琼脂糖凝胶电泳检测DNA

琼脂糖凝胶电泳检测DNA (2),, 1mm.,, ,.... Niudown.COM DNA 实验类型：验证型 目的和要求 掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法 原理 琼脂糖凝胶电泳是分离、纯化、鉴定DNA片断的典型方法，其特点为简便、快速。DNA片断琼脂糖凝胶电泳的原理与蛋白质的电泳原理基本相同，DNA分子在高于其等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。DNA分子在电场中通过介质而泳动，除电荷效应 外，凝胶介质还有分子筛效应，与分子大小及构想有关。对于线形DNA分子，其电场中的迁移率与其分子量的对数值成反比。在凝胶中加入少量溴化乙锭（有毒！），其分子可插入 DNA的碱基之间，形成一种光络合物，在254~365nm波长紫外光照射下，呈现桔红色的荧 光，因此可对分离的DNA进行检测。电泳时以溴酚蓝及二甲苯氰（蓝）作为双色电泳指示 剂。其目的有：?增大样品密度，确保DNA均匀进入样品孔内；?使样品呈现颜色，了解 样品泳动情况，使操作更为便利；?以0.5×TBE做电泳液时溴酚蓝的泳动率约与长300bp的双链DNA相同，二甲苯氰（蓝）则与4bp的DNA相同。 线状DNA片段分离的有效范围与琼脂糖凝胶浓度关系 琼脂糖凝胶的百分浓度（%） 分离线状DNA分子的有效范围（kb） 0.3 60~5 0.6 20~1 0.7 10~0.8 0.9 7~0.5 1.2 6~0.4 1.5 4~0.2 2.0 3~0.1 操作方法 （1）琼脂糖溶液的制备：配0.7%琼脂糖，在沸水浴中煮沸直到完全溶解；将溶液冷却到约 50~60?，加入溴化乙锭到终浓度为0.5ug/ml。 （2）将琼脂糖溶液倒入电泳支架上，放上梳子，梳子须离开电泳支架底部1mm左右。待凝胶凝聚后，小心拔去梳子，将支架放入装有电极缓冲液的电泳槽中，电极缓冲液应淹没过 胶。 （3）电泳 取薄膜，滴加上样缓冲液和DNA样品5~10ul，混匀，用微量移液器加入样品槽中。点 样端朝负极，通电。电压为10v/cm。至溴酚蓝移到距边1cm处，取出凝胶，紫外灯下检测。 溴乙啶是一种强致突变剂，在操作和配制试剂时应戴手套。含溴乙啶的溶液不能直接倒 入下水道，应进行如下处理： 方法I：（1）每100ml溶液中加非离子型多聚吸附剂Amberlite XAD-16.29g； （2）室温下放置12小时，不时摇动； （3）用新华1号滤纸过滤，弃滤液； （4）用塑料袋封装滤纸和Amberlite树脂，作为有害废物丢弃。 方法?：（1）每100ml溶液中加入100mg粉状活性炭； （2）室温条件下放置1小时，不时摇动； （3）用新华1号滤纸过滤，弃滤液； （4）用塑料袋封装滤纸和活性炭，作为有害废物丢弃。 溴乙啶在260?分解，在条件下进行焚化后不会有危险性；Amberlite XAD–16或 活性炭可用于净化被EB污染的物体面。 试剂和器材 溶于去离子水中，定容至1L。电泳2一、试剂 时10倍稀释使用。 5?TBE溶液：54gTris，27.5g硼酸，4.6g EDTANa5?上样缓冲液：用5×TBE溶液配制0.5%溴酚蓝，再加等体积甘油混匀。 溴化乙锭溶液：5mg/ml的溴化乙锭，避光保存。 0.7%琼脂糖，用1×TBE溶液配制。 二、器材 电泳仪、水平电泳槽、紫外分析仪。 思考题 DNA在电场中的迁移率取决于哪些因素？