中纵座标 Y 表示被测细胞的绝对数目，横座标 x 是所测的荧光或散射光的强度，用"道数"表示: 1 )图 lA 为亲本 NCI-H929 流式细胞周期图:S 期比例为 54.28% ， G1 期 为 36.83%，G2 期为 8.89% ， G2/Gl: 1.85 2) 图 lB 为 NCI-H929B 细胞流式细胞周期图:S 期比例为 5 1.88% ， Gl 期为 32.36%，G2 期为 15.76% ， G2/G1: 1. 85 。 实施例 4: NCI-H929、 NCI-H929B 细胞总 RNA 的提取 1) 收集 lx 107/NCI-H929、 NCI-H929B 细胞，用 PBS 2000甲m 洗 5 分 钟，每管加 TRIZOL 试剂(Gibico, Invitrogen, USA) 1 ml (用Rnase-free 枪头， 边加边振荡)，充分混匀。 -80 0C保存。 2) 加新开的氯仿 0.2 ml (1 :5 的体积)，剧烈振荡，室温静置 5-10min。 3) 12000 甲m ， 15 min , 4 0C ，离心。然后取上清至 EP 管 (DEPC 处理 过)。 的加 0.5 ml 新开的异丙醇( 1: 1 体积)，轻摇(防止 RNA 断裂)，室 温静置 10min 。 5) 12000 叩m ， 15min, 4 0C ，离心。弃上清。 6) 总阳证A 为管底的臼色沉淀，加 75%乙醇 1 ml 洗涤(用 DEPC 水新 配制)后， 10000 甲m， 10 min , 4 0C 。离心。 7) 去上清，气干沉淀 5-10 分钟，至沉淀半透明， 加 sigma-water 20-30 8 200910044965.X 说明书第6/15页 u 8) 96 孔板稀释，测 OD 值。 9) 吸取 500吨的 RNA+loading buffer 10时， 65 0C加热 8min 后立即冰置 (目的:打开二级结构〉 11) 电泳。 12) 将抽好的 RNA-80 0C保存(反复冻融不得超过 3 次)。 实施例 5: NCI-H929 、 NCI-H929B 细胞表达谱基因芯片分析 NCI-H929 、 NCI-H929B 两种 m时'fA 分别变性及逆转录至 cDNA，分别 标记荧光染料 Cy3 及 Cy5 后，与载有 12673 个克隆的 cDNA 芯片(由上海市 血液病研究所医学基因组国家重点实验室提供)空气浴杂交， 65 0C 15 h 。 芯片结果分析，结果如图 2 所示: 1) 根据筛选出的耐药组与正常组的骨髓瘤细胞差异基因进行基因功能 分析，确定该群基因在 GO 分类的规律，找到显著性 GO 分类中的基因，这 些基因的上下调差异表达即导致样本差异的具有靶向性的关键基因: 2) 同时对差异基因产物主要分布的 Pathway 进行显著性分析，找出与 实验目的有显著联系的 Pathway; 3) 取显著性 GO 分类中的关键基因与显著性的 Pathway 中的关键基因 交集，作为重点研究的靶点基因群。 4) 采用基于阻GG Pathway 数据库的 Path-Net 技术，从网络角度发现 显著性 Pathway 之间的激活关系，从而确定出具有中心调控能力 Pathway 。 实施例 6 :实时定量 PCR 检测差异表达的基因 1、引物设计 根据 GenBank 中下列六个基因的己知序列结合 primer5.0 程序设计出目 的基因引物序列: FAOO P: 5' CACGACCTGCTGCGGCGCG 3' (SEQ 10 NO:l) FAOO M: 5' CCCGCACACGCTCTGTCAGG 3' (SEQ 10 NO:2) TRAF2P: 5' CCGAATGTCCCGCGTGCAAAG 3' (SEQ 10 NO:3) TRAF2M: 5' CCTGAAACTTCTCCCGGGGG 3' (SEQ 10 NO:4) Casp8P: 5' GATGAATTTTCAAATGGGGAGGAG 3' (SEQ 10 NO:5) Casp8M: 5' CATTCCTGTCCCTAATGCTGTG 3' (SEQ 10 NO:6) CASP7P: 5' TGTGCCAAGATGCAAGATCTGC 3' (SEQ 10 NO:7) CASP7M: 5' TCGGCAAGCCTGAATGAAGAAG 3' (SEQ 10 NO:8) HSP86P: 5' GTTAACTGGTACCAAGAAAAGGC 3' (SEQ 10 NO:9) HSP86M: 5' CAGGCATCAGTAGCCTAAGCAA 3' (SEQ 10 NO:I0) 9 200910044965.X 说明书第7/15页 MAP3K5P: 5' TTCCTGATGACAAGAAAGGTATAC 3' (SEQ 1D NO:ll) MAP3K5M: 5' TGCTTCTCCCCTTCTCTTCGG 3' (SEQ 1D NO:12) 至上海英俊生物公司订制六对引物。 