雌激素对雄性大鼠大脑中动脉闭塞神经保护作用的研究

雌激素对雄性大鼠大脑中动脉闭塞神经保护作用的研究 雌激素对雄性大鼠大脑中动脉闭塞神经保 护作用的研究 中国医药2o07年5月第2卷第5期Chinamedicine.May2o07.V0】.2,No.5 张剂,又能增加红细胞环磷腺苷(cAMP)的含量,改 善红细胞的变形能力而降低血液粘度,改善微循环, 降低血管阻力,增加缺血区的血流量,从而改善脑缺 血区的供血供氧,改善脑循环达到治疗目的.本组临 床资料显示,在综合治疗的基础上加用PGE.,疗效明 显高于单纯性综合治疗.治疗组总有效率为93.3%, 对照组总有效率为53.3%,2组间的差异有统计学意 义.血粘度的改变对缺血性脑血管病的诊断和预防 具有一定的临床意义.多数学者认为血粘度增加是 发生缺血性卒中的危险因素之一.血浆粘度可直接 影响红细胞,血小板的表面电荷,代谢及运动,纤维蛋 白原增加,红细胞的变形能力下降均为导致脑梗死的 重要因素.本组提示PGE,治疗脑梗死不失为一种 安全有效的药物,并有着广阔的应用前景. [收稿:2006—12-08] (本文编辑张印朋) 雌激素对雄性大鼠大脑中动脉闭塞 神经保护作用的研究 谢兵兵马建国姜丽徐明高轩尹春丽 【摘要】目的探讨雌激素对永久性大脑中动脉闭塞的神经保护作用及其可能机制.方法将大鼠 随机分为TIC染色组和凋亡组.其中每组又分为生理盐水给药组,雌二醇给药组和假手术组.采用线拴法 制作大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)模型.各组动物均在线栓插入颈内动脉24h后 处死,断头取脑.TIC染 色组分别于4,8,24h行神经功能评分,并在末次评分后断头处死,行TIC染色,观察 脑梗塞体积.凋亡组进 行免疫组化染色,分别计数大脑皮质和纹状体区每平方毫米的bel-2和bax的阳性 细胞数.结果雌二醇在 1me/kg腹腔注射给药时能显着缩小大鼠脑梗塞体积.在鼠脑缺血24h雌二醇有效 促进了抗凋亡基因bel-2 的表达,抑制了促凋亡基因bax的表达.结论雌激素对雄性大鼠缺血性脑损伤具有 明显的神经保护作用. 对基因和非基因因素的影响是神经保护作用的可能机制. 【关键词】脑梗死;雌激素;雌二醇;脑保护 【中图分类号】R977.12【文献标识码】A【文章编号】1673-4777(2007)05-0274-04 Neuroprotectiveeffectofestrogensinmaleratsthmiddlecerebralarteryocclusion.X/eBingbing.Ma Jianguo-Jiangneta1.DepartmentofNeurology.TangshanWorkersHospital(Tangshan063000-China) 【Abstract]ObjectiveToobservethenettroproteetiveroleanditsmechanismofestrogensinmaleWistar ratswit}lmiddlecerebralarteryocclusion.MethodsMaleWistarratswererandomlydividedintoTICstaingroup andapoptotiegroup.Eachgroupwassubdividedintosalinegroup.estradiolgroupandcontrolgroup.emodelsof cerebralischemiaweremadebyocclusionmiddlecerebralarteryusinganintraluminalfilamentmethod.Oneweek