应用OPA柱前衍生法测定食品中的牛磺酸

一 《食品与发酵工业》 Food and Fermentation Industfies 7． 应用OPA柱前衍生法测定食品中的牛磺酸 任一平 黄百芬 胡红伟 蟊工面 州，310009) 摘 要 本文研究了采用 OPA柱前衍生硅测定食品审的牛磺酸。样品经粉碎、振荡、离心等 前处理t通过 ODS018柱进行衍生和分离。柱前衍生荆为台有 0 5gOPA和 5nil n蔬基乙醇 的 O．2tool／L(pH9．5)硼酸缓冲液。流动相为 55％的 0．05mol／L乙酸钠溶液和 4s 的甲醇。荧 光检测器波长为：Ex：335nm和EM：455nm。食品中牛磺酸浓度在 5~g／100g范围内能够技定量 捌定 。回收 率 为 99．63～100．01 ．变异 系数(cv]为 1．38 。 关蕾词 柱前衍生t邻苯二 甲醛t牛磺酸 牛磺酸又称 氨基乙磺酸，其分子式为 CcH~ S。牛磺酸是新生儿和早产儿生长发 育过程中的必须 营养素之一，它具有促进人 体大脑发育的作用，对视网膜、视锥细胞、视 杆细胞等均有保护作用。目前它已被作为一 种新型营养强化剂添加在最新研制的第二代 母乳化奶粉及其他各类儿童营养食品中。在 食品中一般的添加量为 2O～40／100g。 目前测定食品中牛磺酸含量的方法只有 柱后衍生离子色谱法：样品经预处理，在阳离 子交换柱中被分离，再与邻苯二甲醛(OPA) 进行柱后衍生反应．由荧光检测器检测定量， 该方法具有灵敏度高、定量准确等优点，但是 分离需使用的是钠离子交换柱，该柱子价格 昂贵，这给测定方法的推广应用带来了困难。 我们应用柱前衍生反相色谱法测定食品中的 牛磺酸，获得了良好的结果。样品经简单的预 处理后，按比例加入定量的 OPA衍生反应试 剂，在碱性条件下与样液中的牛磺酸生成具 有强荧光的物质，在开始衍生反应一分钟后， 立即终止反应，通过 ODS C-1 8反相柱分离， 在荧光下检测定量。实验结果证明，柱前衍生 蕴熊 反相色谱法测定食品中的牛磺酸具有前处理 简单、操作方便、检测灵敏度高等特点，只需 在一般的 HPLC仪器上使用普通的反相柱就 可进行牛磺酸的测定。 材 料 与 方 法 一 、 试剂 1 一般试剂 甲酵 HPLC级 偏磷酸 CP级 邻苯二甲醛(OPA) 进 口分装 a巯基乙醇 进 口分装 乙酸钠 AR级 冰乙酸 AR级 磷酸二氢钾 AR级 硼酸 AR级 牛磺酸 纯度>99 2．样品提取液 1 偏磷酸溶液：称取 10g偏磷酸，加入 980nd水，加热溶解，待冷却后用水定溶 至 43 维普资讯 http://www.cqvip.com 《食品与发酵工业》 Food and Fe~ tafion Industries 1000ml。 3．流动相 0．05mol／L乙酸钠溶液 (vH--6．O)：甲 醇一55：45 (1)称取 4．1015g乙酸钠溶于 980ml水 中，用冰 乙酸 调节 pH至 6．0，加水定容 至 lO00ml后，用 0．45f~m的微孔滤膜过滤。 (2)流动相 ：按 55 的 0．05mol／L乙酸 钠溶液和 45％的甲醇比例配制。 4．柱前衍生试剂 (1)0．2mol／L pH一9．5的硼酸缓冲液： 称取 1．237g硼 酸，溶于 80ml水中，溶解后 加水至 100ml，用 0．3／．ml滤膜过滤。 (2)OPA反应试剂：称取 0．5g邻苯二甲 醛，溶于 1 0Tjd水 中，再 加入 5ml二巯基 乙 醇，用 0．2rr~l／L的 硼 酸 缓 冲 液 定 容 至 lOOml。放人冰箱中保存。在使用过程中，每隔 二天加入 0．5ml的二巯基 乙醇。 (3)0．1mol／L磷酸二氢钾反应 终止液： 称取 2．04g磷 酸二氢钾，加 水至 200ml，用 0．3}∞ 滤膜过滤。 5．标准样液 精确 称取牛磺酸 0．1OOg，用水定容 至 10Cml，再分 别 吸 取 1、2、3、4、5rnl于 5个 100ml容 量瓶中，分别用水定容 至刻度，用 0．