消风散颗粒免疫调节作用机理研究

消风散颗粒免疫调节作用机理研究 第lO卷第4期 2004年8月 中国实验方剂学杂志 ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae Vo1.1O.No.4 Aug.,2004 消风散颗粒免疫调节作用机理研究 李国忠,郑咏秋 (1安徽省铜陵市人民医院,安徽铜陵244000;2安徽中医学院,安徽合肥230032) 摘要:目的:研究消风散颗粒免疫调节作用和机制.方法:分别观察了消风散颗粒对 小鼠迟发型变态反应(DTH)耳肿胀 度,胸腺指数,脾指数;丝裂原诱导的脾T,B淋巴细胞增殖和炎症组织细胞因子的影 响.结果:消风散颗粒可降低DTH小鼠异 常增高的耳肿胀度,脾指数和胸腺指数;抑制丝裂原诱导的脾T,B淋巴细胞增殖; 抑制炎症组织细胞因子白介素l(IL广1),白介 素2(IL-2)和白介素4(IL广4)的活性.结论:消风散颗粒的免疫抑制作用与其调节 T,B淋巴细胞功能和抑制炎性细胞因子的活 性有关. 关键词:消风散颗粒;脾淋巴细胞增殖;白细胞介素1;白细胞介素2;白细胞介素4 中图分类号:R285.5文献标识码:B文章编号:1005.9903(2004)03.0039.04 ThelmmunoregulatoryEffectsandMechanismofXiaoFengsanGranules LIGuo-zhong,ZHENGYong-qiu (1TonglingPeople'SHospital,Tongling,AnhuiProvince,244000; 2AnhuiCollegeofTraditionalChineseMedicine,Hefei,AnhuiProvince,230032) Abstract:Objective:ToinvestigatetheeffectsandmechanismofXiaoFengsanGranules(XF G)ondelayedtype hypersensitivity(DTH).Methods:InmiceDTHinducedby2,4一 dinitroflurobenzene(DNFB),theeffectsofXFGonear swelling,spleenindexandthymusindexwereobserved,andthesplenocytesproliferationind ucedbyConcanavalinA(Con A)orlipely— saccharide(LPS)weredetermined;Meanwhile,thecytokinesincludinginterleukin一1(IL 一1),interleukin一2 (IL一2)andinterleukin一4(IL一 4)productionbytissueofdermatitisweremeasured.Results:XFGcounldinhibittheear swelling,thymusindex,splennindexandtheenhancedsplenocytesproliferationinDTHmic e.XFGcouldalsoinhibit theactivityofIL一1.IL一2andIL一 4intissueofdermatitis.Conclusions:ThemechanismbywhichXFGregulatedthe immunefunctionmightviaitsregulatoryeffectsonT,Blymphocytesanditsinhibitoryeffects oncytokinesproduction. Keywords:XiaoFengsanGranules;splenocytesproliferation;interleukin一1;interleukin 一2;interleukin一4; 消风散颗粒源于《外科正宗》所载经方消风散, 由当归,防风,苍术等多味中药组成,具有疏风养血, 清热除湿的功效,临床主治风疹,湿疹.