双重实时逆转录聚合酶链反应检测甲型和乙型流感病毒

[作者简介 ]　俞骅 ( 1978 - ) ,男 ,大学本科 ,技师 ,主要从事微生 物检验研究。3 通讯联系人 【论著 】 双重实时逆转录聚合酶链反应检测甲型和乙型流感病毒 俞骅 , 叶榕 , 闻洪根 , 潘劲草 3 (杭州市疾病预防控制中心微生物检验科 ,杭州 　310006) [摘要 ]　目的 :建立双重实时荧光 RT - PCR方法 (DqRT - PCR)以检测甲、乙型流感病毒。方法 :设计甲、乙型流感病毒 M基因的特异性引物及双标记探针 ,优化反应条件 ,建立双重实时荧光 RT - PCR方法 (DqRT - PCR)。设计甲型流感病 毒 HA1、HA3亚型的 H1、H3、N1、N2基因的特异性引物 ,建立双重普通 RT - PCR (DRT - PCR)方法。对 HA1、HA3和 B 型细胞分离株进行 DqRT - PCR和 DRT - PCR检测。对 80份发热病人咽拭子标本进行 DqRT - PCR和 DRT - PCR检测 及细胞培养分离病毒。结果 : DqRT - PCR检测甲型和乙型靶 DNA片段 (重组质粒 ) 最低极限为 1 ×103 拷贝。DqRT - PCR和 DRT - PCR对 11株 H1N1、16株 H3N2和 12株乙型细胞分离株检测 ,符合率 100%。DqRT - PCR、DRT - PCR和 细胞培养分离病毒对 80份咽拭子标本的阳性率分别为 : 3715% (30 /80)、3010% (24 /80)和 4318% (35 /80) ,检出率差异 未见统计学意义 (χ2 = 515, P > 0105)。与细胞培养分离病毒法比较 , DqRT - PCR的阳性和阴性总符合率为 7317% (59 / 80) ,阳性预测值为 6219% (22 /35) ,阴性预测值为 8819% (40 /45) ;经配对χ2 检验 ,差异无统计学意义 (χ2 = 0176, P > 0105)。结论 :建立 DqRT - PCR可应用于甲型和乙型流感的检测 ,以多种检测方法互补将有助于提高临床标本的病毒检 出率。 [关键词 ]　流行性感冒病毒 ;实时逆转录 PCR;逆转录 PCR [中图分类号 ]　R37311 + 3　　　　[文献标识码 ]　A　　　　[文章编号 ]　1004 - 8685 (2008) 02 - 0219 - 04 D evelopm en t of a duplex rea l tim e RT - PCR to detect influenza v irus A and B Yu Hua, Ye Rong, W en Hong2Geng, Pan J ing2Cao3 (Hangzhou Center for D isease Control and Prevention, Hangzhou 310006, China) [ Abstract] 　O bjective: To develop a dup lex real time RT - PCR (DqRT - PCR) to detect influenza virus A and B1M ethods: M gene - specific p rimers and p robes for the DqRT - PCR to detect influenza virus A and B were designed and their reaction con2 dition was op tim ized1Two conventional dup lex RT - PCR (DRT - PCR) for H1 /N1 and H3 /N2, respectively, were also devel2 oped to detect H1, N1, H3 and N2 genes1DqRT - PCR and DRT - PCR were used to detect influenza virus H1N1, H3N2 or B strains isolated by cell culture p reviously1Eighty throat swab specimens from fever patients were collected to exam ine influenza vi2 rus using the DqRT - PCR, the two DRT - PCR s and cell culture1Results: The detect lim it of the DqRT - PCR for influenza A and B was 1 ×103 cop ies1The detection results of the DqRT - PCR and