亚油酸铂靶向脂质体与癌细胞膜相互作用的电子自旋共振研究

有机化学 YOUJI HUAXUE，1995，15，505～510 研究简报 卜 一 t 亚油酸铂靶向脂质体与癌细胞膜 相互作用的电子自旋共振研究 、／／ 』 剥、玉晴 郝爱民 陕西师范大学实验中心、陕西，西安，7 l0062 (2 中国科学院理论物理所 北京，1000~0) A 卜 摘要：本文用马来酰亚胺 自旋标记(Ms L)技术研究了亚油酸铂靶向脂质体与肿瘤细胞膜的相互作用，以及它 们对 ESR诺 的影响。亚油酸铂靶 向脂质体的存在，使 MSL的乳腺癌细胞膜和 S啪 实体瘤细胞膜的 W 和s的比 值发生了变化，结果咀亚油酸铂可以作用于癌细胞膜影响膜蛋白巯基结合部位，井使癌细胞膜表面蛋白质构象 改变 ． 、 翘 讯 ’ ． 插每摘，铷肫陔 草酸铂⋯是继顺铂(顺 氯氨铂，CDDP)、碳铂 (卡铂)之后开发研 究的新的铂类抗肿瘤化合 物，具有水溶性 高、毒性低、抗瘤普广、疗效显著等特点。被称为第三代铂类抗癌新药[2l3】。鉴 于国内的油酸多相脂质体已应用于临床，国外草酸铂应用于临床后又比顺铂对人体的毒副作用 小。我们将铂与多烯脂肪酸(PUFAS)络台，研究其结果表明，亚油酸铂脂质体比单纯的亚油酸 铂不仅抗癌活性更强而且毒性更小，所以我们认为将对乳腺癌细胞具有识别功能的单克隆抗体插 人铂化多烯脂肪酸(Pt-PUFAS)~多相脂质体中制成亚油酸铂免疫靶向脂质体，一定会大大提高 它对肿瘤组织的特异性杀伤作用，从而为解决肿瘤化疗中药物毒副作用大的问题，研制出新抗癌 药物。 实 验 1 材料： 磷脂酰乙醇胺艘 )·磷脂酰胆碱(PC Eagle细胞培养基均为 Sigma公司产品。胆固醇(CIlo1)为 Baker化学公司产品，Ⅳ—羟基琥珀酰亚胺(NHs)为Swetzland产品，亚油酸铂 自己台成，非离子表面 活性剂，高效分散剂(注射用)，马来酰亚胺OvISL)，其余化学试剂为国产纯。 2 方法 2·l Ⅳ一羟基琥珀酰亚胺棕搁酸脂(NHsP)的制备及检验参照文献l 的方法进行．其反应式如下： ⋯ 一 一 ^ 棕橱 醴 _羟 基 琥 珀 酰 亚 砖 ． 羟 摹 琥 珀 酰 王 胺 棕IliI艟 1994一l0-20收稿，l995_o7_o7修回 国家自然科学基金资助项目(批准号：29542005) 维普资讯 http://www.cqvip.com · 506· 有 机 化 学 1995年 2．2 单克隆抗体 McAb GP-1D 的提取，纯化及检验．按文献 的方法进行。 2．3 Ⅳ一羟基琥珀酰亚胺棕榈蘸脂与抗体McAb GP一1D6的偶联及检验方法参照文献 。偶联物 棕榈酰抗体用双扩散法椅查活性。其反应式如下： (】 一C-- (CH 』一．o r+ H】 1)¨—c—o——_N H —— c )I4— c—0一 NH。Mc Ab 0P—lD NH 一Mc Ab GP．IDi 单 克陲 抗 体 棕 榈皖 抗 体 Ⅳ ． 径 基 琥 珀 酰 亚 胺 ：．4 脂质体的制备 本实验共制备两种脂质体(见表 1)，脂质体 的成分为，PE：PC：Chol(2：l：1)其中抗体与 磷脂，亚油酸铂与磷脂的克分子 比为 l：1000和 1：10，按常规方法将其溶解在乙醚中，旋转蒸 发抽干。然后加人棕榈酰抗体，再加磷酸缓冲液(PBS，pH 7．4)，充 N2，在 6O℃水溶液 中进行水 化，震荡在水浴超声器中，37℃超声 5min×2-中间隔 30min然后把游离药物，未插人脂双层 的抗体用 Bio-GelA-0．5m柱层析分离除去。．亚油酸铂在脂质体内的包裹率为80％左右，脂质体 的制备在无菌条件下进行 表 1 脂质体的组份 Tab．1 Compositions of the polyphase liposomes p'qP：高效 分散剂，PBS：磷酸缓冲涟 2．