三七和栀子有效成分对AD转基因小鼠早期脑内淀粉样蛋白清除作用的研究

中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Feb；28(2)：173～9 ·173· 网络 出版时 间：2012—2—8 9：58 网络 出版地址 ：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20120208．0958．026．html ◇论 著◇ 三七和栀子有效成分对 AD转基因小鼠 早期脑内淀粉样蛋白清除作用的研究 张 颖，林森相，华 茜，杨开宇，姚 娜，易六书，王爱敏，陈文举，陈金燕 (北京中医药大学基础医学院，北京 100029) doi：10．3969／j．issn．1001—1978．2012．02．007 文献标识码 ：A 文章编号：1001—1978(2012)02—0173—07 中国图书分类号：R-332；R284．1；R322．81；R341；R745．702．2 摘要 ：目的 研究三七和栀子有效组分 (三七总皂苷和栀子 苷)对APPV7171转基因小鼠脑内淀粉样蛋白的影响。 转基因小鼠辛6各半，分别随机分为三七和栀子有效成分 高剂量组，中剂量组，低剂量组，阳性药安里申组，模型组。 阴性对照组为同窝出生的野生型小鼠。小鼠自3月龄开始 自主进食给药 3个月，进行免疫组织化学、Western blot、 ELISA实验，海马和皮层区淀粉样蛋白AI3 。、At3。 ：，降 解酶 IDE和 NEP的表达水平。结果 在 早性小鼠各组 中， 三七栀子中剂量组能够明显降低其脑内X13 的水平，且淀 粉样蛋白的主要降解酶之一IDE的水平也有升高的趋势；而 在 6性小鼠各组中，三七栀子的作用并不明显。结论 三七 和栀子有效成分可能通过促进 113的降解来降低 早小鼠 AB 水平，对 6小鼠作用不明显。 关键词：阿尔采末病；三七；栀子；淀粉样蛋白；NEP；IDE AD是一种神经退行性疾病，老年斑是阿尔采 末症的特征性病变之一，其主要成分是 B一淀粉样蛋 白(amyloid B—protein，Ap)。p一淀粉样蛋白假说是当 今AD研究中较为流行的学说，认为A13在患者脑内 过量产生和聚集引发了病理级联反应，最终导致神 经元功能紊乱并死亡，从而引起病理性痴呆。A13是 一 种在正常情况下脑内可持续产生的蛋白，但机体 通过有效的清除措施阻止A13聚集。在AD病程中， A13的产生和清除失衡 ，过多的A13聚集成为可溶性 收稿日期：2011—10—14，修回日期：2011—11—17 基金项 目：国家自然科学基金青年项目(No 30500682)；国家自然科 学基金面上项 目(No 81072901)；教育部新世纪优秀人才 (No NCET-07-0116) 作者简介 ：张 颖(1986一)，女 ，硕士生，研究方向：分子药理学，E— mail：zhangying86124@ sina．com； 林森相(1989一)，男，硕士生，研究方向：老年痴呆症，E- mail：lin — senxiang@163．corn，共同第一作者； 华 茜(1975一)，女，研究员，博士生导师，研究方向：中 西医结合治疗脑血管疾病的应用基础，通讯作者，Tel： 010-64286190，Fax：010-64286871，E—mail：hqianz@ yahoo． 寡聚体，产生神经毒性 J。而A13“酶降解作用”是 其较为重要的清除机制 。增加 AB从体内的清 除，重建 A13代谢平衡，可望成为一个新的治疗方 向。 A13降解酶主要包括胰岛素降解酶(insulin-de— grading enzyme，IDE)、脑肽啡酶(neprilysin，NEP)、 内皮素转换酶、血管紧张素转换酶以及纤溶酶等。 IDE与NEP是脑中最有效的AB降解酶。皮层神经 元体外培养实验表明A13能被IDE降解成没有神经 毒性的片段，不易于形成淀粉样沉淀 J。在人大脑 组织中也发现内源性的 IDE能够降解合成的 A13单 体 。最近大量研究表明 IDE能够降解 A13 4。和 Ap _5一 。在病理条件下，尤其是 AD脑中，IDE活 性明显下降 J。有研究指出在 IDE缺乏的小鼠模 型上，AB的水平明显升高 -91。NEP是另外一种 A13降解酶，大鼠脑内注射合成的 A13肽的研究显示 NEP是降解 AB 的关键酶 ¨。在 NEP不足的年 轻小鼠大脑内，内源性稳态 AB含量增高 ¨。NEP 敲除的小鼠脑内，A13的水平在海马、皮质、丘脑／纹 状体以及小脑等区域有所变化 。 因此，促进 A13的清除对于痴呆治疗和预防具 有明显的临床意义，寻找能够恢复 A13生成与降解 平衡的药物成为 AD治疗的一种选择。栀子和三七 的主要药效成分京尼平苷(geniposide)、京尼平苷酸 (geniposidic acid)和人参皂苷 Rgl(ginsenoside Rg1) 组成。本课组前期研究发现，采用海马注射 A13 的拟 AD大鼠模型，三七和栀子有效成分能够明显 改善动物在 Y迷宫中的学习记忆能力 。采用 APPV7171转基因小鼠模型，其能够明显改善动物在 水迷宫中的学习记忆能力，预防性用药和早期用药 都具有很好的改善作用。对其作用机制的初步研究 提示，药物能够提高海马区神经元数目，增加突触囊 泡上突触素的表达，改善神经可塑性。