2、提取总 RNA 取指数生长期 NCI-H929 、 NCI-H929B 悬浮细胞 5x106 ， 2000rpm 离心 5 分 钟，弃去上清，加入 1mlTRlzol 裂解，加入 200ul 氯仿，用力颠倒混匀，室 温静置 10 分钟， 4 0C ， 13000rpm，离心 30 分钟，从每管吸取上清至另一 1.5mlEP 管中，加入等体积异丙醇，混匀后一20 0C沉淀 1 小时。 4 0C ， 13000rpm，离心 20 分钟，弃去上清液，加入 500u175%乙醇，洗涤沉淀。 4 0C ， 13000rpm，离 心 10 分钟，弃去上清，加入 10ulDEPC 水至完全溶解，进行电泳分析测定。 逆转录反应 取总 RNA1ug 加入 0.2mlPCR 管中，加入 OligodT 1ul 用 DEPC 水补充体 积至 12ul，混匀后 70 0C冰浴 5 分钟，依次加入 5x 反应缓冲液， Riblolck吨NA 酶抑制剂 1ul 、 10mM dNTP 混合物 2ul，混匀后 3TC反应 5 分钟，加入 RevertAid™M-Mul V 逆转录酶 1ul，最终体积为 20ul，混匀后 42 0C反应 60 分 钟，然后 70 0C反应 10 分钟。 3、实时定量 PCR 反应 以 GAPDH 为内参基因，采用上述六对引物。取逆转录产物 1ul，依次加 入 SYBY Premix Ex Taq 酶 10ul，引物及双蒸水。反应循环体系设定如下: Cycle 1: 1X) Step 1: 95.00C t 分钟 Cycle 2: ( 40X) Step 1: 95.00C 15 秒 Step 2: 57.00C 15 秒 Step 3: 72.00C 45 秒 Data collection and real-time analysis enabled. Cycle 3: 1X) Step 1: 95.00C 1 分钟 Cycle 4: 1X) Step 1: 65.00 C 1 分钟 Cycle 5: ( 62X) Step 1: 65.0oC 10 秒 4.计算目的基因的相对表达量 按照下列公式计算样本中六个基因的相对表达量(见参考文献: Livak KJ, Schmittgen TD.Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(心elta Delta C(T)) Method.Methods , 10 200910044965.X 说明书第8/15页 2001 ;25(4):402-8.)，采用CT值代表实时定量PCR的结果， GAPDH作为组织 的内参对照， 6Ct( 目的基因)=目的基因Ct-内参对照基因Ct; 6 6 Ct= 6 Ct(耐 药细胞)-6Ct(亲本细胞);根据公式可计算出耐药株中基因表达/亲:本细胞中 基因表达=2-.6..6.Ct。参照表达谱芯片分析，当候选基因在耐药株中表达/亲本 细胞中表达三1.5时，则认为该基因为过表达，若是三0.5则判定该基因为低表 达。 结果如图 3 及表 1 所示: 1) 通过实验绘制成实时荧光扩增曲线图，横坐标为循环数:纵坐标为 PCR 基线扣除值， (其中 CF值是指样品管的荧光信号达到某 一固定阙值的 PCR 反应循环数，盯U 表示相对荧光单位[relative f1uorescence units , RFU]) , ; 2) 根据公式计算得到结果如表 l 所示，结果提示在 NCI-H929B 细胞株 中 FADD、 Casp8 ， MAP3K5 表达下调，而 Hsp86 表达上调。 表 1 实时定量 PCR 亲本及棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株中相关基因的表达 细胞株 基因名称 L::.Ct 亲本 FADD 4.53 NCI-H929 TRAF2 11. 97 Casp8 4.87 Casp7 4.87 HSP86 4.53 MAP3K5 6.03 NCI-H929B FADD 6.27 TRAF2 12.17 Casp8 6.40 Casp7 5.53 HSP86 2.97 MAP3K5 7.83 实施例 7 :二维电泳分析及差异蛋白鉴定 1、细胞蛋白提取: - L::. L::. C t 2-L>L>Ct 一1. 74 0.30 一0.20 0.87 -1. 53 0.34 一0.66 0.63 1. 56 2.95 一1. 80 0.29 」一→ 1) 取指数生长期的NCI-H929及NCI-H929B细胞悬液，总数为 1x1081L， 1000叩m离心10min收集细胞:如果是悬浮细胞则直接离心收集。 2) 往离心管中加入r-.-5ml冰冻的PBS洗涤细胞，吹打数次， lOOOg、 4 0C 11 200910044965.X 说明书第9/15页 离心5min，弃上清:重复3次(轻柔，避免细胞破裂)。 