5 细胞培养及活细胞计数 靶细胞乳腺癌细胞和非靶细胞用含 10％新生牛血清的Eage培养基在 37℃，5％CO2条件下 培养。细胞存活率用染料噻唑 (MTT)染色后计算。MTT在活细胞线粒体脱氢酶作用下发生还原 反应，生成物溶于二甲基亚砜 (DMSO)中时，对 550nm波长有最大吸收，细胞存活率按下式计 算。 细胞存活率(％)=面~丽百 O．丽D550×100％ 2．6 癌细胞的自旋标记 ——一 ， 马来酰亚胺自旋标记化合物为：3一Maleimide-2·2·5·5一tetrameth},l一— J< {! l-pyrrolidinyloxyl(美国SyVa公司产品)，结构式是： ． 。 。 维普资讯 http://www.cqvip.com 第 5川_ 亚油酸铂靶 向脂质体与癌细胞膜相互作用的电子 自旋共振研究 。507。 称取适量的自旋标物，用少量无水乙醇溶解，用磷酸缓冲液(pH 7．4)稀释到 10-~mol／L 取培养 7天的小鼠乳腺癌细胞，离心弃培养基，以含 0．15mol／L NaCI的 5 PBS(5mmol／ L磷酸缓冲液，pH 7．4)洗涤两次，与马来酰亚胺 自旋标化合物(MSL)混合，以 5 PBS(宙 0．15tool ／L NaCI)稀释，最终细胞计数为 2×l0 个 ／mL，马来酰亚胺 自旋标记化合物(MsL)浓度 1．5O ×10-3mol／ L。 摘取接种 7天的小 鼠 s㈨ 瘤块，用 0 15mol／L NaCI洗去血迹，滤纸吸干，称重，匀浆 按 lmL／0．1g量加人 O．3mol／L盐酸一5O％乙醇溶液抽提，抽提液经 4000r／min，15min离心， 取上清液，然后在上清液 中加人马来酰亚胺 自旋标记化合物(MSL)，用含 0．15mol／L NaC1的 5 PBS稀释至最终细胞数 为 6．6×10 个／mL，马来酰亚胺 自旋标记 化合物(MsL)浓度 1 50× lO-3m01／L。 上述细胞与马来酰亚胺 自旋标记 化合物(MSL)的混悬液在 37℃温育 2h，然后以等量 的 5 PBS洗涤 3次(3000r／min离心) 2．7 亚油酸铂与马来酰亚胺 自旋标记化合物(MSL)标记的癌细胞作用 在标记好的癌细胞中加入不同体积的亚油酸铂溶液(等量 5 PBS配制)，室温反应 15h。 2．8 ESR渡谱测定 将 癌细 胞 吸人 石 英毛 细 管 中用 ESR 300顺磁 共 振 仪 (Bruker公 司)测量 ， 中心 磁 场 336 0roT，扫场范围± 10mT，频率为 x波段，微波功率 20mW，调制频率 100KHz，调制振幅 0．1mT。 结果与讨论 1 马来酰亚胺自旋标记化台物(nsL)标记癌细胞的F_SR谱和 W／S值 0 1．1 马来酰亚胺 自旋标记化合物(MSL)标记癌细胞的 ESR谱 图 1 MSL标记乳腺癌细胞的 ESR谱 Fig．1 ESR spec ,trallme of breast cancercells labeled withM SL _ {1)乳腺癌细胞：{2)乳腺癌细胞+亚油酸锖(浓度 】．11， 2．22，3 33，4．44，5．55×1O1ltool t L一 ) 图 2 MSL插i己 ∞实体瘸细胞的 ESR谱 Fjg．2 ESR spectralline of Sl80 cancercells la· beled with M SL f1)Siso实体瘤细胞；(2)Sis0实体瘤细胞 哑 油酸铂 糯 度 l：I1，2．22；333．4．,t4，5．55×t_O-* tool·L一’) 0 3 4 5 6 维普资讯 http://www.cqvip.com ·508· 有 机 化 学 1995年 由图 1和 2可见，马来酰亚胺 自旋标记化合物(MSL)的 ESR 谱是由弱固定化作用和 强固 定化作用两种波谱的叠加而成，表明在乳腺癌细胞膜和 s 实体瘤细胞膜上都存在处于相同环 境的两种琉基，即膜蛋白表面巯基和膜蛋白深层巯基，而且马来酰亚胺 自旋标记化合物(MSL)可 以与这两种巯基结合。 