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固定化青霉素酰化酶水解青霉素G的研究

2012-10-20 7页 pdf 150KB 43阅读

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固定化青霉素酰化酶水解青霉素G的研究 f 一 g- | 第f4卷 无 锡 轻 工 大 学 学 报 第 2期 JOURNAL OF WUXI UNIVERSITY OF LIGHT INDUSTRY Vo1．14 1995 No．2 一／ 固定化青霉素酰化酶水解青霉素 G的研究 堕 坚 Ken—ichi Suga (无锔轻工大学) (日本大阪大学) 5叼 ，』c
固定化青霉素酰化酶水解青霉素G的研究
f 一 g- | 第f4卷 无 锡 轻 工 大 学 学 报 第 2期 JOURNAL OF WUXI UNIVERSITY OF LIGHT INDUSTRY Vo1．14 1995 No．2 一／ 固定化青霉素酰化酶水解青霉素 G的研究 堕 坚 Ken—ichi Suga (无锔轻工大学) (日本大阪大学) 5叼 ，』c单元
初级会计实务单元训练题天津单元检测卷六年级下册数学单元教学设计框架单元教学设计的基本步骤主题单元教学设计
的⋯。 由于半合成青霉素，如氟基苄青霉素、羟氨苄青霉素等 ，在效力与临床价值上优于青霉素 G 或青霉素 V；也由于青霉素 G(或 V)很容易通过发酵而大量生产[ ，因此 ，近几十年来，有关 青霉素 G水解生产 6-APA 的研究一直是一个热点，而且 6-APA的生产也从化学法、酶法 发展到了目前广泛使用的固定化青霉素酰化酶法(penicillin acylase)．目前全世界发酵生产 青霉素的年产量大约为 15000t，其中大部分被用于酶解生产 6 APA 青霉素是相对不稳定的化台物 ，因此 6 APA会有二聚作用 、多聚作用、口内酰胺环水解 和与 CO 反应等性质 基质和产物的不稳定性、产品的高产率和高质量均要求转化反应高 效和迅速。采用固定化青霉素酰化酶进行青霉素的水解可有效地解决这些 问题 图l为 6 APA的生产过程 ．其中青霉素 G通过发酵得到，酰化酶由微生物生产后进行固定化。在 收穑 日期 ；199 4 1 2 15 匝 堕H至 圈 圉 1 6-APA的工业生产过程 呈一 维普资讯 http://www.cqvip.com 110 无 锡 轻 工 大 学 学 报 第 l4卷第 2期 固定化酶反应器中青霉索 G水躲生成 6-APA和苯乙酸(Phenylacetic acid，简称 PAA)，6一 APA用于半合成青霉素的生产，PAA可作为青霉素 G发酵的前体 。 本文首先研究了固定化青霉素酰化酶的部分性质 ，包括酶的最佳温度、pH，酶的反应动 力学常数，酶的稳定性等，然后探讨了固定化酶反应器中青霉索 G的酶解过程 ，建立了酶解 过程的数学模型，并对此过程进行了计算机模拟和预测 1 实验材料和方法 1．1 固定化青霉素酰化酶 青霉素酰化酶产 自巨大芽孢杆菌 (Bacillus megaterium)13-400．Bacillus megaterium B一400的生长培养基组成为 ：1 蛋 白胨，l 牛肉膏．0．5 NaC1和 0．2 苯乙酸。在 30C下 好氧培养 30h后，酶的提纯步骤为 ：560号硅藻土吸附(pH7．0下)，含 24 硫酸铵的 0．]mol 磷酸缓冲液(pH8．O)洗脱，超滤提纯 固定化裁体为氢化的多孔聚丙烯腈。具体 固定化方法 如前所述rI] 酶活的测定采用以前的方法 。一个单位酶活定义为 34c下，lmin产生 m。I 的 6-APA． 1．2 实验装置 图2为进行青霉素G水解的实验装 勰 置。其中固定化酶反应器采用小型发酵 罐(EYELA，日本理 研株式 会社)，工作 体积 L；固定化酶被置于发酵罐的搅拌 转轴上；反应器中的温 度和 pH 均采 用 PID法控制 1．3 分析方法和化学试剂 2 结果和讨论 2．1 固定化青霉素酰化酶性质研究 青霉索酰化酶生产菌的筛选是以其能否生产具有工业价值的酰化酶为 目标 通常在培 养物被确定后，通过进行改善培养基和发酵过程条件、采用诱变和筛选方法得到高产菌株这 两方面的工作，可 l0到3O倍地提高酶的生产率。将由此得到的并具有表 1所示性质的青霉 素酰化酶进行固定化 ．可用于青霉素酶解的工业过程 0。 维普资讯 http://www.cqvip.com 陈 坚等：固定化青霉素酰化酶水解青霉素G的研究 I11 表 1 青霉素融化酶所应具有的性质 高基质维度和高产物维度的耐受力 商基质亲台性和 比{舌性 在操作条件下和长埘贮存时有良好的稳定性 具有最大酶活的 pH 稳定范围较宽且酶活 pH范围和基质、产物 pH稳定范围相近 在高盐浓度和术混培剂中氇定 对变联度和化学修饰试剂稳定 2．