ELISA法及荧光定量PCR法检测HBV感染者精液HBV-DNA的探讨

ELISA法及荧光定量PCR法HBV感染者精液HBV-DNA的探讨 ELISA法及荧光定量PCR法检测HBV感 染者精液HBV-DNA的探讨 VOI.20No.I1November2009HAINANMEDICALJOURNAL《海南医学)2O09年第20卷第11期 PCR—ELISA法及荧光定量PCR法检测 HBV感染者精液HBV—DNA的探讨 钟剑峰,高兴成,黄伟佳,史利华 (广州医学院第三附属医院,广东广州510150) ? 论着? 【摘要】目的探讨PCR—ELISA法及荧光定量PCR法(FQ—PCR)检测HBV感染者精液中HBV— DNA检出情况及其临床意义.选取男性HBV感染者60例,采集患者精液,静脉血,用PCR—ELISA 法来检测患者精液及血清中HBV—DNA.同时采用荧光定量PCR检测患者精液中HBV—DNA.结果 PCR—ELISA法:6O例精液标本HBVDNA阳性12例,阳性率18.33%,拷贝数为1.267×10一6.532×10/ ml,平均拷贝数为4.781×10/ml;60例血清标本阳性53例,阳性率为88.33%,拷贝数1.462×10一5.153 ×10/ml,平均拷贝数为2.45lx10./ml.荧光定量PCR法:60例精液标本HBVDNA阳性l3例,阳性率 21.67%,拷贝数为1.357×10'一7.113x10/ml,平均拷贝数为4.983×10/ml;两种检验方法检测精液 HBV—DNA的阳性检出率比较无显着性意义(P>0.05).结论PCR—ELISA法与荧光定量PCR定量检 测精液中HBVDNA同样具有较强的特异性和灵敏度,为临床了解乙型肝炎患者 精液中肝炎病毒的感染状态 提供了帮助,具有重要的临床意义. 【关键词】PCR—ELISA;FQ—PCR;乙型肝炎病毒DNA;精液 【中图分类号】R446.6【文献标识码】A【文章编号】 1003----6350(2009)11---009----04 TestingHBV—DNAinsemen,vithPCR—ELISAandFQ— cheng, PCR.ZHONGJian-feng,HAOxf,l— HUANGWei— jia,eta1.The3rdHospitalAffiliatedtoGuangzhouMedicalCollege,Guangzhou5l063O, Guangdong., P.R.CHINA 【Abstract】ObjectiveToevaluatethevalueofPCR—ELISAandFQ— PCRtotestHBVDNAinHBV sufferers'semens.MethodsHBVDNAin60HBVsufferers'semensandserumsweretestedwithquantitative PCR—ELISAandFQ—PCR.ResultsUsingPCR— ELISA,therewere12positivesamplesofHBVDNAin60 semensamples,andthepositivewasl8.33%.Thecopieswere1.267×10一6.532× 10/ml,andtheaverage copywas4.781× 10/m1.Therewere53positivesamplesofHBVDNAin60serumssamples.andthepositiveis 88.33%.Thecopieswere1.462×10一5.153×10/m1.andtheaveragecopyis2.451× 10./m1.UsingFQ— PCR,therewere13positivesamplesofHBVDNAin60semensamples,andthepositivewas21.67%.Thecopies were1.357×10'一7. 113×10/m1.andtheaveragecopywas4.983×10/m1.Therefirenodiffefencebetween PCR—ELISAandFQ—PCR.ConclusionPCR—ELISAquantitativetestandFQ— PCRhavesimilarspeciality andsensitivity,whichhasimportantclinicalsignificancetoevaluatethesituationofHBVDN Avirusesinsemen samples. 