3bwn滤膜过滤。 二、仪器设备 1．BACKMAN SYSTEM GOLD高效液相 色谱 仪 (带 AST 486计算机和 126溶剂泵 等 )。 2．RF-540荧光检测器(带 9 流动池)。 3．分离柱 ：ALTEX ULTRASPHE ODS C- 18 5肿 4．6× 250mm 4．BACKMAN U7 离 心 机 5000～ 10000rpm 。 5．超声波振荡器 6．pH计 。 7．溶剂微孔过滤器。 8．10 ，20 ，40 微量移液管。 9．常规玻璃仪器 44 三、样品预处理 1．称样 精确称取样品(已粉碎)5～lOg(在称样 中牛磺酸 的含量不少于 5愕)，用 1 的偏磷 酸溶液溶解样品，并移人 100ml容量瓶 中， 定答至刻度。 2．提取 将容量瓶充分摇动后，放人超声波振荡 器中振荡 10～15mln。 3．离心 取 60ml经振荡的样液在 5000rpm条件 下离心 2O～30min。 4．过滤 用 0．3bwn微孔滤膜过滤，丢弃前 lml滤 液后，接取 2ml供衍生反应用。 四、柱前反应 用微 量移液管吸取 20 样液于 1．5ml 离心管中，再用另一支移液管吸取 20plOPA 反应试剂，并及时准确记时 lmin(衍生反应 时间)，lrr~n后立即加入 40 磷酸二氢钾溶 液终止衍生反应，吸取 50 反应液进样(实 际进样量为 2o~1)。 五、色谱分离条件 流 速： Iml／min 进 样 量 20# 检测波长j EX：355nm，EMI 455nm 柱 温 ： 室温 六、计算公式 牛磺酸(rr loDg)； 等 式中：c——色谱仪测定的含量(飕／m1)； V——样品稀释的倍数 ； w——称取样品的重量(g)。 结 果 与 讨 论 一 、衍生反应和色谱分离条件 1．最佳检测波长的选择 取 5ml浓度为 Z~g／ml的牛磺酸标准溶 液，与 5ml的 OPA衍生反应液混合 lmin，再 维普资讯 http://www.cqvip.com 《食品与发酵工业》 Food atId Fermentation Indusuies 用 lOm[的磷酸二氢钾终止反应液。将此溶 液放人荧光分光光度计中进行发射波长和激 发波长的扫描。扫描结果见图 1。 图 l a．既 的荧 光扫描 谴长 蓝缱 b．EM 的荧光扫描 波长 曲线 的 OPA衍生物的 EX、ⅡⅡ波长值基本一致。 因此，对 牛磺 酸 检 测 采 用 的波 长 为 EX： 335nm ，EM ：455nm 。 2．流动相配比的选择 流动相中乙酸钠溶液和甲醇的配制比例 对牛磺酸的出峰时间和分离效果均有直接影 响。分别配制不同比例的流动相，进行牛磺酸 标准样液和实际样品的色谱分离试验。表 l 是牛磺酸在不同配比的流动相 中与分离保留 时间的关系，图 2a和 b分别是标准和样品 的分离色谱图。 由表 I可知，随着流动相 中的甲醇比例 的减少，牛磺酸的出峰时间明显推迟，这一比 例的最终确定应在样品分离时，使 牛磺酸能 与其相邻的杂质蜂完全分离为首要考虑因 素。其次，应设法使分离时间缩至最短，图 2 是较为理想的分离结果。所使用流动相中的 比例是：甲醇45，乙酸钠溶液 55，牛磺酸的出 其 中的最大 吸收波长分别是 Ex：335· 峰时间是 8 ． 41rnin左右，此时牛磺酸 与左右 8rim，EM：455·6nm。此波长值与其他氨基酸 的杂质完全分离 。 表 1 不同配比的谴动相与牛磺酸出峰保留时阃的关系 甲醇 ，50ram 乙酸 钠 70l 30 60 40 50{50 45{55 40：60 牛磺 酸 出峰 时I甸(叫n) 3．77 4．51 6．00 8．41 l2．12 图 2 a．标准牛磺酸的丹离色谱图 b，食品榉品中牛磺酸的分离色谱臣 3．衍生反应时间的选择 衍生反应时 间的长短对牛磺酸与 OPA 反应的程度有着直接的关系。