later-allratsweresubjectedtopermanentmiddlecerebralarteryocclusionandwerekilledat24haftercerebralis— chemia.esizeofinfarctionwasshowedbyTICstain.Immunohisto— chemistryWasusedtOshowtheexpressionof bcl一2andbax.ebel一 2andbaxpositivecellswerecountedinthecerebralcortexandcorpusstriatum.ResultsIn? traperitonealinjectionof1me/Kgestradiolcoulddecreasetheinfarctionvolume.Theexpres sionofbel-2Waspromo? tedandtheexpressionofbaxwasinhibitedbyestradiolat24hofcerebralischemia.Conclusio nE2mayplaya protectiveroleoncerebralischemiainrats.Regulationofgeneexpressionandotherfactorsisi nvolvedinitsmecha— nism. 【Keywords】Cerebralinfarction;Estrogen;Estradiol;Neuroproteetion 缺血性脑血管病以发病,病死,致残率高严重危 害人类健康.临床研究观察发现,绝经前妇女中风 发病率较同龄男性低,但绝经后发病率明显上升. 临床回顾性研究也发现绝经后妇女接受雌激素或雌 激素加孕酮治疗者,中风和心肌梗死的发病率和病 作者单位:063000河北省唐山市工人医院神经内科(谢兵兵, 马建国,徐明,高轩,尹春丽),病理科(姜丽) 死率均下降….这说明雌激素可能具有缺血脑保护 作用.在脑缺血过程中衡量脑保护剂是否有效,首 要的指标是看它是否缩小了脑梗死的面积或体积. 本资料采用线栓法制作大鼠永久性,局灶性脑缺血 模型,观察雌激素对脑缺血后梗塞体积的影响,并观 察了雌激素对脑缺血时bcl-2及bax蛋白表达的影 响,并对雌激素的缺血脑保护作用的可能机制进行 了推测. 中国医药2007年5月第2卷第5期Chinamedicine,May2007…Vo1.2,No.5 1资料与方法 1.1实验动物雄性Wistar大鼠48只,鼠龄2,3 个月,体重230,250g,华北煤炭医学院实验动物中 心提供.术前统一放置于饲养室内,术前8h禁食, 自由饮水,术后置于观察室单独放养,饮食,室内环 境,手术条件完全一致. 1.2动物分组及给药方法48只大鼠统一编号后 随机分为TI'C染色组和凋亡组2组.其中每组又分 为雌二醇给药组和生理盐水给药组及假手术组,每 亚组各8只.假手术组线栓插人颈内动脉9mm.雌 二醇给药组每日腹腔注射雌二醇1me,/kg,生理盐水 给药组仅给予同等容量的生理盐水腹腔注射,饲养1 周.1周后,所有大鼠均行手术.雌二醇给药组和生 理盐水给药组线栓插入颈内动脉18,21mm,假手术 组线栓插入深度为9mlTl.雌二醇给药组和生理盐 水给药组在大脑中动脉栓塞模型成功24h后处死, 断头,取脑,分别行,IrI'c染色和免疫组化染色;假手 术组在线栓插入颈内动脉24h后处死,断头,取脑, 分别行TIC染色和免疫组化染色. 1.3试剂雌激素(雌二醇苯甲酸盐)购自sigma公 司,抗bcl-2,bax兔多克隆抗体,SP试剂盒,DAB显色 试剂盒均购自北京中山生物技术有限公司.红四氮 唑(,I1'C)购自武汉天源生物技术有限公司. 