基因组DNA抽提操作流程

基因组DNA抽提操作 一、 原理与意义 先用细胞裂解液对已制备好的组织匀浆充分裂解，然后用蛋白酶去除其中的蛋白，再用氯仿一次抽提（无需用酚抽提）、预备液沉淀、RNase去除RNA、乙醇再沉淀即可得到完整DNA。该适用于从人或动物的各种组织、血液、培养细胞、G+/G－细菌中快速抽提基因组DNA。抽提出来的DNA能用于几乎所有的分子生物学实验，如DNA梯度分析、PCR、限制性内切酶反应、克隆、Southern Blot分析等。 二、 试剂及其配制 抽提试剂盒购于上海生工公司，内含以下试剂： 1. TE缓冲液：PH8.0，由10 mM Tris HCl和1 mM EDTA配成。 2. RNase A（3 mg）：使用前加入300 µl无菌双蒸水，煮沸10 min后使其自然冷却后使用，-20 ℃冻存。 3. Proteinase K（12 mg）：使用前加入600 µl无菌水，分装成小份，-20 ℃冻存。 4. Cell Lysis Solution与Precipitation Solution：溶液出现絮状沉淀50 ℃加热溶解后使用。 5. 1.2 mol/L NaCl。冰冷乙醇和氯仿自备。 三、 实验器材 水浴锅、普通冰箱、1.5/2 ml离心管、移液器及枪头、紫外分光计、离心管架、剪刀、镊子、滤纸等。 四、 操作步骤 1. 组织匀浆制备：取30 mg左右新鲜组织，加600 l TE缓冲液，手工匀浆数次。 2. 细胞裂解：吸取300 µl匀浆加600 µl Cell Lysis Solution，混匀。 3. 消化蛋白：再加入9 µl Proteinase K(可适当增加)混匀，置于55 ℃水浴30 min以上（可达2.5 h），其间上下混匀几次。 4. 氯仿抽提：加入600 µl氯仿（用户自备），轻柔上下混匀，不能太剧烈，以保证DNA的完整性。 5. 沉淀：在台式离心机上，10000转/分，室温离心2 min。此时应分成三层，基因组DNA在上层中，如未能分层，表明样品与氯仿未混匀（可通过延长离心时间或增加离心速度获得上清）。取500 µl上清液，置于无菌1.5 ml离心管中，加入500 µl Precipitation Solution，混匀多次至出现絮状物，室温静置2 min。10000转/分，离心2 min。 6. 去除RNA：弃除上清，注意不要倒掉沉淀，立即加入100 µl 1.2 mol/L NaCl，轻轻振荡直至DNA样品完全溶解，加入3 µl RNase A，置于37 ℃ 10 min，以去除RNA。 7. 沉淀DNA：加入300 µl冰冷乙醇（终浓度为75％，沉淀效果最佳），－20 ℃放置10 min。10,000转/分，离心2 min。倒掉乙醇，倒置室温干燥10～15 min。若DNA量多，可再重复沉淀一次。DNA用TE缓冲液或100 µl三蒸水溶解。 五、 注意事项 1. 应避免多次冻融样品，因为每次冻融都大大降低完整DNA的产率。 2. 加氯仿充分混匀，若离心后上清不到500 l，可适当延长离心时间或增加离心速度。 3. 吸取DNA上清时，可用剪刀稍剪枪头尖部，以防止虹吸现象。 4. 操作步骤中许多数值可进行成比例改变，如上清与预备液按1:1，氯化钠与无水乙醇按1:3等。 5. 转录活性很高的组织或细菌中通常含有大量的RNA，他们可能与DNA一起被分离出来。RNA的存在并不影响PCR反应。如果需要制备RNA-free的基因组DNA。可在第6步加入200 µl的RNase A，37 ℃保温10 min即可。 6. 用分光光度计测量DNA含量按1 OD260=50 g基因组DNA；进行0.7%琼脂糖凝胶电泳判定DNA的完整性，也可以判定样品中是否有RNA。本试剂盒可抽提长抵达50kb以上的DNA。一般在DNA样品中，OD260/OD280比值大于1.8，可能存在RNA；OD260/OD280比值小于1.6，可能存在蛋白质或酚。但RNA样品中OD260/OD280比值小于2可能存在蛋白质或酚，均需要进一步纯化。 7. 通常50µl体系PCR反应中用1～5 µl DNA。