阳宗海中高产类胡萝卜素光合细菌的研究

丝 鱼盟型塑 纽堑巡 一 阳宗海中高产类胡萝 卜素光合细菌的研究 郭 秒 周 佳 慕跃林 黄遵锡 (云南师范大学生命科学学院，昆明，650092) 摘 要 从高原湖泊阳宗海深水层中分离到一株红细菌属色素高产菌 Yll，其生成的类胡萝 卜素 在光、酸碱和热的条件下，稳定性好。添加10mg／L Mg2 时，类胡萝卜素生成量最大，添加Fe3 和 Mn2 会降低其产量。用 12。正交优化培养基，光照 1 000~2000lux，pH7．0，300C下培养 5 d后，类 胡萝 卜素产量可以达到51．5mg／g，约360．5mg／L。 关键词 光合细菌，类胡萝 卜素，稳定性 类胡萝 b素是一种重要的天然色素u J，主 要从植物、藻类和微生物中提取，近年来从酵 母、霉菌和细菌中提取类胡萝 b素已经成为热 点，国内投入试生产的主要是红酵母、红曲霉和 光合细菌 3类[2·3l。光合细菌中的紫色非硫细 菌科由于具有分布广泛，易培养且无毒害等优 点。被大量用来开发天然色素。但到目前为止， 选取产色素的光合细菌几乎都是从土壤或污水 中分离得到，湖泊中的尤其是深水湖泊中的报 道很少。 阳宗海是云南省第 3深水湖泊，湖区常年 光照充足，温度适宜。据文献报道L4 J，深水湖 泊中 10m深度以下生活的光合细菌由于依靠 类胡萝 b素吸收到达水层的450～550 nm的蓝 绿光，所以优先在体内合成大量类胡萝 b素，往 往比浅水和土壤中的光合细菌所含类胡萝 b素 多，非常适合进行产类胡萝 b素的研究。 1 材料和方法 1．1 菌 种 红细菌 (Rhodabacter sp．)Yll：本实验室 从高原湖泊阳宗海 13 m水层分离，为类胡萝 b 素高产菌。 1．2 培养基 乙酸钠 2 g、NH4CI 2 g、KH2PO4 0．15 g、 Na2CO3 0．2g、酵母膏 0．5g，用蒸馏水溶解并定 容至 1000mL，调 pH7．0，于 121℃高压灭菌 30 第一作者：硕士研究生(黄遵锡教授为本文通讯作者)。 收稿时间：2003—07—02，改回时间：2003—09—02 (34) m lno 1．3 类胡萝 卜素的提取和含量测定 在言世贤等[5]的方法的基础上稍加改进。 将菌液于4000 r／min离心 30min，用生理盐水 洗涤菌体 2～3次，再于 12 000 r／min离心 3 min，弃上清液，菌体用酸一热处理法破壁[6l，用 丙酮抽提类胡萝 b素，粗提液在 475 nrn测定吸 光度，表示类胡萝 b素的相对含量。将抽提液 在 60℃左右蒸干，将残余物溶于少量的乙醚 中，加入等体积 10％KOH的甲醇溶液，室温静 置 1 h以上。然后用 5％NaCI水溶液萃取分 层，上层醚层用 5％NaCI水溶液反复洗涤 2次 以洗净甲醇。在 40℃下减压蒸馏得类胡萝 b 素粗制品，称重。 1．4 色素的鉴定 分别用显色反应和分光光度计扫描 2种方 法，依照参考文献[7]进行。 1．5 类胡萝 卜素提取率计算[8】 1．6 类胡萝 卜素稳定性分析[9】 1．7 影响类胡萝 卜素生成的因素 依照常规方法[加]，分析了金属离子、光照、 温度和 pH等对类胡萝 b素生成的影响。 2 结果与讨论 2．1 类胡萝 卜素制品的物理性质 由Yll菌株所提取的类胡萝 b素为橙红 色颗粒状，不溶于水，易溶于丙酮、乙醚。溶于 维普资讯 http://www.cqvip.com 乙醇后呈橘黄色，加入浓 H2SO4后，下层呈青 蓝色；加入浓 HC1后呈浅蓝色，与类胡萝 卜素 的一般反应一致。 2．2 类胡萝 卜素吸收光谱 Yll菌株所产色素的乙醇溶液经分光光度 计扫描，在475 nm有最大吸收波长，这与类胡 萝 卜素样品最大吸收峰一致，说明该菌所 产色素中含有 类胡萝 卜素。 2．3 类胡萝 卜素稳定性分析 焉1囊_熏鲁 2．3．1 光稳 定性 在日光的连续照射下，类胡萝 卜素溶液的 吸光度逐渐下降，而其损失率逐渐升高。Yll 菌株所产类胡萝 卜素对光的稳定性比较好，24 h光照后还有高于 75％的残留(大部分菌株如 红酵母和红假单胞菌所产类胡萝 卜素只有 50％左右的残留【 】)，且类胡萝 卜素颜色随光 照变化不大。结果如表 1所示。 表 1 光照对 Yll菌株产类胡萝 卜素的影响 2．3．2 酸碱 稳定 性 将类胡萝 卜素溶液调节成一定 pH的溶液 后，吸光度的测量结果及类胡萝 卜素损失率见 表 2。在 pH为 4以上的弱酸及 pill0的碱性 条件下，色素溶液较稳定，吸光度变化的程度不 大。但在 pH为 4以下的强酸条件下色素相对 不稳定，色素损失率近 4．8％，色素溶液的颜色 也由深变浅。酸碱对色素作用 10 min与作用 30min后所测得的吸光度之间差异不大，说明 酸碱对 Yll菌株的类胡萝 卜素稳定性的影响 与时间关系不大。 表 2 酸碱度对 Yll菌株产类胡萝 卜素的影响 2．