1.4大鼠线栓法局灶性脑缺血模型的制作将直 径0.205mln,长约5cm的尼龙鱼线头端用酒精灯外 焰烤钝,使其呈圆形膨大,直径0.28,0.44mm.在 距头端181Tim和21mm上分别作上标记,浸人0.1% 多聚L.赖氨酸溶液中过夜,取出放在6O?烤箱条件 下1h备用.大鼠大脑中动脉阻断(MCAO)局灶缺 血模型的制备参考ZeaLonga,用尼龙鱼线栓塞左 侧大脑中动脉(MCA),造成大鼠大脑中动脉闭塞,引 起MCA所支配区域缺血,即建立大脑中动脉缺血 (MCAO)模型. 1.5模型方法A:神经功能评分:一般行为观 察:在术后1,2,4,8,24h观察神经系统症状,主要观 察肢体瘫痪,转圈等,并作提尾悬空试验.参考MA— CO局灶缺血模型神经功能评分(ZeaLonga5分评 分)标准J,分别在术后4,8,24h进行评分.0分: 无神经损伤症状;1分:不能完全伸展对侧前爪;2 分:向对侧转圈;3分:向对侧倾斜;4分:不能自发行 走,意识丧失.B:组织处理和梗塞体积的测定:采 用红四氮唑(2,3,5-triphenyhetrazeoliumchllirides, ,IrI'c)法.,IrI'c(武汉天源生物技术有限公司)是一 种水溶性盐类物质,可以与活细胞线粒体内脱氢酶 反应生成深红色脂溶性物质,死亡细胞由于线粒体 内脱氢酶失活而不显色.将各组大鼠在缺血24h, 末次评分后,行过量麻醉,断头,取脑,从距额极3 mm处开始,将鼠脑切成2mm厚的冠状切片,以2% 红四氮唑(,I1'c)浸浴,避光,37?恒温孵育1h,中途 翻面,以使染色充分,均匀.然后将脑片置于一白板 上,放标尺,以数码相机照相,输人计算机内.用病 理图像分析系统(北京天健公司)测定缺血坏死区, 同侧半球的面积,分别计算缺血区的体积(IV),同侧 前脑体积(HV)和体积比(VR=IV/HV). 1.6凋亡组 1.6.1石蜡切片的制作将各组大鼠在缺血24h 后行过量水合氯醛麻醉,断头取脑,去掉嗅球和脑 干,置于一18?冰箱15min.取出后将脑组织从额 极后移3mm起,取5mm厚冠状切面,10%中性甲醛 固定后梯度乙醇脱水,石蜡包埋,切成5p,m薄层. 1.6.2bcl一2及bax免疫组化染色采用sP法进行 免疫组化染色,阴性对照以PBS代替兔抗bcl-2. 1.6.3bcl-2及bax免疫组化结果判断bcl-2及 bax阳性细胞为胞质或胞核呈棕黄色.测微网计数 阳性细胞数,采集1O个具有代表性的高倍视野(40 ×目镜),其中大脑皮层5个,纹状体区5个,对平均 1.0mm内阳性细胞数进行统计比较. 1.7统计学处理应用SAS软件进行统计学分析, 梗死体积比以x?s表示组间比较进行t检验. 2结果 2.1神经功能评分动物经水合氯醛麻醉后呼吸 平稳,呼吸节律规整,麻醉持续时间为1,2h,有2 只动物在术中因麻醉意外死亡.实验过程中随机补 充,保证样本例数.生理盐水给药组,雌二醇给药组 动物苏醒后可见到追尾现象,假手术组无追尾现象. 评分结果见表1.缺血各组动物取脑后可见缺血区 颜色苍白,无出血,血管内皮完整,没有线栓穿破动 脉壁.从表1中可看出雌二醇给药组在缺血8h就 明显改善了动物的缺血状态. 2.2脑梗死灶体积和梗死体积百分比于缺血24 h断头,取脑,冠状切片,经,IrI'c染色雌二醇给药组 及生理盐水给药组各例均见梗塞灶,缺血对侧大脑 半球及假手术组无梗塞灶.经图像分析系统测量的 各组梗塞体积,体积比如表2.表2可见雌二醇给药 组的梗塞体积及体积比均明显小于生理盐水给药 组,提示了雌二醇在1mg/kg腹腔注射给药时能发挥 有效的脑保护作用.生理盐水给药组与雌二醇给药 组同侧前脑体积(HV)相互比较无统计学差别. 