the DRT - PCR in 11 H1N1 strains, 16 H3N2 strains and B strains were consistant with the ones identified p reviously by hemagglutination inhibition tests1The positive rates of the DqRT - PCR, the DRT - PCR and cell culture were 3715% (30 /80) , 3010% (24 /80) and 4318% ( 35 /80) , respectively1The positive and negative sim ilarity rate between the DqRT - PCR and cell culture was 7317% (59 /80) 1There was no statistic difference (χ2 = 0176, P > 0105) 1The positive and negative p rediction values of the DqRT - PCR were 6219% (22 /35) and 8819% (40 /45) , respectively1Conclusion: The DqRT - PCR could be app lied in detection of influenza virus A and B1 Integration of various meth2 ods may imp rove detection rate of influenza virus in clinical specimens1 [ Key words] 　 Influenza; Real time RT - PCR; RT - PCR 　　RT - PCR技术作为一种高度灵敏、快速简便的检测方法 , 已经在流行性感冒病毒 (简称流感病毒 )的实验室诊断中得到 应用。基于 M蛋白和 NP蛋白的抗原性和序列 ,流感病毒分为 甲、乙、丙三型 [ 1 ]。目前引起流行的是甲型和乙型流感病毒 , 甲型中的 H1N1、H3N2亚型是人的主要流行株。国内外检测 流感的 RT - PCR方法主要有 :根据相对保守的 M基因设计引 物检测甲、乙型流感病毒 ,其次是根据甲型流感病毒的血凝素 (HA)和神经氨酸酶 (NA)基因序列设计引物检测亚型。 为了能够快速、高效和准确地在疑似流感病人的咽拭子 标本中筛检流感病毒 ,本文对流感病毒的 M、HA、NA基因分别 进行序列分析比对 ,设计了甲、乙型流感病毒 M基因的特异性 引物和探针 ,建立双重实时荧光 RT - PCR方法 (DqRT - PCR) 以检测甲、乙型流感病毒 ;设计了甲型流感病毒 H1N1、H3N2 912中国卫生检验杂志 2008年 2月 第 18卷 第 2期　Chinese Journal of Health Laboratory Technology, Feb 2008; Vol 18　No 2 亚型的 H1、N1、H3、N2基因的特异性引物 ,建立双重普通 RT - PCR (DRT - PCR)方法检测 H1N1和 H3N2亚型。检测结果 与组织细胞培养分离病毒方法进行比较 ,探讨从咽拭子样本 中快速检测甲、乙型流感病毒方法的特异性和敏感性。 1　对象与方法 111　标本来源 ⑴80份咽拭子样本 ,收集自 2004年春季杭州市各医院发 热门诊疑似流感病人 (35人 )以及各县区疾控中心送样 (其中 小学生 11人、中学生 22人和大学生 12人 )。咽拭子采集用无 菌棉签擦拭患者双侧咽扁桃体及咽后壁 ,再将棉签放入预先 加入 3 m l灭菌生理盐水或 Hank′s液的无菌试管中 ,旋紧螺纹 盖 ,立即送实验室低温保存待检。⑵11份甲 1 (H1N1)、16份 甲 3 (H3N2)、12份 B型细胞分离株 ,本实验室分离自 2002年 ～2005年。 112　阳性参照 流感病毒甲 1 ( H1N1 ) 型毒株 (A /杭州 /38 /01 )、甲 3 (H3N2)型毒株 (A /杭州 /03 /00)和 B型毒株 (B /杭州 /50 /02) 为本实验室分离保存 ,并经国家流感中心鉴定确认的病毒分 离株。 113　方法 11311　病毒分离与鉴定 　⑴组织细胞培养 :经双抗 (1%青霉 素、1%链霉素 )处理后的咽拭子标本接种于对数生长期的 MDCK细胞 , 37℃吸附 1～2 h。清洗细胞后 ,加入含 2μg/m l TPCK -胰酶的病毒生长液于细胞培养瓶中。放置 35℃培养 箱培养。每日观察细胞病变情况。当 75% ～100%细胞出现 病变时收获细胞。一周后仍未出现病变细胞 ,收获后经红细 胞凝集试验仍为阴性者 ,继续盲传一 ～二代。