近年研究显 示,消风散颗粒具有抗炎,抗过敏和抑制药物所致全 身性瘙痒的药理作用,本文在已有工作基础上, 进一步分析了消风散颗粒对2,4一二硝基氟苯 (DNFB)诱导的小鼠皮肤迟发型变态反应(DTH)的作 用机制. 1材料 1.1药物消风散原处方为每剂当归,生地,防风, 蝉蜕,知母,苦参,荆芥,苍术,牛蒡子,胡麻,石膏各 一 钱(3克),甘草,木通各五分(1.5克).取以上各 味药材按原方配比粉碎成40目粉,以正交设计法确 收稿日期:2003—09—22 定其最佳提取工艺.产物为棕色颗粒状,气香,味 稍苦,每克相当于生药2.625g.I临床日服生药量 31.5g,即颗粒量12g.实验前,颗粒以含0.5%羧甲 基纤维素纳的双蒸水配成所需浓度,剂量以颗粒量 计算. 湿毒清胶囊,广西云林制药厂出品,批号 000107,每粒胶囊含药粉0.5g,具有养血润燥,化湿 解毒,祛风止痒功能,用于皮肤瘙痒症属湿蕴皮肤证 者.I临床服用,每日3次,每次1.5,2g.试验剂量 以胶囊内含药粉剂量计算. 1.2试剂小鼠用白细胞介素4(IL一4)ELISA测定 试剂盒购自晶美生物技术公司;二甲亚砜,上海硫酸 厂产品;2.4一二硝基氟苯(DNFB),上海金山县兴塔化 工厂产品.RPMI1640培养粉,Hepes,M1Tr,刀豆蛋 白A(ConA)和脂多糖(LPs)均购自sigma公司.胎 ? 39? 第l0卷第4期 2004年8月 中国实验方剂学杂志 ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae Vo1.10.No.4 Aug.,2004 牛血清,购自北京邦定生物医学公司,临用前热灭 活. 1.3动物ICR小鼠,雄性,体重24.15?2.25克, 用于制备DTH模型.C57BL/6J小鼠,雄性,体重18 4-2克,用于IL-1和IL.2活性测定.以上动物均购 自上海西普尔一必凯实验动物有限公司.合格证 号:沪动合证152号,许可证号:2002--0006. 1.4仪器Napco6100CO培养箱,美国杜邦公司 产品;XSZ倒置显微镜:重庆光学仪器厂产品.YJ一 1450型医学净化工作台,苏州净化设备公司产品. EL301型酶标仪,美国Bio.Tek公司产品. 2方法 2.1剂量设置,给药方法及实验对照ICR小鼠60 只,随机分为6组:消风散颗粒高剂量组(4.8g? Kg),中剂量组(2.4g?Kg),低剂量组(1.2g? Kg),湿毒清组,(1g?Kg),正常组和DTH模型组, 每组10只.每日灌胃一次,模型组和正常组给予等 量溶媒. 2.2小鼠迟发型变态反应模型的制备及评价灌 胃第5天,DNFB以丙酮和中性麻油(1:1)调配成相 应浓度溶液备用,将每鼠(除正常组外)腹部去毛,去 毛范围约为3×3cIn2大小,将1%DNFB25均匀涂 于去毛部位致敏,次日同法强化一次.继续给药4 天后,再以0.2%DNFB溶液10均匀涂于右耳,涂 耳后12h给药一次.DNFB涂耳24h后全部小鼠脱 颈椎处死,以直径8mm打孔器摘取左右耳片称重, 以左右耳片重量之差示DTH反应强度,同时取脾 脏及胸腺称重,以每10g体重之脾重和胸腺重表示 脾指数和胸腺指数. 2.3ConA和LPS分别诱导的脾淋巴细胞增殖反应 常规制备脾脏淋巴细胞悬液1×107个细胞/ml, 于96孔无菌细胞培养板中每孔加入细胞悬液 100td,100~lConA(终浓度5mg?L)或LPS(终浓度 5mg?L),设3个复孔.置37~C,5%CO培养箱内 培养72h后,每孔加入5g?L的MrI-r液10,于振荡 器上振荡lmin,再放入37~C,5%CO,培养箱继续培 养2h.结束培养后760G离心10rain,吸弃上清后每 孔加入二甲亚砜200td,在酶标仪上于490nm波长处 读每孔吸光度,结果以A值表示. 