表1各组的神经功能评分(?) 注:与生理盐水给药组比较,'P<0.05;与同组的4h相比, P<0.05 2.3免疫组化结果光学显微镜下,常规HE染色 可见缺血区染色较淡或缺失,与正常血供脑组织较 中国医药2007年5月第2卷第5期Chinamedicine,May2007,Vo1.2,No.5 表2生理盐水给药组与雌二醇给药组大鼠缺血侧体积,同侧前脑体积的比较(;s) 注:与生理盐水给药组比较,.P<0.01 易区分,缺血中心区域细胞坏死,溶解,消失,组织结 构难以辨认,可见破碎细胞核,自缺血中心区向周边 部,脑组织的缺血性损伤逐渐减轻,可见细胞核固缩 成三角形,胞浆深染;血管周围有较大空隙,交界处变 性细胞与正常细胞并存.自交界处向正常供血区方 向变性深染的细胞逐渐减少至消失.雌二醇给药组 亦可见细胞肿胀,固缩等病理变化,主要集中在交界 区,损伤程度较轻.手术对侧未见坏死灶及变性区, 神经元无缺血性改变.假手术组脑组织亦未见神经 元缺血性改变.在交界区,雌二醇给药组可见bcl-2 大量表达,明显多于生理盐水给药组,而bax仅见少 量表达,差别有统计学意义,见表3. 表3各组bcl-2,bax阳性细胞数(;?s,mm) 注:与生理盐水给药组比较,.|P<O.05 3讨论 脑保护意味着某一措施能在一个缺氧或缺血事 件发生后通过使脑代谢,组织病理学或神经功能的改 变来阻止或改善神经元损伤J.它包括脑缺血性损r 伤的预防和对已经遭受缺血性损伤的脑组织的复苏. 用大脑中动脉线栓法(middlecerebralarteryocch— sion,MCAO)和双侧颈动脉结扎法(commoncarotid arterycautery,CCAC)制成脑缺血模型,研究雌激素 的神经保护作用也发现,在MCAO和CCAC时雌激 素不但可以使梗塞体积明显缩小,还使生存率明显提 高J.我们的研究也发现雌二醇给药组大鼠的脑梗 死体积明显小于生理盐水给药组,统计学差异显着 (P<0.01).临床观察发现,绝经前妇女中风发病率 较同龄男性低,但绝经后发病率明显上升.临床回顾 性研究也发现,绝经后妇女接受雌激素或雌激素+孕 酮治疗者,中风和心肌梗死发病率和病死率均下 降J.这表明激素因素可能影响中风的发展和结 局[7-81.雌激素神经保护作用机制迄今仍不十分清 楚,可能是多层次的.用17B一雌二醇进行损伤前预 处理在两性别中都可以减少大脑中动脉闭塞后的损 伤.但是,剂量和最适宜的预处理的时长还不明确. 我们的实验证实了在缺血前给药,雌激素给药组在缺 血24h后脑梗死的体积显着小于生理盐水给药组. 而且有人指出,1713一雌二醇在暂时性MCA闭塞的3h 内给药可使卵巢切除的雌鼠减小组织损伤J.在可 逆性MCA闭塞的雄性大鼠,在再灌注的当时给药, 1713一雌二醇也可减少组织损伤?引.雌激素有扩张血 管的作用.一方面雌激素促使内皮细胞释放内皮细 胞衍生舒张因子,抑制平滑肌的收缩;另一方面,通过 抑制内皮细胞释放内皮素而抑制血管收缩,其综合效 果是使血管扩张,防止脑缺血性损伤.不仅如此,雌 激素还可作用于血管平滑肌细胞,阻断细胞膜钙离子 通道,同时激活细胞膜上钾离子通道,保持细胞内外 离子浓度的平衡,从而维持平滑肌的正常舒张功 能??.很早就有报道,在患有脑血管疾病的女性,雌 激素可以增加脑血流灌注.Shi等?报道用MCAO 法制作动物模型,再灌注时,去势+雌激素雌性大鼠 梗死侧大脑脑血流量(cerebralbloodflow,CBF)很快 恢复至基础水平的61.75%,而去势组织恢复至40% (P<0.05).