⑵红细胞凝集 试验 (HA)及红细胞凝集抑制试验 :按国家流感中心推荐参考 方法操作 ,流感参照抗原和抗血清均由国家流感中心提 供。 11312　病毒 RNA提取 　取振荡混匀后咽拭子样本或细胞培 养液 140μl,按照 Q IAGEN公司的 RNeasy M ini Kit试剂盒说 明书操作 ,最后以 60μl无 RNA酶水收集总 RNA。每份样本 首先进行 DqRT - PCR,同时用 B ioseix公司甲型流感单重实时 荧光试剂盒检测 (B ioselex - A - qRT - PCR )。如果二种 PCR 检测结果提示为甲型流感病毒 ,则进一步用普通 RT - PCR方 法检测甲型流感病毒 M 基因 ,用 DRT - PCR 检测 H1N1和 H3N2亚型的 H1、N1、H3、N2基因。 11313　引物与探针 　应用设计软件 Primer Primer510,依据 Genbank登录的甲型、乙型流感病毒的 M、HA、NA基因序列 , 设计双重实时 PCR检测甲、乙型流感病毒 M基因的两对特异 性引物和二条双标记探针 (表 1) ;甲型和乙型探针 5′端分别标 记 HEX和 FAM报告基团 , 3′端均标记 TAMPA淬灭基团。设 计 H1、H3、N1、N2基因特异性引物 (表 1) ,用于 DRT - PCR检 测。普通 RT - PCR检测甲型流感病毒 M基因引物序列参照 WHO网站公布序列。引物和探针均由上海生工公司合成和 标记。 表 1　D qRT - PCR、RT - PCR及 M RT - PCR引物 名称 序列 3 (5′- 3′) 片断大小( bp) Mgene Am248R GGA TTY TGG ACA AAK CGT CTA C Am119F AGG CWC TCA TGG ART GGC TAA AG 130 PAm221 HEX - AG TCC TCG CTC ACT GGG CAC GGT - TAMRA Bm91R CTG CTT TGC CTT CTC CAT CT Bm11F GGC ACT TTC TTA AAA TGT CGC T 81 PBm36 FAM - TG GAG ACA CAA TTG CCTACC TGC TTT CA - TAMRA M - 1023R 3 3 GAA ACA AGG TAG TTT TTT ACT C 1116 M - W SN - 83 3 GAA GGT AGA TAT TGA AAG ATG NAgene N1 /1336R CAA CTC AGC ACC GTC TGG 282 N1 /1054F TTT GAR ATG ATT TGG GAT C N2 /1062R AGG AGT CRG ART GCG TTT G 382 N2 /677F AAG GCC CAS CCT TTC ACT HAgene H1 /1043R GTT YCT YAG TCC TGT AAC CAT 232 H1 /811F AGG CAA MTG GWA ATC TAA TAG H3 /905R TTG AAA DGG TTTGTC ATT GGG 573 H3 /332F TTA TGC YTC CCT TAG GTC ACT 　　3 : Y = C or T; K = G or T; W =A or T; R = A or G; S = G or C; M = A or C; 3 3 来自 WHO网站 11314　DqRT - PCR　⑴DqRT - PCR:按照 TaKaRa公司 Real - time - RT - PCR 试剂盒操作 , 20μl 反应体积内含引物 Am248R、Am119F、Bm91R和 Bm11F各 014μM、探针 PAm221 和 PBm36各 240 nM。反应条件 : 50℃ 30 m in 逆转录 , 94℃ 2 m in预变性 , 94℃ 20 s、50℃ 20 s、72℃ 30 s采集荧光信号 , 共 45循环。FAM通道检测乙型流感病毒 , JOE通道检测甲型 流感病毒。每次实验均设阳性和空白对照。⑵B ioselex - A - qRT - PCR:按照试剂盒说明书操作 , RNA 5μl、反应液 15μl、 混合酶 012μl,反应程序同上 , FAM通道收集荧光信号。 以上 ⑴和 ⑵结果判定 :调节基线至适宜处 ,各荧光曲线与 基线交叉点的循环数即为循环阈值 (Ct) , F1为最大荧光值。 待检样本的 Ct值 < 35、Fl >空白对照 ,判定为阳性 ;样本的 Ct 值 > 35、Fl值 <空白对照 ,判定为阴性 ;当样本的 Ct < 35、Fl < 空白对照或 Ct > 35、Fl >空白对照判定为可疑 ,判定为可疑的 样本 ,再次重复实验。