3) 用山梨醇 (250mM)洗液lml轻轻吹打细胞， 1000叩m离心10min ， 重复一次。 4) 之后完全干燥。 5) 加入适当体积的裂解液(保证蛋白终浓度不能太高或者太低， 3瓶细 胞加150ul裂解液)。 6) 涡旋振荡离心管1 0'"""-'30s ，重悬细胞。冰上放置30min以上。超声破 碎细胞20~30s (管子放置于冰上)。 7) 冰上放置30min 。 8) 14000rpm, 4 0C离心30min。 9) 54000甲m， 4 0C再离心30min 。 10) 取上清，分装， -80oC保存。 2、第一向等点聚焦: (1)从冰箱中取出 IPG 预制胶条，用溶胀缓冲液将胶条泡胀 12 小时。 溶胀缓冲液: 8M 尿素， 2M 硫服， 0.5 %CHAPS，0.52%两性电解质， 0.02 %澳盼蓝， l%DTT (2) 将胶条取出放入聚焦槽内，加入矿物油至没过上样杯，上样量为 0.45mg，并用溶胀 buffer 稀释至 170ul 。 (3) 对好正、负极，盖上盖子。设置等电聚焦程序:攒一贝一但 -m- 但 电压 (v) 时间 (vh) 0-500 500 500 m-m-m nu nU FD-nu qu-nυ --四 hU AU-qJ AU-Fhu- 3500-500 8000 (4) 聚焦结束的胶条。立即进行平衡、第二向 SDS田PAGE 电泳。 3、第二向SDS-PAGE电泳(见补充材料三，推荐使用 12.5%凝胶): (1)配制丙烯酌胶凝胶 2 块。 (2) 待凝胶凝固后，从_20 oC冰箱中取出的胶条，先于室温放置 10 分钟， 使其溶解。 (3) 配制胶条平衡缓冲液1，平衡缓冲液 II 。 平衡缓冲液 1: 50mM Tris-HC16.8 , 6M 尿素， 30%甘泊， 2% SDS , 2 % DTT, 0.02% 澳盼蓝。 12 200910044965.X 说明书第10/15页 平衡缓冲液 II: 50mM Tris-HCl 6.8 , 6M 尿素， 30%甘油， 20/0 SDS , 2.5 %IAA , 0.02 %澳盼蓝。 (4) 平衡胶条:先将胶条放入平衡缓冲液 I 水平振荡 15min，再将胶条 转入平衡缓冲液 II 水平振荡 15min 。 (5) 第二次平衡结束后，将 IPG 胶条从样品水化盘中移出，放到己配好 的 SDS-PAGE f疑胶上端，并将 marker 放到凝胶的一端，再用 0.5%的琼脂糖 将胶条和 marker 封严。并将胶板固定于电泳槽内。 (6) 在电泳槽加入电泳缓冲液后，接通电源，待澳盼蓝指示剂达到底部 边缘时即可停止电泳。 (7) 电泳结束后，轻轻撬开两层玻璃，取出凝胶，进行染色。 4、染色 ①染色: R350: 每片药片用 200ul 染液母液(乙酸:甲醇=120: 80) 溶解，搅拌过夜，滤纸过滤:加入 1800ul 染液稀释液(水:乙酸:甲醇=7: 2: 1)，混匀。 ②脱色:将收集染色液，将凝胶浸于脱色液中，水平摇床振荡。最后 换成 MQ 再洗涤 30min 脱色液: 3% 冰醋酸溶液。 5、差异蛋白分析 把上述得到的 tiff 格式的文件导入到 Melanie Viewer 软件，生成 mel 格 式的文件。具体步骤如下: 1) Spot detection: 所有的被分析的凝胶都用同一参数进行检测，调整spot detection 的各个参数使得凝胶上的spot 在考马斯亮蓝染色水平下都是 清晰可见的。检测之后确认，删除掉明显是杂质的点，或轮廓不清的点。 2) Backgbround substraction: 采用lowest on bound町的扣除背景方法进 行 3) Reference gel: 选择图谱最规矩， spot number 相对最多的凝胶，设置 为reference gel，在后续的差异蛋白之的比较中，其余的凝胶都与参考胶相比 较。 4) Matching: 首先在各个胶上选择分辨率、聚焦较好，确信是同一个蛋 白质点的spot 作为landmark ， landmark 的选取要在胶上均匀分布，选取6-8 个spots 作为胶之间进行matching 的路标。 13 200910044965.X 说明书第11/ 15页 5) Normalization: 目的是化每张胶上spot 的volumn 值，以便胶之 间蛋白表达量的准确比较和分析。我们采用( volumn of each sp创 on a geD I(ωtal volumn oftotal spots on the same gel)xl0000 作为标准化之后的volumn 值，这个值用于后面的差异表达分析(非参数t检验) ，这样就避免了由于上 样量的差异导致的差异表达假像。 6) Dif1岳rential protein analysis: 所有胶经过与reference gel 匹配之后，参 考胶上的每一个点都对应着各个胶上的相应的点，这样的点归为-个Group ， 利用每个spot 经过nomalization 后的volumn 值进行差异表达分析。