3．3 热稳定 性 色素溶液经不同温度处理后测得的吸光度 及色素损失率如表 3所示。从表 3可以看出， Yll菌株的类胡萝 卜素对热有较好的稳定性。 在较低的温度条件下，经 30℃ 处理 5 h后，色 素仅损失 4．8％。随着温度的升高和加热时间 的延长，色素的破坏程度略有增大，在 70"C处 理 5h后，色素损失了约 11％。同时，伴随色素 损失率的升高，色素溶液的颜色也略有变化。 表 3 温度对 Yll菌株类胡萝 卜素的影响 2．4 影响类胡萝 卜素生成的因素 由于使用的培养基是已经正交优化的最佳 培养基，且光合细菌菌液在660nm的 OD值 与 破壁的丙酮抽提液在 475 nm的 OD值有一定 的线性关系，所以在此只考虑金属离子和环境 因素的影响。 2．4．1 金属离子的影响 据文献报道【4】，对光合细菌类胡萝 卜素生 成有明显影响的主要有 Mg2 、Fe3 和 Mn2 ， 因此只考虑这 3种金属离子。 在培养基中添加 10 mg／L的 M (表 4) 时类胡萝 卜素生成量最大，高于或低于 10me,／ (35) 维普资讯 http://www.cqvip.com 舞1冀赢告 L，类胡萝 b素生成量都会下降；Fe3 和 Mn2 的添加会随浓度的增加而使类胡萝 b素生成降 低，这与很多文献报道的此 2种离子可以促进 类胡萝 b素的合成有所不同，这不但可以简化 培养基配方，还可以免去培养基可能出现的铁 盐沉淀问题。适合工业化生产。 表 4 M 对类胡萝 卜素生成的影响 ： ： ： OD475 0．629 0．735 1．110 0．907 0．740 0．708 0．698 l2 l 0-8 ％ n4 0．2 0 0 0．5 l_5 2 2．5 3 3．5 和 Mn 浓度ling·L 图 1 Fe3 、Mn2 对类胡萝 b素合成的影响 0 50 100 150 图2 温度对类胡萝 b素合成的影响 2．4．2 温度的影响 温度的影响涉及到菌体的生长量和类胡萝 b素的生成。从图2可以看出，对 Yll菌株而 言，20～30℃是菌体生长的最适温度，30℃培养 3d以后，类胡萝 b素的产量就有超过 20℃条 件下产量的趋势，此后的 2 d内产量也始终处 于上升的状态。而在 40℃时，生成量始终比较 低，由此可见，高温并不利于 Yll菌株的类胡 (36) 萝 b素的生成。 2．4．3 光照的影响 从表 5看出，太强或太弱的光照都不利于 类胡萝 b素的大量合成，在 1 000～20 000 lux 光照范围内，菌体生物量和类胡萝 b素生成量 都比较高。 表 5 光照对类胡萝 卜素生成的影响 光照强度／lux 500 1 000 1 500 2000 2500 3000 OD475mn 0．893 1．234 0．997 0．951 0．796 0．583 ODoso~ 0．715 1．039 1．002 0．928 0．612 0．397 2．4．4 pH 的影响 由于 Yll菌株的最适生长 pH范围为 6．0 ～ 8．5，低于 6．0或高于 8．5的 660 nm处的 OD值都低于0．1，所以这里只考虑 6．0～8．5 的pH范围。由表 6可以看出，Yll菌株产类 胡萝 b素的最适 pH为 7．0，在 6．5～7．5范围 内都有较高的产量。 表 6 pH对类胡萝 卜素生成的影响 ： ： !： !： 璺： 璺： OD475 0．468 0．997 1．276 0．981 0．736 0．583 OD660 0．315 0．899 1．091 0．826 0．663 0．476 2．5 Yll菌株类胡萝 卜素的得率 在最适 培养基 12#(另添加 0．01％的 Mg2 )和最适培养条件下培养 Yll菌株，并提 取类胡萝 b素。根据计算，Yll菌株类胡萝 b 素粗制品的提取率为 51．5mg／g，大约为 360．5 mg／L，高于国内外报道的产量(一般在 0．5～ 45 mg／g)属于类胡萝 b素高产菌株。 3 小 结 (1)首次从高原深水湖泊中分离大量生长 在深水区的光合细菌，并从中挑选出了一株类 胡萝 b素高产菌 Yll，提取率可以达到 51．5 mg／g，大约为360．5mg／L。高于目前国内刘春 朝uIJ报道的 312 mg／L，并远远高于红酵母的 产量(10～200 mg／L)及基因工程菌产类胡萝 卜素菌的产量(0．5～1．5mg／g)~ ]。从 Yll中 提取的类胡萝 b素对光、酸碱以及热的稳定性 都比较好，且培养基中不需要添加可能会造成 培养基浑浊的铁离子，因此十分适合工业化生 产。 维普资讯 http://www.cqvip.com (2)光合细菌中类胡萝 卜素的提取中，要通 过皂化去除细菌叶绿素。红细菌属的光合细菌 所含的细菌叶绿素a与植物叶绿素 a结构很相 似，而由叶绿素制成的叶绿素铜钠是我国食品 工业中唯一允许使用的绿色色素[n]，因此在今 后的研究中，可以考虑提取类胡萝 卜素的同时， 分离出细菌叶绿素 a，使菌体得到更充分的利 用。 