【Keywords】PCR—ELISAtest;FQ—PCR;HBVDNA;Semen 乙型肝炎病毒(HBV)感染的病原诊断及抗病毒 疗效判断主要依赖于血清特异性抗原抗体和HBV— DNA的检测,HBV—DNA是复制活动最直接和可靠 的指标,而血清检查结果常不能反映其精液的感染 状况.为了解乙型肝炎患者精液感染情况及传染 ELISA法及荧光定量PCR(FQ 性,我们采用PCR— — PCR)检测技术对6O例乙型肝炎患者精液HBV— DNA作定量检测,并对比两种检验方法的差异,现 将结果报道如下: 基金项目:广州I医药卫生科技项目(编号:2007一YB一174) 作者简介:钟剑峰(1972一),男,广东籍,主治医师,硕士. 1资料与方法 1.1标本来源及处理2007年7月至2009年 1月我院男科门诊收治男性HBV感染者6O例,年龄 2O一38岁,平均30.5岁,血清HBsAg均阳性.将精 液置37.C温箱内温化30min,精液液化后,标本置 一 20.C备检,同时采集患者静脉血2ml,分离收集 血清置一2O.C备检,其中有2例未采得血清标本. 1.2仪器及试剂采用ABI一7500PCRreal timePCRsystem(美国),BiometraPCR仪,BLO一 ? 9? 《海南医学)2oo9年第2O卷第l1期VOI20Nol1November2009 TEKEIXSO0酶标仪,Thermo洗板机,乙型肝炎病毒 (HBV)核酸扩增酶免定量检测(PCR—ELISA)试剂 盒由上海浩源生物科技有限公司提供;荧光定量 PCR(FO—PCR)试剂盒由中L【J大学达安基因股份 有限公司提供. 1.3检测方法 1.3.1PCR—EIISA法标本室温解冻后,振 荡精液,使精子,精浆充分混匀.严格按试剂盒操作 方法提取精液及血清HBV—DNA.对PCR—ELISA 法标本先行PCR扩增,之后行杂交固定,酶联反应 后行显色,最后450nm下读光密度值(0.D),再用 HBV—PCR定量的计算公式计算样本中HBV病毒 含量(单位:拷贝/毫升). 1.3.2荧光定量PCR法标本PCR扩增,扩 增的探针带有荧光发光分子及荧光淬灭分子,扩增 后荧光发光分子与荧光淬灭分子分开,在激光下产 生特定波长的荧光,测定反应液中的荧光强度即可 计算出初始的数量.扩增液中加人了阴性质控 品,阳性质控品,阳性定量参考品.通过描绘增长曲 线,在计算机软件中计算检测标本的拷贝数. 1.4统计学方法采用卡方检验,spearman等 级相关检验,Wilcoxon秩和检验. 2结果 2.1PCR—ELISAM法6o例精液标本HBV— DNA阳性11例,阳性率为18.33%,拷贝数为4.021× 10一6.532×10/ml,平均拷贝数为4.781X10/ml. 60例血清标本阳性53例,阳性率为88.33%,拷贝数 为1.462X10.一2.881×10/ml,平均拷贝数为2.451 ×10/ml. 2.2荧光定量PCRM法60例精液标本HBV DNA阳性l3例,阳性率为21.67%,拷贝数为1.357 X10一7.113×10/rot,平均拷贝数为4.983×10/ ml.PCR—ELISA法与荧光定量PCR法两种检验方 法比较,精液HBV—DNA检出阳性率比较差异无统 计学意义(P>0.05). 1PCR—ELISA法血清与精液HBY—DNA拷贝数结果比较 ? l0? ELISA法精液与血清HBV—DNA 2.3PER— 定量检测的关系将血清与精液HBV—DNA拷贝 数的对数值进行直线相关分析,发现血清与精液病 毒拷贝数等级间存在正相关关系,即血清病毒载量 越高,精液HBV—DNA阳性检出率越高,见表l. HBV感染者精液HBV—DNA拷贝数在阴性一 6.532×10/ml之间,血清病毒DNA拷贝数在阴性 一 2.88l×10/ml之间.采用Wilcoxon秩和检验发 现,患者精液与血清拷贝数差异有统计学意义,尸< 0.0I,精液HBV—DNA拷贝数低于其血清值. 2.4PCR—ELISA法精液HBV—DNA阳性组 与阴性组其血清病毒DNA的拷贝数比较60例患 者中精液HBV—DNA阳性组l1例,其血清HBV— DNA均为阳性,拷贝数在5.482X10.一2.88l×10/ ml之间;精液HBV—DNA阴性组44例,其血清 HBV—DNA拷贝数在阴性一4.371X106/ml之间. 采用Wileoxon秩和检验发现,精液HBV—DNA阳性 组与阴性组其血清病毒DNA的拷贝数差异有统计 学意义,P<0.05.精液阳性组其血清HBV—DNA 拷贝数高于阴性组. 