首先软 件自动分析，然后确认Visualization confirmation，方可认为是差异表达蛋白。 7) 匹配结果，我们利用双向电泳分析软件对双向图谱(考马斯亮蓝染 色)进行分析。 在耐药细胞株组中，可以检测到 763 个清晰可见的 spot; 在对照组中， 检测到 691 个 spot。经上述分析后发现:在耐药细胞株组组中上调的蛋白有 11 个，在对照组中上调的蛋白有 6 个。 6、差异蛋白酶解 酶解步骤: 1) 将200ul 枪头(黄色)顶端剪掉，然后将凝胶上的目的蛋白点切下， 或者用解剖刀将一维电泳上的蛋臼条带切下，装入0.5ml 离心管中，用 Milli-Q 水洗三次，每次10----15min 2) 胶块脱色:用脱色液(50%ACN/25 mM NH4HC03 ) 每次加400时，摇床250rpm 摇动。脱色洗涤三次，直到胶块透明 为止。 3) 胶块加入50ull00%ACN，作用5min，重复一次，最好振荡一下。待 胶块变臼缩小后吸出CAN，并让残留的ACN 自然干燥。 4) 每个胶块加入 10 ul Trypsin 溶液( 1 ug trypsin 溶于 100ul 25mM NH4HC03 pH8.0 中， Sigma) ，这样每个胶块大约100ng trypsin 0 40C 下吸 涨3Omin ，然后补加10ul的25mM NH4HC03 PH8.0 , 37 0C 过夜。 Tη'psin 的 作用时间依据蛋白质分子量的大小而定，分子量越小，作用的时间应该适当 缩短;分子量越大，消化时间适当延长。 5) 对于 MALDI-TOF-MS 蛋白鉴定来说，胶块蛋白消化液无需经过脱 盐处理可以直接取 1 ，-._.2ul (蛋白量少的时候可以重复点样)点样于 MALDI 板上。 14 200910044965.X 说明书第12/15页 结果如图 4 和表 2 所示，根据差异蛋白酶解及质谱鉴定后共鉴定出 17 个差异蛋白，见下表。 表 2 二维电泳中差异表达的蛋白列表 差异 蛋臼代码↑ 蛋白通用名 相对分子 等电点 肤谱用搜索引擎 序列覆盖 蛋白 量(Da) (pI) (MASCOT)积分 (%) 编号. NCI一H929B中上调表达的蛋白 Bl TRAPl 照JMAN Heat shock protein 75 kDa, 80345 8.30 181 36% mitochondria1 B2 ENOA HUMAN A1pha-enolase 47139 7.01 106 28% B3 PDIA3 HUMAN Protein disulfide-isomerase A3 57146 5.98 179 34% B4 STIPl HUMAN Stress-induced-phosphoprotein 63227 6.40 62 18% 1 B5 ANXA1 HUMAN Annexin A1 38918 6.57 143 45% B6 TATD1 HUMAN Putative deoxyribonuclease 34150 6.51 110 32% TATDNl B7 HSPB1 HUMAN Heat shock protein beta-1 22826 5.98 179 53% B8 PARK7 HUMAN Protein DJ一1 20050 6.33 111 60% B9 TBB6 HUMAN Tubu1in beta-6 chain 49825 4. 77 115 38% BI0 K2Cl HUMAN Keratin, type II cytoskeletal 1 66149 8. 16 72 19% B11 CAPZB 田MAN F-actin-capping protein 31616 5.36 91 13% subunit beta NCI-H929B中下调表达的蛋白 Cl PGK2 HUMAN Phosphoglycerate kinase 2 45166 8.74 50 15% C2 SAHH HUMAN Adenosylhomocysteinase 48255 5.92 85 15% C3 ATPB HUMAN ATP synthase subunit beta, 56525 5.26 95 32% mitochondrial C4 GDIRl HUMAN Rho GDP-dissociation inhibi tor 23250 5.02 282 51% 1 C5 ARSI_HUMAN Arylsulfatase J precursor 51177 9. 