致谢：在实验水样采集过程中，得到了昆明环境 监测中心和宜 良环境监测站的大 力协助。特此 表示感谢。 参 考 文 献 1 王业勤，李勤生 ．天然类胡萝 卜素[M]．北京：中国 医药科技出版社，1997 2 韩雅珊．类胡萝 卜素的功能研究进展[J]．中国农业 大学学报。1999，4(1)：5～9 3 Takaiehi Schiniehi．Carotenoid pigments from Rhococcus rhodochrous RNMS[J]．Agn Bio Chem。 嗣 鲁 1990。54(8)：1 934～1 937 4 刘如林 ．光合细菌及其应用[M]．北京：中国农业 科技出版社，1991 5 言世贤 ．光合细菌红色类胡萝 卜素的提取和研究 [J]．上海交通大学学报。1991。25(5)：73～78 6 杨 文，吉春明 ．一种简单的胞壁破碎方法[J]．微 生物学通报，1995，22(1)：58～59 7 颐 青 ．光合细菌 R1发酵产类胡萝 卜素的研究 [J]．食品与发酵工业。2001。27(10)：24--28 8 赫常明 ．光合细菌中类胡萝 卜素的提取及性质的 研究[J]．天津轻工业学报。1999，(3)：5～l1 9 李东风 ．沼泽红假单胞菌类胡萝 卜素稳定性 的研 究[J]．浙江农业学报，1998。10(2)：9O～93 lO 王宇新，钱新民 ．光合细菌类胡萝 卜素的研究 [J]．海洋湖沼通报，1998(4)：32～37 l1 刘春朝。欧阳藩 ．一株类胡萝 卜素高产菌 S2的研 究[J]．生物技术，1995。5(3)：22--25 l2 陶 俊 ．类胡萝 卜素合成的相关基因及其基因工 程[J]．生物工程学报。2002。18(3)：276～281 l3 罗庆锋 ．叶绿素的研究进展及叶绿素的开发利用 [J]．林产化工通讯，1995，(1)：32～33 PhOtOsynthetic Bacteria for High Yield Production of Carotenoid Pigment in Yangzonghai Lake Guo Miao Zhou J ia Mu Yuelin Huang Zunxi (I)epa~ment of Life Science，Yunnan Normal University。Kunming。650092) ABSTRACT A strain of Rhodabacter Y11，which contains high content of carotenoids，was isolated from deep level of Yangzonghai lake in Yunnan province．It is indicated that the pigment is not suseep． tible to heat，acid／alkali or sunlight．The yield of carotenoid was improved by 10 mg／L Mg2 added to the culture medium but was reduced by Fe3 and M n2 ． The Y1 1 strain was cultivated for 5 days in the interactive optimum medium 12 under the following conditions：1000～2000lDX，pH7．0，30℃ ． And the yield of carotenoid reached 57．5 mg／g or about 432 mg／L． Key words Photosynthetic bacteria，carotenoid pigment，stability，synthesis of carotenoid 行 克 葡 静天 ‘ 资生；声誊 业 2003年 lO月 14日，丹麦丹尼斯克集团与中国河南天冠集 团有限公司签署合资，生产黄原皎。 丹尼斯克占80％股份，由丹尼斯克添加剂分部负责管理。合资企业名称为丹尼斯克天冠(南阳)有限公 一 司，年生产黄原胶能力为2 000t。据了解，世界黄原胶需求量为 4～5万 t／a，其中60％用于食品和制药 领域。目前正以 5％的年增长速度增长。丹尼斯克集团在中国已建立多种食品添加剂工厂，此次合资项 目强化了集团在中国的业务。集团希望借助此次合资项 目巩固其在全球食品添加剂市场上的地位．丹 尼斯克天冠(市阳)有限公司可以受益于丹尼斯克集团强大的全球销售网络、创新中心和技术服务设施。在合资之 前，工厂生产的黄原胶主要供应中国市场，而现在的目标是国际食品市场，主要是欧洲和美国市场。 |(37) 维普资讯 http://www.cqvip.com