6 ； 日 一 ＼ - ； ， t ’ ＼ 重 {由-帕 i盘虞 图 3 亚油酸铂对 MSL标记癌细胞 ESR谱的 W／S值影响 Fig．3 The relation between A W ／S and of concentration of linoleic platinum ·MSL标记乳腺癌细胞的 AW／S，▲ MSL标记 Sm 实体瘤细胞的 AW ／S 1．2 马来酰亚胺自旋标记化台物(MsL)标记癌细胞的w／s值 由马来酰亚胺 自旋标记化合物(MSL)标记癌细胞的 EsR谱计算 w ／s值以及亚油酸铂存在 下的 w ／s值列表如下。 袁2 马来酰亚胺真旋标记化台物标记癌细胞的W／S值 Tab．2 W ／S value ofcancer cell labeled with 3-M aleimide-2⋯2 5 5一 tetramethyl—。l— pyrrolidinyloxyl 亚油酸铂浓度 马来酰亚胺 自旋标记化台物 马来酰亚胺自旋标记化合物 标记乳腺癌细胞 标记 s 实体瘤细胞 ( ×10一 tool／L) W ／S ／S W ／S △W ／S 0 3．50 0 3 63 0 1．11 l 93 -1．57 l 95 一l 68 2．22 l 79 —1．7l 1．86 一l 7 3 33 1．6 —1．82 1．74 —1．89 4．44 1．56 -1．94 l 69 一l 94 _ 5．55 1．45 —2．05 1．53 _2．10 l 以 ESR谱参数的改变量 △w／s对亚油酸铂浓度作图。由图 3可见亚油酸铂使马来酰亚胺 自旋 标记化合物(MSL)标记的乳腺癌细胞和sm实体瘤细胞的w／s值降低 说明亚油酸铂的影响导 致了马来酰亚胺 自旋标记化合物(MSL)标记物在癌细胞膜蛋白上强固定化作用增加，而弱固定化 作用减弱。这一现象表明亚油酸铂与癌细胞膜发生相互作用影响了细胞膜蛋白的构象。 2 用 ESR研究亚油酸铂与癌细胞膜相互作用的基本原理及实验结果分析 细胞膜蛋白上的疏基有两种结合位置，这已被自旋标记方法和其它方法所证明 “J。当标 记物与蛋白质或细胞膜结台 寸，由分子旋转受到阻碍而使其ESR谱线变化。马来酰亚胺自旋标 维普资讯 http://www.cqvip.com 第5期 亚油酸铂靶向脂质体与癌细胞膜相互作用的电子自旋共振研究 ‘509‘ 记化合物可以特异地结合到膜蛋白的巯基上。因此标记在膜上的马来酰亚胺自旋标记化合物的 ESR谱 的变化，反应了膜蛋白构象的变化 如果巯基处于 两种不 同的环境中，即一种处于膜 蛋白的表面，另一种处于膜蛋白三毁结构的深层，则可出现两种 EsR诸 当自旋标记物结合到 膜蛋白质的表面巯基上时，其 ESR谱是弱固定化的，以w 表示，当自旋标记物结合到膜蛋白质 的深层琉基上时，其 ESR诺是强固定化的，以s表示 通过测量波诺上弱固定化成分和强固定 化成分的比值 w ／s，可以近似表示癌细胞膜蛋白上巯机结合位置的性质，反映细胞膜蛋白的构 象。实验表明，马来酰亚胺 自旋标记化合物(MSL)标记癌细胞的 ESR诸是 由两种 波叠加而成。 用弱固定化作用峰值 w 与强固定化作用峰值 s之比作为参数，可以直观反映膜蛋白上琉基 的性 质 亚油酸铂的作用使乳腺癌细胞和 s 实体瘤细胞的 w／s值降低，表 明亚油酸铂作用于膜 蛋白引起膜蛋白构象变化，使马来酰亚胺 自旋标记化合物(MSL)运动受到限制加强 我们的实验 提示，亚油酸铂抗癌机理可能是先与癌细胞膜上的蛋白质发生作用，然后才进人细胞 内与 DNA 作用，有关这方面的工作还待今后进一步探讨。 参 考 文 献 [1】 于盛海、孔祥林， 国外医学肿瘤分册，1992，19，271 【2] Gastiaburu，J；Brlenza，s．