时间过短会使 反应不彻底，过长又会使 OPA生物迅速破 坏，这都将会影响检测结果的准确性，或者直 接影响检测结果的重现性。因此，准确地控制 衍生反应时间是整个测定的关键。 在其它条件不改变的情况下准确吸取浓 度为 50~／ml的牛磺 酸标准样液与 OPA反 应液进行不同时问的反应，然后通过柱分离 测定其出峰面积。试验结果见 图3。 由图 3可见，衍生反应时问在 lmin的 出峰面积为最大，其检测灵敏度为最高。随着 时间的加长有所减少。因此，衍生反应时间应 控制在 lmin。 45 二=] 维普资讯 http://www.cqvip.com 《食品与发酵工业》 Food and Fermentation Industries 图 3 牛 磺酸 与 OPA衙 生反应时 间与 出峰 面积 的关 系 二、检测浓度的线性 分别配制浓度为 10．0、20、0、30．0、40． 0、50．0~g／m；的牛磺酸标准溶液，经衍生反 应后进样 20 ，根据出峰高度与进样浓度绘 制 曲线 图(图4) c(ug／m1) 4 牛 磺酸 的标准 曲线图 曲线表明，浓度 lo～50ta／ml的范 围内 线性 良好，经计算 ，其相关系数为0．9992。根 据低浓度检测结果表明；其最低检测浓度可 到 lta／m；以下，这完全可以满足低含量样 品 的检测。 三、方法的精密度和准确度测定 1．回收率测定 46 采用液体样品一新4,JL喜食糖浆为试验 样品，在 1 样液中精确加人标准牛磺 酸 400ttg，按规定进行预处理、衍生反应和进样 测定，测得结果见表 2。 表 2 方法的回收率测定 平 行 回收 率 A B B — A C 样 品号 ( ) l 28．45 68．3O 39．85 40．OO 99．63 2 28．48 68．49 40．01 40．00 100．0o 3 28．51 68．56 40．05 40．00 100．01 注 ：表中 A是样品 中的含量，B是样 品+标准 的含 量 ，B—A是 加^标准 的实捌 含量 ，C是加 ^样 品 中的 标准 实际含 量。 以上浓度单位 均为 飕／ 。 在上述试验中，三次回收率的平均值为 99．88％，由此可见，牛磺酸在测定过程中几 乎没有造成损失。 2．精密度测定 精确吸取一新小儿喜食糖浆样液 6份， 按本法进行测定，所得结果见表 3。 六次测定结果经计算证 明：使用本方法 测定食品中的牛磺酸，具有较好的重现性 ，其 变异系数为 1．38 。 表 3 方法的精密度 定 测定次数 1 2 3 4 5 6 测定 量 23．01 23．01 23．56 21．35 22 86 22．5( ：nag／1O0g) X 22．75 SD 0．31 5 3．准确度测定 表 4测定结果表明，采用柱前衍生法(反 相色谱法)和柱后衍生法(离子交换法)测定 同一样品的结果数据几乎完全一致，说明本 法测定结果准确可靠。 维普资讯 http://www.cqvip.com 4 一 《食品与发酵工业》 Food and Fem眦 诅60n Industries 衰 4 柱前衍生法与柱后衍生法的结果比较 测定方法 柱后衍生法 柱前衍生法 口目臣糖浆 30．20 30．75 样 ( ma／]oo宴) 品 母乳 化奶粉 35．45 35．34 (mg／]oog) 四、对样品的测定 选定杭州食品厂生产的第二代母乳化奶 粉不同生产期的五个批次的样品进行检测， 结果见表 5。应用该法对各类食品进行测定． 结果见表 6。 衰s 五批次母乳化奶册中牛曩童舅定的音量 测定批次 l 92030101 l 92030302 l 92030401 l 92030401 l 92030403 测定量 (mg／lOOmg) 34．67 34．45 30．31 35．76 33．14 衰6 备种样品的牛膏睦测定台量 序 测定台量 号 样品 名称 ( rag／10og) 1 力达营养丸 273．