15 50 11% C6 CPSFl HUMAN Ephrin-Al 162036 5.99 26 8% 15 200910044965.X SEQUENCE LISTING <110> 中国人民解放军第二军医大学 <1 20> 棚替佐米耐药骨髓瘤细胞株及其构建方法与应用 <130> 说明书 <140> 200910044965.X <1 41> 2009一01-07 <160> 12 <170> Patentln version 3.1 <210> <21 1> 19 <212> DNA <213> 人工序列 <400> l cacgacctgc tgcggcgcg <210> 2 <21 1> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 2 cccgcacacg ctctgtcagg <210> 3 <21 1> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 3 ccgaatgtcc cgcgtgcaaa g <210> 4 <21 1> 20 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 4 16 说明书第13/15页 19 20 21 200910044965.X 说明书第14/15页 cctgaaactt ctcccggggg 20 <210> 5 <21 1> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 5 gatgaatttt caaatgggga ggag 24 <210> 6 <21 1> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 6 cattcctgtc cctaatgctg tg 22 <210> 7 <21 1> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 7 tgtgccaaga tgcaagatct gc 22 <210> 8 <21 1> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 8 tcggcaagcc tgaatgaaga ag 22 <210> 9 <21 1> 23 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 9 gttaactggt accaagaaaa ggc 23 17 200910044965.X 说明书第15/15页 <210> 10 <21 1> 22 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 10 caggcatcag tagcctaagc aa 22 <210> 11 <21 1> 24 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 11 ttcctgatga caagaaaggt atac 24 <210> 12 <21 1> 21 <212> DNA <213> 人工序列 <400> 12 tgcttctccc cttctcttcg g 21 18 国的 \H 服 。、 严『 因向 (出 ENd)( 的可吕 23 摇制 哪静静静静程繁星莓鑫鳞楼 mwa 号，钱嗡能紊且必 楼梯谈僻山那川寨鑫魏丁蜗俨揣蔬菜 舰附咐唰}嗦 燃烧脚 v《阳路比叫做陆时蛐鹅〉榜蝉脚 F脚踏川 草地时麟、慈被爱棋?何阳叫跚蝇阳明吨 UW禄，…毅唠擒，锵鹅 H制 J楼滋滋 e翩翩vmM? 蝇啊品挣钱腾 M? 你稽必必蹦蹦酣荡主黠< (ZSNJb33223 摇细 何 如 础领军 被323 Q' 泣如 苦苦辑辛苦量t Jif iii? 蠢蠢霍建 幌霹嚼-意营运带功带常被 mwmWF 娘们玲、 4吨踹嘟嘟 gz 蛐腆陆 WUW 丁呀?靠霆 AT 桥附瑟鑫 础啊?哈川如始辨 出阳怨，向川崎稳飞仰饿极制相问时 1·哲、陆 wh 陆W且喃喃曲时 而whMFJ 脚mv 耐甲骨蛐棋协棉被秘份能耐拟 制唆协喻荡制机刷刷也 稍感激烈辩怒素;摄制销路楼、翻黝 囹 ?甚 E 午F I;!;!;: 1:1:1. J;;lqUInN 耳基础蹄l;;lq旧nN 藤耶蹄 时.币。。叶 ]YOOH 。。。 N 世 j量 国的\ i眼 因 重 E 牛在 E ?理 。N N 图 唰毒墨瓷器运 ω 时 -m 。。叶 ]YOOH 。。。 N 第3/3页 PHH 晖'巳剧中提口和制制 MUι 1200 1已。。 1400 10∞ 600 400 200 8回 图 。 附 书明说 200910044965.X 1400 Z口。 。 lélO臼 1200 1000 800 600 400 -200 42 40 38 3选3啤32 30 æ 2量￥都主金18 æ 16 1唔12 11) 8 费4 主 幽200 0 二9:7 ，.，; • 66- Cycle 循环数 图 3 己乡 31白? 97三甲 66 ,... 43 皿 馨我 : 咱昏4 哮'画，吧， 在东 飞 念 志角 20… H…队主 21 图 4 20… 14一 硼替佐米 硼替佐米+地塞米松+阿霉素(简称PAD方案)