；Missel J．L．；Jasmin，C ，Burki；F．：Machover，D．；Mathe，G．，Cancer Res 1991， 32(supp1．)，173． 【3】Tabary，T．，Anticancer Res．，1991，1t(I)，343． [4】 Lapidot，Y．， ofLipidResearch．1967，8．142． 【5] 【6] [7】 【8] 【9] [10】 [11] 【l2] [131 高建愚 郭振泉、李 荔，北京大学学报(自然科学版lI 1991，27：505 Huang，A Huang L．；Kennel，S．J， Bio-Chem 1980，255，8015． 忻文娟、赵保路 张建 中， 中国科学{ 辑)，1984，5 429。 陈宝卫 王 夔 扬正红 高 梅，北京医科太学学报．1991，23，321 赵保路 忻文绢 周风兰 潘华珍，生斯化学与生物物理学报，1995，17，175。 Hiroshi，N．， Biochem． l9帅 ， ．1267． Haest，C W ．M ．，Biochem Biaphys Acta，1981，640，535 忻文娟 张清刚、张建 中 李益新 范景伟，科学通报，1981，26，1455 Byung P Y．． Biofog．Chem ．19q7，252 5252 维普资讯 http://www.cqvip.com · 5l0· 有 机 化 学 995正 Interaction Between the Targeted Liposomes of Containing Linoleic Piatinum and Tumour Cell M embrans ZHANG Jing ，SUN Run-Guang 1．2． SUN Yu~ ing ．HAO Ai-Ming (1 Exprtimehtd Centre ofShaanxi Normal University．710062 Xian Shanxi) i2 lnstitue ofTheoretical Phvsics Academia Sinica．100080 Beijing1 Abstracts：The interaction between the targted liposome of containing linoleic Natinum and tumor cel1 mem branes was studied by method 0f 3-maleimide ，2，5，5~ etramethyl-1一 pyrrolidinyloxyl spin Label(MSL)．The targted liposome of containing linoleic platinum effects on ESR spectrum of tumor cells 1abeled with MSL In the presence of 1inoleic pLatinum the ratios of W and S of breast cancer cell membranes and S㈨ cell membranes 1abeled with M SL were changed，The results indicate linoleic platinum can react with mercapto groups on the proteins oftumor cel1membranes and changetheconformatiom ofcellmembrane proteim． Key words：targeted liposome．1inoleic platinu．monoclonal antibody 维普资讯 http://www.cqvip.com