2.4炎症组织细胞因子活性检测 2.4.1标本采集右耳片称重后,剪碎放入离心 管,每管加入含0.1%Tween一20的PBS液3ml制备匀 浆,并超声10S,760G离心10rain,取上清(每标本 100t,1)用作细胞因子活性测定. 2.4.2IL一1活性检测采用活化的小鼠胸腺细胞 M1rr比色法. 2.4.3IL.2活性检测采用活化的小鼠脾细胞 MrI-r比色法. 2.4.4IL一4活性检测采用ELISA法,详细操作参 照说明书. 3结果 3.1消风散颗粒对DNPB诱导DTH小鼠免疫功能 的影响见表1.结果表明消风散颗粒三个剂量组 均可显着抑制DTH小鼠耳肿胀,同时消风散颗粒 高,中剂量组可有效抑制DTH小鼠脾指数,消风散 颗粒高剂量组还可有效抑制DTH小鼠胸腺指数. 表1消风散颗粒对DNFB诱导DTIt小鼠免疫功能的影响(j?:n=10) 注:与正常组比较P<0.01;与模型组比较'P<0.05,一P<001(下同). 3.2消风散颗粒对ConA和LPS分别诱导的脾淋巴 细胞增殖反应的影响见表2.结果表明较之正常 组,ConA诱导的DTH小鼠脾T淋巴细胞增殖反应和 ? 40? LPS诱导的DTH小鼠脾B淋巴细胞增殖反应均显着 增加,消风散颗粒三个剂量均可抑制脾淋巴细胞的 过度增殖反应. 第l0卷第4期 2004年8月 中国实验方剂学杂志 ChineseJournalofExperimentalTraditionalMedicalFormulae V01.10.No.4 Aug.,2004 表2消风散颗粒对ConA和LPS分别诱导的脾淋巴 细胞增殖反应的影响(;?s;H=4) 组别剂量(g/kg)T细胞增殖反应(A)B细胞增殖反应(A) 3.3消风散颗粒对炎症组织细胞因子活性的影响 见表3.结果表明DTH小鼠右耳炎症部位IL一1和IL一 4活性显着增加,而IL一2活性则无明显变化,消风散 颗粒不仅可有效抑制模型组小鼠异常增高的IL一1,IL一 4活性,而且对IL-2活性也有明显下调作用. 4讨论 DTH在致敏机体接触致敏原后约24h以上才出 现病变,其组织损伤机制是迟发型超敏反应T细胞与 抗原结合而活化,释放出多种淋巴因子,导致反应局 部组织发生以单核细胞浸润为主的炎症反应.本 实验结果表明,在DNFB诱导的小鼠DTH模型中,脾 脏B淋巴细胞与T淋巴细胞对丝裂原敏感的增殖反 表3消风散颗粒对炎症组织细胞因子活性的影响(;?s;H=4 应均显着增强(P<0.01),说明T,B淋巴细胞均参 予了DTH的病理过程.消风散颗粒对两种脾淋巴 细胞的增殖反应均有显着抑制作用,显示其可能通 过影响T,B淋巴细胞的功能发挥免疫抑制作用. T细胞可因分泌不同细胞因子而被分为Thl (IFN一7,IL一2),Th2(IL一4,IL一5,IL一6,IL一10)和Th3(TGF— B)[6-.以化学致敏原接触皮肤表面引起的DTH又 被称为接触超敏反应(ContactHypersensitivity,CHS), 该反应被认为与Thl细胞的渗透作用有关J.但 有研究认为,重复接触致敏原可引起细胞因子释放 失衡并使CHS转变为Th2反应??"].IL一4可由包括 Th2细胞,NK细胞在内的多种细胞产生",近来,B 细胞也通过分泌不同的细胞因子而被划分为Bel和 Be2细胞,其划分类似于Thl和Th2.研究表明Bel 也可大量产生IL一4.IL一2由Thl细胞产生,为Ts 和Tc(杀伤)细胞分化增殖所必需的调控因子,并对 Tc细胞杀伤效应有增加作用.IL.1可诱导T细胞分 泌IL一2,促进B细胞增化以及增强机体的免疫应答 等. 本实验表明,DNFB诱导的DTH小鼠炎部位IL. 1,IL一4活性均显着增高(P<0.01),而IL一2活性没有 明显改变.消风散颗粒不仅能有效抑制异常增高的 IL一1,IL.4活性,还可有效抑制IL.2活性.综合以上 结果,消风散颗粒的免疫抑制作用与其调节T,B淋 巴细胞功能和抑制炎性细胞因子的活性有关,粒治 疗以?型变态反应为主的湿疹等皮肤疾病的主要机 制之一. 