1．1 固定化酶的最佳温度和 pH 图 3为 pH对固定化青霉素酰化酶插性的影响情况。 从图中可以看出，在pH 7．2～9．5的范围内，固定化酶能保持最大活性。为了比较，圈中还 给出了对未固定化的青霉素酰化酶的实验测定结果。显然，在固定化前后，青霉素酰化酶的 最佳pH和pH活性曲线相当一致 据报道 ]，在用重氮法固定胰蛋白酶、用溴化氰活化的琼 脂糖 固定核糖核酸酶和用聚丙烯酰胺包埋法固定天冬酶时，也有类似的情况。 图 4为温度对固定化青霉素酰化酶活性的影响情况 。在温度达到 37℃时，固定化酶的 活性最大 同样。图中也给出了温度变化对固定化前的青霉素酰化酶酶活的影响。此 时，最 佳温度为 43~45c．因此，与 pH不同，固定化前后酶的最佳温度发生了迁移。 4 5 6 7 8 9 lO pH 楚 簧 霉 温度 (℃ 围3 pH对酶话性的影响情况 围4 温廑对酶活性的影响情况 △ 固定化酰化醇 口 酰化酶 △ 固定化酰化酶 口 酰化酶 2．1．2 固定化酶的反应速率方程 基于有序单一双(ordered uni_bi)反应机理 ．固定化青霉 素酰化酶反应速率方程可表述为0]： 。一 ) 一 c + c + + + ， 式中 K．——米氏常数(mmo1) K ——反应方程中平衡常数(retoo1) K —— 6-APA抑制系数(retoo1) 维普资讯 http://www.cqvip.com 112 无 锡 轻 工 大 学 学 报 第 14卷第 2期 K —— PAA抑制系数(retoo1) r——反应速度(mmole／min·g) 在控制基质转化率为 j ～1O 的情况下，上式可简化为 ： r= ㈨ ： ‘ ) 即 1一 ×忐 + 采用微分型反应器，实验首先确定传质阻力不起显著作用的液体流速(量)范围，结果如 图 5所示。显然 ．在流量大于 0．5L／h的条件下，可不考虑传质阻力问题。 在微分型反应器的稳态条件下，反应速率可用下式表示 ： r ： F — — (C — o i -- — 一 C．) (3) 式中 F—— 流速(ml／min) E—— 固定化酶量(g) C。——反应器进口浓度(mmo1) C —— 反应器 出 口浓度 (retoo1) 曹 ’’ o． o． E 。- l o 0 0．00 o 20 o．40 0．60 0．80 】 00 I．20 】 40 流量 (1／h1 圉 5 不同流量下酶的反应速率 圉 6 动力学常数 和 ．的确定 因此，在一定的E和F下，通过测定不同C。和c得到的实验结果如图6．对图中数据进行 线形 回归得到： 表2 反应速率方程中的有关参数值 ÷ 814忐 +l_。75 即 V 一0．930，K = 3+55．表 2给出了固定 化酶反应速率方程中本实验和以前研究。。 所 得到的参数值。 K 3 55(nmm1) m 115 1(mino r) ，u 17．6(nmm1) K 78268(mmo[) Vm 0 930(mmoi／min·g一 — ’ ) 2．1．3 固定化酶的稳定性 稳定性问题是关系到固化酶能否实际应用的大问题。例如，酶 和普通化学催化剂一样．温度越高，反应速率越快。但是．酶是由蛋白质组成的，一般对热不 稳定 ，不能在高温条件下进行反应。如果将酶固定化后，其耐热性能有所提高，无疑对酶的应 用极为有利。实际上 ，在大多数情况下，酶经固定化后其稳定性都有所增加。 维普资讯 http://www.cqvip.com 陈 坚等：固定化青霉素酰化酶水解青霉索 G的研究 】]3 1) 固定化酶的热定性 将酶在不同温度下置于pH7．5的 buffer中 2h，然后测定酶 的活性 ，结果如图 7所示。在 48c以下，固定化前后酶的耐热性一样；在温度超过 48c后，固 定化后酶的稳定性要优于未固定化的酶。 2) pH对酶稳定性的影响 将酶在 37℃下，置于不同 pH的 buffer中 30min，然后测 定酶的活性 ，结果如图 8所示。显然，固定化后酶的 pH稳定性较好。 蝗 智 霉 ￡ 蝗 眢 霉 温 度 (℃ ) pl-I 囤 7 嗣定化酶的热稳定性 囤 8 pH对酶热稳定性的影响 △ 固定化酰化酶 口 酰化率 △ 固定化酰化酶 口 酰化率 2．2 固定化酶反应器水解青霉素 G的研究 2．2．1 青霉素 G的酶解过程和数学模型 表 3为青霉素 G的酶解条件 图 9为青霉素G 的酶解过程曲线。采用 pH—star法控制固定化酶反应器中的 pH值，对 PenG、6-APA和 PAA作物料衡算，可得到如下方程： V = 一 rE (4) d 。 V ： rE (4) d 。。 V dCpAA — rE (4) d 、’ 根据表 3的实验条件 ，用 Runge-Kutta—Gill(RKG)法计算机求解上述方程，得到的计算结果 也在图 9上标出。从图可 看出，计算值和实验值非常吻合，由此说明所采用的模型和模型 参数正确、合理 表 3 青霉素 G的酶解条件 2．