细胞培养表明,B一雌二醇(p—estradiol, 13E2)可以使l2种不同的神经细胞抵抗达l4种不同 的毒性物质或因素的损伤,包括缺血,氧化应激,B一淀 粉样蛋白(B—anyloidprotein,13A4)引起的毒性和兴奋 性毒性(excitotoxity)?.尽管雌激素在脑保护方面 有上述诸多作用,但是其作用机制还不十分清楚.有 人认为,其是通过类固醇激素的经典途径发挥作用 的14-16],即雌激素进入细胞后,与细胞质中的雌激素 受体结合,然后此复合物再通过核膜结合到相应的基 因位点上,调控mRNA的表达和蛋白的合成.另一 些实验证据表明,其神经保护作用不是通过基因调控 途径发挥的,理由?一些无受体结合位点的雌激素类 似物亦可发挥同雌激素一样的神经保护作用.引; ?在所有神经毒性反应模型中,雌激素拮抗剂不能抑 制雌激素的保护活性?;?在加入抑制mRNA转录 及蛋白合成的抑制剂后,雌激素仍能发挥神经保护作 用?蚴J.本文结果显示,雌激素能显着减小局灶脑 缺血大鼠24h后的梗塞体积,以及该缺血区占同侧 前脑的相对体积.雌激素对大鼠永久性大脑中动脉 阻断模型缺血性脑损伤确有保护作用. bcl-2家族是细胞凋亡的一种重要调节因子,它 包括抑制因子bcl-2,bcl—xl和促进因子bax,bad, bcl—x5.这两种因子的相对水平影响着细胞对引起凋 亡刺激的敏感度.bc1-2基因及其家族成员在细 胞凋亡中起重要作用,它们共同构成一个非常复杂的 相互作用网络,调控细胞凋亡.bcl-2家族内部成员 之间可形成同源二聚体或异源二聚体.这种二聚体 反应可以调节细胞的死亡和存活信号的平衡状态,是 决定细胞存亡的关键事件.bcl-2是一种与细胞器特 别是线粒体膜相关联的稳定蛋白,它主要位于线粒体 中国医药2Oo7年5月第2卷第5期Chinamedicine.May2o07,Vo1.2,No.5 外膜,内质网膜和核膜上.bcl-2在核膜的分布主要 集中在核孔复合物(NPC)区域,因此认为它可能参与 核内外物质运输.大量实验表明,发生缺血性脑损伤 后bc1.2基因家族的表达改变参与了迟发性神经元死 亡.Isenmann等实验证明,大鼠永久性局灶性顶 叶缺血4h,3d,在缺血中心区域bax蛋白表达明显 增加,并用脱氧核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标 记法(TUNEL)显示DNA断裂的神经元中往往伴有 Bax蛋白的高表达,而抗凋亡基因bcl-2和bcl—xl蛋白 在形态完整的更靠近健康脑组织的神经细胞中表达, 在受损细胞呈弱表达.我们的研究也发现在大鼠大 脑中动脉永久性缺血24h后,雌激素给药组在梗死 灶的周边区,可见bc1.2的大量表达,明显高于生理盐 水给药组(尸<0.05). 总之,可以认为bcl-2在脑缺血后起着促进神经 元生存的作用,而bax在脑缺血后起着促进神经元死 亡的作用.雌激素促进了bcl一2的活化,并抑制了 bax的活化,对脑组织产生了保护作用. 参考文献: [1]GreenPS,BishopJ,SimpkinsJW.17et—Estradiolexertsneumpm— tectiveeffectonSK—NSHcells[J].JNeumsci,1997,17(2): 111 [2] [3] [4] [5] [6] [7] [8] LongaEZ,WeinsteinPR,CarlsonS,eta1.Reversiblemiddlecere— bralarteryocclusionwithoutcraninectomyinrats[J].Stroke,1989, 2O(1):841. 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[收稿:2006—12-20] (本文编辑王玉虎)