1 2 贻 贝营养 液 883．o 3 金 牡蛎 8956．o 4 强力神儿童营养液 64．4 5 力多精婴儿奶粉 43．0 碰 蕾 图 5 a．一新喜食糖浆分离色谱图 h第二代母乳化奶粉分离色谱图 由表 5，6中的测定结果和图 5a和 b可 见，柱前衍生法测定各类食品中的牛磺酸具 有较广泛的适应性。 结 论 一 、样品称量后 ，用 1 的偏磷酸溶菠定 容，在超声波振荡器 中振荡提取 10～15rain 后，又经离心、过滤的前处理过程具有简单、 方便、快速等优点。 二、经提取的样液与OPA衍生试剂混台 反应，然后在规定的时间内迅速加入反应试 剂，终止柱前衍生。这一操作是保证甥I定结果 具有 良好重现性的关键步骤之一 ，操作者必 须熟练地掌握，才能保证数据的准确性。 三、本法采用 ODS C-18反相色谱柱，比 例为 55：45的 0．05tool／L的乙 酸钠溶液 (pH=6．0)和 甲醇为流动相 ，在 EX；335nm 和 EM；455nm荧光波长下检测各类食 品中 的牛磺酸。该色谱分离条件具有分离时间短， 分离效果好，灵敏度高等优点。 四、经过对上述整个方法的回收率和重 现性试验和实样含量测定，以及与现行 方法 比较，其实验结果表明：该方法重现性 良好， 回收率达 99．89 ，在 1O～50 的浓度范围 内具有良好的线性。 综合上述，采用柱前衍生反相色谱法测 定各类食品中的牛磺酸是一个十分理想并易 47 碰 ．．．， 维普资讯 http://www.cqvip.com 《食 品与发酵工业》 Food and Fermentation Industries 1995 No．1 于推广的的决定方法。 参考文献 [1]B c^船讧AN~ 113GRAM VOL 9，NO． 1 [z]徐巧娣，沈冬莲等；tail对I-IPLC(OPA法)测 定 氨基酸的影响》，第六 次全国色谱学术会文 集 ，1987，7，10，393—374 Alaplication of Pt~Coluam Derivati蚰 to the Indenlitieation of Tautdne in Food Ren Yiping Huang Baifen Flu Hongwei (zbejaang Ught Industry Institute，Hangzhon ，310009) A rKA‘ 。 Ameth~ foridentificafion oftaurineinloads6yPre一 ulllriDerivafic~isdescribed． le强n∞le is pretreated simply through shivering，oscillating，centrifuging．derivation and separated 6y ODS C-18 column．The Pre—Column Derivation reagent is 0．5g OPA and 5ml口一n】 rcapt0et in lOOml 0． 2mo l／L b( c acidbuffer solufionCoH=9．5)．m mobile phase is 55 0．05 mo l／L sodJulll acetate and 45 methano1． le fluorescence detector wavelength is EX：335ran and EM ：455nm． 5~g／100g taurine in food can be completely ide ntified quantitativdy．m recovery is from 99．63 tO 100．01 ． Coefficient of vaIiation(LW )is 1．38 ． Kaw wⅢ凼 Pre-Colunm Derivation ，OPA．Taurin~ 维普资讯 http://www.cqvip.com