研钵以液态氮预冷

研钵以液态氮预冷 RNA extraction protocol 研缽以液態氮預冷,加入sample以研磨棒將其磨碎至粉末狀,加入0.1g sample/1ml TRIzol reagent 充分混合 離心11200rpm,10min,4? 將上清液移至乾淨的eppendorf,並將sample於室溫放置5min 加入chloroform 200 ul 將eppendorf於室溫vortex 15 sec,並放置2-3min 離心11200rpm,10min,4? 取水層並將其移至新的eppendorf中 加入isopropyl alcohol 250 ul,於室溫下放置10min 加入0.8 M Sodium citrate 125 ul及1.2 M NaCl 125 ul,至於室溫下10 min離心 11200rpm,10min,4? 去除上清液,以1 ml 75% ethanol wash 2次 以8800rpm,4? 5min 倒扣eppendoro 並將上蓋打開乾燥5-10min(未全乾) - 1 - 以DEPC water將分離出的total RNA 以55-60?溶解10min - 2 - 反轉錄作用(準備 cDNA) Reverse Transcription Total RNA (4 g) X l dT15 (500 ng / l) 1 l 2ul random primer 0.5 l 最後體積加 至13.5ul O調整各sample 體積相等 (15 or 10) l 用DEPCdd H2 70? 10 min (Program No. 57) On ice 3 min Buffer量視最5X 1st (strand buffer) 4 l 後反應總體積0.1M DTT 2 l 而定所以應該2.5mM dNTP 4 l 加5ul mix well 42? 2 min (Program No. 58) 加0.5即可 Superscript ? 1 l 在42?的溫度下加入superscript ? 勿離開PCR機器(可按PAUSE暫停) 加入superscript ?後再按Run 42? 50 min 70? 15 min 不須此步驟 加dd HO至總體積為40 l (100 ng / 2 l) - 3 - Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR reagent total : 20 l (1) DEPC-Water ----------------------- 15.04 l (2) 10x buffer ------------------------ 2 l (with MgCl) 2 (3) dNTP (2.5 mM) ------------------------ 1.6 l (4) Primer (20 M) F’ ------------------------ 0.4 l R’ ------------------------ 0.4 l PCR Cycle (1) 95 ? 1min30sec (5) cDNA ------------------------ 0.4 l 這些條件會隨著 primer不同而有(2) 95 ? 20seconds (6) Taq. (viogene) ---------------------- 0.16 l 所改變 55 ? 20 min 25 cycles 72 ? 30 min (3) 72 ? 5 min - 4 -