⑶扩增片断克隆与拷贝数计算 :流感病 毒的阳性参照 A /杭州 /03 /00 和 B /杭州 /50 /02,经 DqRT - PCR扩增后 , PCR产物电泳 ,应用胶回收试剂盒回收目的基因 片断 ,连接反应采用 Promega公司的 pGEM - T Easy克隆试剂 盒。重组后的质粒 (分别 称为 pAPM - T和 pBPM - T)转化预 先制备好的高效感受态 DH5α菌 ,在 X - gal - Amp培养基上 , 挑取单个白色菌落增菌 ,采用质粒提取试剂盒提取质粒。经 紫外仪检测 ,浓度换算成拷贝数 ,梯度稀释成 1 ×102 ～1 ×107 022 中国卫生检验杂志 2008年 2月 第 18卷 第 2期　Chinese Journal of Health Laboratory Technology, Feb 2008; Vol 18　No 2 拷贝 /μl,用于 DqRT - PCR和 B iose - A - qRT - PCR标准曲线 制备。 11315　RT - PCR、DRT - PCR　⑴RT - PCR: TaKaRa公司 One - step - RT - PCR 试剂盒 , 20μl 反应体积含有引物 M - 1023R / M - W SN - 8各 014μmol/L;反应条件 : 50℃ 30 m in逆 转录 , 94℃ 2 m in预变性 ,以 94℃ 30 s、65℃ 20 s( - 118℃ / cy2 cle)、72℃ 15 s进行 10 个循环 ,再以 94℃ 30 s、56℃ 20 s、 72℃ 15 s进行 29循环。扩增产物用 112%琼脂糖电泳 ,凝胶 图像分析仪保存结果。⑵DRT - PCR:检测的反应体系同 RT - PCR,引物 H1 /1043R / H1 /811F / N1 /1336R / N1 /1054F于 同一反应管内扩增 H1和 N1,引物 H3 /905R / H3 /332F / N2 / 1062R / N2 /677F于同一反应管内扩增 H3和 N2,反应条件和 扩增产物处理同 RT - PCR。 11316　主要试剂与仪器 　⑴试剂 :总 RNA提取试剂盒 (Q IA2 GEN公司 ) , Real - time - RT - PCR试剂盒、One - step - RT - PCR试剂盒、Taq酶、dNTP ( TaKaRa公司 ) , B iose - A - qRT - PCR检测试剂盒 (博赛公司惠增 ) , pGEM - T Easy克隆试剂盒 ( Promega公司 ) ,高效感受态制备试剂盒、质粒纯化试剂盒、胶 回收试剂盒、X - gal及 IPTG (上海生工公司 ) ,MDCK细胞株 (国家流感中心 ) ,特异性血清 A1 /沪防 /7 /1999 ( H1N1)、A3 / 闽防 /151 /2000 (H3N2)、B /沪防 /01 - 20 (国家流感中心 )。⑵ 仪器 :实时荧光定量 PCR仪 (RotorGene - 3000) ,梯度 PCR仪 (德国 B iometra公司 ) ,低温高速离心机 (Beckman公司 ) ,紫外 分光光度仪 (B IO - RAD公司 ) ,凝胶图像分析仪 (B IO - RAD 公司 )。恒温细胞培养箱 (日本三洋公司 )。 2　结果 211　DqRT - PCR方法学评价 ⑴探针浓度 :将探针 ( PAm221、PBm36)稀释成 120、240、 360和 480 nM 不同浓度 ,对同一份阳性参照作 DqRT - PCR, 得到 CT值在 14～15之间 , F0 (初始 )值 5～20, F1值在 7～ 2715之间。依据灵敏度、特异性及节省成本的原则 ,选择 200 ～240 nM 探针浓度作为实验浓度。 ⑵甲型、乙型流感病毒最低检测限和标准曲线 : 1 ×107 ～1 ×101 copy的甲型重组质粒 (pAPM - T)、乙型重组质粒 (pBPM - T) DqRT - PCR结果见图 1。最低检测限 1 ×103 copy,与试 剂盒的内质控数量级相同 ,甲型标准曲线为 : Y = - 0125X + 00119, r2 = 0199;乙型标准曲线为 : Y = - 0134X + 12162, r2 = 0198。 图 1　D qRT - PCR检测系列浓度的甲型 ( A)、 乙型 ( B)流感病毒克隆质粒 ⑶阳性毒株检测结果 : A1 (H1N1)型病毒株 A /杭州 /38 / 01、A3 (H3N2)型病毒株 A /杭州 /03 /00、和 B型病毒株 B /杭 州 /50 /02检测结果 , CT值分别为 15、15和 16; F1值分别为 815、815和 615。 212　B ioselex - A - qRT - PCR 将甲型重组质粒 (APM - T)梯度稀释后作标准曲线 , 2 × 105 ～2 ×101 copy的 CT值及 F1值与 DqRT - PCR基本一致 , 最低检测限为 1 ×103 copy。 