2.5PCR—ELISA法及FQ—PCR法检测精液 中HBV—DNA阳性率的比较PCR—ELISA法阳性 11例,阳性率为18.33%.FQ—PCR法阳性13例, 阳性率为21.67%.采用卡方检验,P>0.05,提示 两种检验方法精液检出阳性率比较无统计学意义. 3讨论 众多研究者采用不同技术在乙型肝炎患者精 液,精子内检测到HBV—DNA,说明精液具有传染 性?,生殖细胞(包括精子)内发现HBV—DNA, 提示乙型肝炎病毒不仅可经性传播,且带有HBV— DNA的生殖细胞还可能通过受精将病毒核酸传给 子代,因此该类人群的生殖健康问题逐渐得到广泛 重视J.国内外已有学者采用PCR—ELISA方法 检测血液中的HBV—DNA,但尚未有学者用此方法 作精液中的HBV—DNA检测'卜引.国内曾有学者 采用FQ,PCR方法检测精液中的HBV—DNA,认为 此是较可靠的方法J,但该方法费用较高,且设备要 求高.为寻求新的简单,方便的检验方法,我们尝试 采用PCR—ELISA法检测HBV感染者血清及精液 中的HBV—DNA阳性率及拷贝量,以此来研究血清 中的HBV—DNA阳性率和拷贝数和精液中的HBV — DNA阳性率及拷贝数的相关关系;同时也采用FQ — PCll法检测HBV感染者血精液中的HBV—DNA 阳性率及拷贝量,其结果与采用PCR—ELISA法检 Vo1.20No.I】November2Oo9HAINANMEDICALJOURNAL《海南医学)20o9年第 2O卷第11期 测的精液HBV—DNA阳性率及拷贝量作对比,探讨 两种方法哪一种更优越. PCR—ELISA(聚合酶链酶联免疫吸附测定)法 是指标本经PCR扩增以后,在微孑L板上借用酶联免 疫吸附试验(EIISA)的原理,使用酶标抗体进行固 相杂交来实现定量.PCR—EIISA的步骤:(1)核酸 提取和制备;(2)进行PCR扩增;(3)微孔预杂交: (4)产物杂交;(5)显色;(6)检测分析. 本研究PCR—ELISA法检测60例精液标本 HBV—I)NA阳性l1例,阳性率为18.33%,拷贝数 为4.021X10一6.532X10/ml,平均拷贝数为4. 781×10/ml.检测60例血清标本阳性53例,阳性 率为88.33%,拷贝数为1.462X10.一2.881X10/ ml,平均拷贝数为2.451X10./ml.研究结果显示, 血清与精液HBV—DNA拷贝数等级间存在正相关 关系,精液HBV—DNA阳性组的血清HBV—DNA 拷贝数高于阴性组的血清HBV—DNA拷贝数,血清 病毒载量越高,精液HBV—DNA阳性检出率越高. 提示精液与血液两体液系统在HBV入侵,感染,复 制过程中存在一定联系. 同时精液HBV—DNA阳性患者精液病毒拷贝 数均低于其血清病毒拷贝数,提示同一患者的精液, 血液中HBV复制状态存在差别,精液传染性较血清 低.究其原因可能与两种体液存在的内环境不同以 及乙型肝炎病毒具有相对嗜组织性等有关,体液中 的HBV主要是由体循环渗出或漏出,血睾屏障对病 毒人侵生精系统也起到屏障作用.PCR—ELISA相 对于凝胶光密度定量,无论是灵敏度,特异性,准确 度上都有很大的提高,能满足临床要求;它为PCR 提供了第一个严格意义上的定量方法.且其有内对 照系统,样品制备简单,可保证HBV病毒不丢失;且 在PCR线性范围内检测,引物和探针分开,测定时 互不干扰;对仪器要求较低,只要有扩增仪和酶标仪 就可以进行?..等优点.肖艳群等?对实时荧光定 量PCR与PCR—ELISA在乙型肝炎病毒DNA定量 检测中的应用比较,采用乙型肝炎患者血清标本,结 果表明:实时荧光定量方法的灵敏度低于PCR— ElISA全自动内标本法,两者变异系数均较低,相关 系数为0.89.刘衍春等?采用PCR—ELISA法检 测ELISA法阴性标本1000份以观察其可靠性,其 结果全部阴性,初步显示PCR—ELISA法与ELISA 法对小样本的HBV的检测结果是吻合的.我们采 用的PCR—ELISA试剂盒具有独特的内标监控技 术,在同一个PCR反应体系中引人"内对照"(IC)分 子并采用检测扩增产物的酶联免疫吸附试验微孔相 杂交技术,以监侧PCR的乎均效率,检测结果较为 可靠.该法克服了普通的PCR法需凝胶电泳成像 系统,多种仪器和软件,需要宅观判别以及ELISA法 敏感度不够,不易用以病毒核酸枪测的缺点,从而具 备了更特异,敏感,简便,客观的优点. 荧光定量聚合酶链反应(VQ—PCR)技术原理: FQ—PCR其试剂比常规PCR试剂多了一个寡聚核 苷酸探针,这个探针带有一个荧光发光分子和一个 荧光淬灭分子,完整的探针在激光下发光分子所产 生的荧光被淬灭分子全部吸收,样品无荧光.