参考文献: 郑咏秋,陈光亮,戴敏,等.消风散颗粒抗炎作用的 实验研究[J].基层中药杂志,2002,16(5):6-8. 郑咏秋,戴敏,陈光亮,等.消风散颗粒抗过敏作用 及其机制研究[J].中国实验方剂学杂志,2002,8(6): 26.28. 梁君山,魏伟,周爱武,等.白细胞介素.1的检测及 白芍总甙对其的影响[J].中国药理学通报,1989,5 (6):354.9. 丁桂风,席宏丽,邓玉兰,等.用活化小鼠脾细胞测定 IL-2[J].上海免疫学杂志,1988,8(1):64.70. 沈玉先,魏伟,张安平,等.富硒酵母对不同状态下 的DTH的影响[J].微量元素与健康研究,1998,15 (4):7.8. ScottP,KaufmannSHE.TheroleofT-CellsubsetSand eytokinesintheregulationofinfection[J].ImmunolToday, 1991,12:346. 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[14]尚红生,邓玉兰,林志彬,等.小鼠IL-1测定方法的探 讨及中药香菇菌多糖对IL-1产生的作用[J].中国免 疫学杂志,1986,2(2):70. 复方毛冬青颗粒抗流感病毒实验研究 周爱香,李小芹,戴柏勇,蔡润兰,高英杰,康旭亮,李洪梅 (中国中医研究院中药研究所,北京100700) 摘要:探讨复方毛冬青颗粒的抗病毒作用.结果表明,复方毛冬青颗粒对呼吸道合 胞病毒,副流感病毒I型,疱疹病毒I,II 型,柯萨奇病毒4型均有不同程度的抑制作用;以17.6,8.8,4.4g生药/kg灌胃给予小 鼠,能明显抑制小鼠病毒性肺炎,提高病 毒性肺炎小鼠的免疫功能和存活时间. 关键词:复方毛冬青颗粒;病毒性肺炎;免疫功能 中图分类号:R285.5文献标识码:B文章编号:1005—9903(2004}04—0042—04 复方毛冬青颗粒由毛冬青,葛根,柴胡等中药组 成,具有清热解毒,疏风透表等功效,临床用于风热 感冒引起的发热,头疼,咽痛等症.本实验即采用小 鼠病毒性肺炎模型,初步探讨了复方毛冬青颗粒的 抗病毒作用及免疫功能. 1材料和方法 1.1实验药物复方毛冬青颗粒,含3.87g生药/ml 浸膏,由中国中医研究院中药研究所剂型室提供,批 号:011212.试验时以蒸馏水配制至所需浓度.银 翘解毒颗粒,天津长城医药保健品有限公司,生产批 号为011015;唑(三氮唑核苷)为原料药,湖北省医药 工业研究所产品,批号981011. 1.2实验动物昆明种小鼠13,15g,雌雄各半,由 北京生物制品研究所实验动物室提供,合格证号为 京动许字1999第012号. 1.3试剂与仪器流感病毒亚甲型鼠肺适应株 FM.:为本实验室传代,一60?低温保存;副流感病毒 收稿日期:2003—08—22 ? 42? 1型(HvJ),呼吸道合胞病毒(RSV),腺病毒3,7型 (AdV),单纯疱疹病毒I,II型(HSV.I,II),柯萨奇病 毒4型(COXB4)购自中国预防医学科学院病毒研究 所,本实验室传代后使用,一60?冰箱保存备用.人 喉癌传代细胞HEP.2株,购自卫生部药品生物制品 检定所. 细胞培养液:含10%小牛血清,0.29mg谷氨酰 胺/ml,100u/ml青,链霉素的Eagl6sMEM(日本日水制 药株式会社出品). CO培养箱,日本Yamato科学株式会社产品;倒 置显微镜,德国产OLYMPUS牌,zs.3半自动生化分 析仪,中国科学院生物物理研究所和中国中生生物 工程高技术公司联合制造. 2实验方法 2.1抗病毒试验 2.1.1体外抗病毒试验取已长成单层HEP-2 细胞的培养板,倒掉培养液,接种50TCID的不同病 毒液lOOt~l于细胞孔,每一种病毒接种一块细胞板, 留一行不接种病毒作正常细胞对照.置37?5% CO培养箱中吸附1h,倒掉病毒液,用不含小牛血清 ]J]J1J9m? rlrlrl