213　RT - PCR及 DRT - PCR 普通 RT - PCR扩增甲型流感病毒 M 基因目的片断为 1116 bp, DRT - PCR检测流感病毒 HA1亚型的 H1扩增片断 为 232 bp, N1 为 282 bp, HA3 亚型的 H3 为 573 bp, N2 为 382 bp,结果见图 2。 图 2　普通 RT - PCR扩增条带 1 - 7号泳道为扩增 M基因扩增目的条带 ,其片断长度为 1168 bp (1号是阳性对照 , 2 - 5号为阳性样本 , 6号为阴性样本 , 7号为空白 ) ; 8 - 12号泳道为 HA1亚型的 H1和 N1基因扩增目的条带 , H1长度 为 232 bp, N1长度为 282 bp (8 - 10号是双重引物扩增 , 11号用 H1, 12号用 N1扩增 ) ; 13 - 17号 HA3亚型的 H3和 N2基因扩增目的条带 , H3长度为 573 bp, N2长度为 382 bp (13为阴性对照 , 14 - 16为阳性样本 , 17为阳性对照 ) 214　咽拭子标本病毒培养和 RT - PCR检测方法的比较 咽拭子标本的 DqRT - PCR、B ioselex - A - qRT - PCR、RT - PCR (Mgene)、DRT - PCR (H3N2)检测和组织细胞培养分离 病毒的阳性、阴性结果见表 2。表中显示各方法检测结果与细 胞分离结果一致或不一致标本统计数。在 80份标本中 ,各 PCR方法及细胞分离病毒方法结果为阳性的样本 ,经确定均 为 H3N2亚型。B型和 H1N1检测均为阴性 ,不列入表中。 表 2　80份咽拭子 PCR检测方法与细胞培养法结果比较 Culture DqRT - PCR + - B ioselex - A - qRT - PCR + - RT - PCR (M gene) + - MRT - PCR (H3N2) + - + 22 13 22 13 24 11 18 17 - 8 37 9 36 10 35 6 39 DqRT - PCR、B ioselex - A - qRT - PCR、RT - PCR (Mgene)、DRT - PCR (H3N2)和组织细胞培养分离病毒对 80 份咽拭子标本的阳性率分别为 : 3715% ( 30 /80)、3817% ( 31 / 80)、4215% (34 /80)、3010% ( 24 /80)和 4317% ( 35 /80) ;差别 无统计学意义 (χ2 = 3195, P > 0105)。DqRT - PCR、B ioselex - A - qRT - PCR、RT - PCR (M )、DRT - PCR (H3N2)检测和组织 122中国卫生检验杂志 2008年 2月 第 18卷 第 2期　Chinese Journal of Health Laboratory Technology, Feb 2008; Vol 18　No 2 细胞培养分离病毒的阳性和阴性总符合率分别为 7317% (59 / 80)、7215% ( 58 /80)、7317% ( 59 /80)和 7112% ( 57 /80) ;该 4 种 RT - PCR方法对培养阳性预测值分别为 6218% (22 /35)、 6218% (22 /35)、6815% ( 24 /35)和 5114% ( 18 /35) ,阴性预测 值分别为 8212% ( 37 /45)、8010% ( 36 /45)、7717% ( 35 /45)和 8617% (39 /45)。DqRT - PCR和细胞培养分离病毒检测结果 经配对χ2 检验 ,差别无统计学意义 (χ2 = 0176, P > 0105)。4 种 RT - PCR方法之间阳性阴性总符合率 8215% ～9112%。 215　细胞分离株检测结果 11份甲 1 (H1N1)、16份甲 3 (H3N2)、12份 B型细胞分离 株的 DqRT - PCR、DRT - PCR 检测结果与红细胞凝集试验 (HA)及红细胞凝集抑制试验鉴定结果完全一致。 3　讨论 多重 PCR可提高病毒、细菌快速检测的效率。建立一个 多重 PCR方法的设计要保证其灵敏度达到或接近单重 PCR 的水平 ,并尽量避免各个引物对之间的相互干扰 [ 2 ]。多重实 时荧光 PCR方法在不同探针所标记的荧光基团间需要无相互 干扰。本文选择扩增甲、乙型流感病毒 M基因相对保守区 ,分 别标记 FAM和 HEX荧光报告基团 ,由不同荧光通道采集荧光 信号 ,建立 DqRT - PCR快速检测甲、乙型流感病毒的方法。 结果显示 :甲、乙型流感病毒 M基因片断的重组质粒拷贝数的 对数与扩增反应的 Ct值成线性对应关系 ,最低检测限与试剂 盒的内质控一致。 