2．2 青霉素 G酶解过程的计算机模拟 青霉素 G酶水解反应(图 10)的特性是 ：1)酶解 反应受其产物 PAA的竞争性抑制和 6-APA 的非竞争性抑制 ；2)酶解反应降低 pH，由此产 生的酸环境造成青霉素 G和 6-APA 的内酰胺环不稳定。因此，从青霉素G水解反应混合液 中连续地去除苯乙酸是非常重要和令人感兴趣的 根据上述数学模型，如果固定化酶反应器 与另一设备相连以连续地去除 PAA，方程(6)将改为方程(7)： dt 一 VE一生Vc (7) 一 ⋯ 、●， 维普资讯 http://www.cqvip.com 114 无 锡 轻 工 大 学 学 报 第 l4卷第 2期 E E 髓 蠼 舢 链 。 时间 (min) 圉 9 青霉素 G的酶解过程曲线 0 口实验值 ——计算值 penlcillin aeyla~ (6一APA) (PAA) 圉 l0 青霉素 G的酶水解反应 式中：F=PAA被去除部分的流速 。 在不同的 F下，由方程(4)、(5)和(7)用计算机对青霉素 G酶解过程进行模拟，得到图 11·显然， 增大，即单位时间内PAA被去除的量增加，酶解反应效率提高。如果以达到 95 青霉素 G转化所需的时间为目标，刚不同 F下酶解所需的时间如表 4所示。 E E V 崔 时间(min) 圉 ¨ 青霉素 G酶解过程的计算机模拟 衰 4 不同 F下计算机计算得到的 95 青霉素 G的转化时间 *计算兼件同表 4 因此 ，将固定化酶反应器与其它设备相 连去除 PAA可能是有效地提高青孽素 G酶 解效率的重要途径。后续的实验研究也充分 证明了这一点。 维普资讯 http://www.cqvip.com 陈 坚等 ：固定化青霉素酰化酶水解青霉索 G的研究 115 参 考 文 献 DaI-id ．^ f．．~mmb1]ized ben lac~m acyla~e． 1nf~ ]opment jD 捌 usrr l M icrObiology． i989．30：121～ l30 Nayler J H．Triend ia Bieehem．Sci．1991，16(5)：195～ 197 Shewale J G．Siva~man H．Process Blochen1 1989，24：146～ 154 Ishimu~ F，Seijo H J．Ferment．Bioeag．1991，71：140～143 Ishknmra F，Suga K．Biotechao1．Bioeng． 1992，39：171～ 175 千西一郎著．胡宝花等译．固定化酶 ．河北人民出版杜 ．1981 Suga K．Shiba Y，Sorai T，Shioya S．ec a1．Ana．NY Acad．Sci． 1991．613：808～815 Che n J．OmasaT ．KatakuraY．Shioya S，t c a1．Proc．of 27thAu cunlnConference 0f SocietyofChenfical Engineering of Japaa 1994．196 Hydrolysis of Penicillin G by Immobilized Penicillin Acylase Chen Jian Ken—ichi Suga ’ (Wuxi University of Light Industry) (Osaka University，Japan) Abstract The properties of immobilized penicillin acylase，such as optimal temperature． optimal pH ．reaction kinetics and stability of the enzyme were studied．Based on the anal— yses of PenG hydrolysis in an immobilized enzym e reactor，a mathematical model of PenG hydrolysis was developed．Computer simulation and prediction of the process were carried out． Subject—
word
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s Penicillin；Enzyme hydrolysis{Property／Penicillin aeylase；Penicillin hydrolysis ． ‘ ； 7 8 维普资讯 http://www.cqvip.com
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