而 PCR扩增中,Taq酶在链延长过程中,可通过自身的 5一3核酸外切酶活性降解与模板结合的特异性荧 光探针,使荧光发光分子与淬灭分子分开,从而在激 光下产生特定波长的荧光,这种荧光随着PCR扩增 过程呈动态增强,通过测定荧光强度可进行起始模 板的定量分析.FQ—PCR具有封闭反应,无需PCR 后处理;采用对数期分析,摒弃终点数据,定量准确; 定量范围宽,可达到lO个数量级;仪器在线式实时 检测,结果直观,避免人为判断,特异性强,灵敏度高 等许多优点.但此方法费用较高,设备要求高. FQ—PCR法检测60例精液标本HBV—DNA阳 性13例,阳性率为21,67%.PCR—ELISA法阳性 11例,阳性率为18.33%.两种检测方法阳性率比 较采用卡方检验,P>0.05,提示两种检验方法精液 检出阳性率无统计学意义,两种方法均可以准确检 测精液中HBV—DNA,可以了解精液感染状态,协助 临床医疗工作者开展相关医疗与咨询活动. 我们认为,采用PCR—ELISA法检测精液中 HBV—DNA对进一步研究乙型肝炎病毒入侵患者泌 尿生殖系统提供了一种新的,准确的手段. 参考文献 [1]QianwP,TanYQ.RapidquantificationofsemenhepatitisBvirus DNAbyreal—timepolymerasechainreaction[J].WorldJ.Gas— troentero1.2005,11(34):5385—5389. [2]BA,HuangTH.ExpressionofhepatitisBvirusgenesinearly embryoniccellsoriginatedfromhamsterovaandhumanspermatozoa transfectedwiththecompleteviralgenomet[J].AsianJAndrol, 2006,8(3):273—279. [3]1BA,HuangTH.DetectionandexpressionofhepatitisBvirusX geneinoneandtwo—cellembryosfromgoldenhamsteroocytesin vitrofertilizedwithhumanspermatozoacarryingHBV—DNA[J]. MolReprodDev,2005,70(1):30—36. [4]WangS,PengG.IdentificationofhepatitisBvirusverticaltrans— missionfromfathertofetusbydirectsequencing[J].SoutheastA— sianJTropMedPublicHealth,2003,34(1):106—113. (下转第22页) . 11. 《海南医学)2009年第20卷第11期 HAINANMEDICALJOURNALVo1.20No.11November2009 (上接第ll页) [5]HuangJM,HuangTH,WangYH.EffectsofhepatitisBvirusinfec— tionOI1humanspermchromosomes[J].WorldJGastroenterol, 2003,9(4):736—740. [6]周勤,姚珍薇.荧光定量PCR法检测HBV感染者精液HBV — DNA及其临床意义[J].中华传染病杂志,2003,21(6):419 — 421. [7]彭志海,郝连杰.聚合酶链反应用于肝硬变门静脉高压症病原 学研究[J].中华实验外科杂志,1995,1(3):143—144. [8]裴国强.乙型肝炎后肝硬化肝移植乙型肝炎病毒再感染检测 [J].中华实验外科杂志,2005,12(22):1464—1466. 【9]王虹,万成松.采用PCR一微板核酸杂交一ELISA技术进行 ? 22? HBVDNA基因分型的研究[J].中华微生物学和免疫学杂志, 2001,21(2):234—236. [1O]费安样,王贤理.PCR—ELISA检测TB—DNA方法学建立及 临床应用评价[J].中国检验医学与临床,2002,3(2):63— 65. [11]肖艳群.实时灾光定量PCR与PCR—ELISA在乙型肝炎病毒 DNA定量检测中的应用比较[J].检验医学,2005,20(4):319 — 320. [12]刘衍春.PCR—ELISA法检测HBV—DNA的探讨[J].江苏预 防医学.2003,14(1):62—63. (收稿日期:2009—06一l1)