DqRT - PCR检测 80份咽拭子样本 , 30份为甲型流感病 毒阳性 (3715% ) ,与 B ioselex单重甲型试剂盒检出 31份阳性 结果 (3817% )基本一致。与 MDCK细胞培养分离病毒方法检 出 35份阳性结果 (4318% )比较 ,检出率偏低 ,但差别无统计 学意义 (χ2 = 0176,χ2 = 0149, P > 0105)。与细胞培养经典方法 比较 , DqRT - PCR方法的阳性和阴性预测值分别为 6219% (22 /35)和 8212% (37 /45)。标本中分离到病毒是最可靠的阳 性结果 ,然而本文未能培养出病毒的标本中有部分用 RT PCR 方法扩增阳性。鉴于这部分 RT PCR阳性结果绝大部分是在 二种以上方法中均符合 ,故应该被认为是真阳性的结果。由 此我们认为 ,培养法和 RT PCR法间有较高的阳性和阴性符合 率 ,但因某些复杂原因 (如病毒载量低、毒株对细胞的适应与 否等 ) ,部分病毒感染标本可以被培养而不能被 RT PCR扩增 , 而另外部分标本则相反。表明 RT PCR和病毒培养同时使用 , 可提高阳性检出率。 在实际检测工作中 ,应用 RT PCR方法检测样本的流感病 毒时 ,必要时 (如 Ct值在 30以上等 )需用二种以上方法进行 验证。参照 WHO公布的检测甲型流感病毒 M基因的普通 RT - PCR实验 ,在没有实时荧光 PCR仪器情况下 ,也能快速筛检 甲型流感病毒 ,同时也可以与 DqRT - PCR结果相互参照。本 次甲型流感 M基因普通 RT - PCR方法共检出 34份阳性 ,其 阳性符合率 (6815% )与 DqRT - PCR (6218% )比较 ,经统计学 检验差别无统计学意义 (χ2 = 0175, P > 0105)。 对 DqRT - PCR检测提示为甲型流感的标本 ,进一步作 HA1、HA3亚型分型。本实验设计的初衷是将 H1、N1、H3、N2 基因 4对引物置于同一反应体系中 ,一步法完成 MRT - PCR 扩增。但在实验中发现有相互干扰现象。将 H1和 N1合并 , H3和 N2合并 ,解决了相互干扰问题。用 DRT - PCR从本次 80份样本中检出 24份 H3N2亚型 ,与细胞培养法比较 ,其阳 性率偏低 (3010% )。应用 DqRT - PCR、DRT - PCR方法对 11 份甲 1 (H1N1)、16份甲 3 (H3N2)和 12份 B型细胞分离株进 行检测 ,结果符合率为 100%。因此 ,高质量采集咽拭子样本 , 或能通过富集提高病毒浓度 ,将有助于提高检测的敏感性和 特异性。有人将咽拭子等标本经 MDCK短期培养增殖病毒后 再用 PCR法检测 ,结果大大提高了检出率。 当前的流感病毒仍然威胁着人类健康 ,对禽流感 (H5N1) 等高致病性流感病毒防范更是迫在眉捷。建立对流感病毒快 速、敏感、准确的检测方法具有重要意义。多重实时荧光 RT - PCR方法 ,快速 [ 3 ]、简便、省时省力且不易受 PCR产物污染而 成为检测流感病毒的发展方向。 [参考文献 ] [ 1 ] Musa H indiyeh, V irginia Levy, Roberto Azar, et a l1Evaluation of a multip lex real - time reverse transcrip tase PCR assay for detection and differentiation of influenza viruses A and B during the 2001 - 2002 in2 fluenza season in israel[ J ]1J Clin M icrobiol, 2005, 589 - 5951 [ 2 ] 秦智锋 ,吕建强 ,肖性龙 ,等 1禽流感 H5、H7、H9亚型多重实时荧 光 RT - PCR检测方法的建立 [ J ] 1病毒学报 , 2006, 22 ( 3) : 131 - 1361 [ 3 ] Payungporn S, Chutinim itkul S, Chaisingh A, et a l1Single step multi2 p lex real - time RT - PCR for H5N1 influenza A virus detection[ J ]1J V irolMethods, 2006, 131 (2) : 143 - 1471 (收稿日期 : 2007 - 10 - 08) 222 中国卫生检验杂志 2008年 2月 第 18卷 第 2期　Chinese Journal of Health Laboratory Technology, Feb 2008; Vol 18　No 2