在细胞水平 上，采用A13干预原代培养的海马神经元，模拟 AD 脑中受损神经元状态，实验表明三七和栀子有效成 分可以明显增加受损神经元的存活率，提高受损神 · 174· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Feb；28(2) 经元的线粒体活性，有效增加神经元突起的数目及 长度，预防性用药与后用药均显示良好的效果，与动 物实验结果一致。在注射AB的拟AD大鼠模型中， 三七和栀子有效成分能够提高大鼠皮层和海马的 IDE与 NEP的表达量，因此三七和栀子有效成分治 疗痴呆的作用机制可能与At3的清除相关。为了进 一 步研究三七和栀子有效成分的作用机制是否与 AB清除相关，采用 APPv717I转基因小鼠作为 AD 动物模型，检测 At3的表达变化量以及 IDE与 NEP 的含量变化。 1 与方法 1．1 材料与试剂 三七和栀子的有效成分(三七 总皂苷和栀子苷)由天津市合谊生物科技有限公司 提供。阳性对照药安理申(每片含盐酸多奈哌齐5 mg，生产批号：070624，分装批号：070624A)由卫才 (中国)药业有限公司制造。用生理盐水将栀子苷 溶解成7．2 g·L～，三七总皂苷 6．67 g-L～，安里 申0．605 g·L 的浓度使用，现用现配。Super Poly． mer一二步法IHC试剂盒(康为试剂，CW0117)；免疫 组化一抗 4G8(1：500，Signet Laboratories，Dedham， MA)；DAB显色试剂盒(康为试剂，CW0125)；照相 系统 (Nikon Eclipse 50i)；ELISA试剂 盒 (At3 。 ELISA Kit，Invitrogen—Biosource，KMB348 1；AI3】_42 ELISA Kit，Invitrogen—Biosource，KMB344 1)；蛋白裂 解液 RIPA(Topbio，R0278)；蛋 白酶抑制剂 PMSF (Amresco 0754)；BCA法蛋白定量试剂盒 (Pierce， 23225)；Western blot一抗(IDE，1：2 000，Abcam公 司，ab32216；NEP，1：1 000，epitomics，2596-1；B—ac— tin，1：10 000，康为世纪公司，CW0096a)；二抗(山 羊抗小鼠IgG1：10 000，康为世纪公司，CW0102；山 羊抗兔 IgG 1：10 000，康为世纪公司，CW0103)； ECL发光液(pierce，32109)；3月龄的APPV7171转 基因小鼠以及同品系 C57BL／6J阴性对照小鼠，购 自中国医学科学院。 1．2 实验分组及给药 将成模后小鼠随机分 组，分别为 6性用药高剂量组(MHD)，中剂量组 (MMD)，低剂量组(MLD)，阳性对照药组(MA)，模 型组(MM)，野生型组(MNC)；早性用药高剂量组 (FHD)，中剂量组(FMD)，低剂量组(FLD)，阳性对 照药组(FA)，模型组(FM)，野生型组(FNC)，每组 7只，共12个组别。在无菌环境中生长，体质量20 g左右，水和食物规律给予，使其能够自取，每 12 h 昼夜交替，强制给药 3个月。 1．3 体质量检测 从转基因小鼠进入动物房起，每 只小鼠每周测量体质量1次，每周的小鼠体质量均 与第 1周相减，做出时间与体质量变化相关线性图。 1．4 免疫组化 断头取材，一个半球放入 4％多聚 甲醛溶液固定；另一半将海马和皮质分离，分装到冷 冻管放人液氮保存，用于做生化检测。大脑半球冠 状石蜡切片 8 m厚，用于免疫组化。首先脱蜡至 水，然后用枸橼酸盐缓冲液进行抗原修复，用 H：O： 消除内源性过氧化物酶，随后按照 Super Polymer．二 步法 IHC试剂盒操作，一抗选择4G8孵育4~C过夜， 再用 DAB显色试剂盒显色，最后用苏木精复染。运 用 Nikon Eclipse 50i成像系统照相。选取海马区， 齿状回等部位，在物镜为4×、20×的视野下摄取图 像。 1．5 ELISA检测 A o和 A 各组小鼠脑内的 Ap 4。和Ap1-42用酶联免疫法检测。脑组织称重后用 甲酸(1／6皮质用300 1甲酸)超生粉碎 10 S，冰上 操作。17 000 r·min～，4℃离心 1 h。离心后液体 分为 3层，上层为脂类，底层为细胞碎片，中间层为 含 Ap的组织液，取中间层组织液70 l加入到另一 EP管中，并加入700 Ixl 3 mol·L Tris液混匀。用 ELISA试剂盒中的样品稀释液将样品稀释 1倍，置 于冰上备用，随后按照ELISA试剂盒说明操作，最 后用酶标仪在450 nm下测值。采用统计软件SPSS 11．O进行统计分析，用单因素方差分析(One．way ANOVA)进行组间比较。 1．6 Western blot检测 IDE、NEP 在组织样本中 加入蛋白裂解液 RIPA和蛋白酶抑制剂 PMSF，冰上 匀浆(1／6皮质：RIPA 300 txl，PMSF 30 txl；1／2海 马：RIPA 150 Ixl，PMSF 15 tx1)。冰上静置 30 rain， 12 000 r-．min。。，4℃离心 20 min，取上清。采用 BCA法对提取的蛋白样本进行蛋白定量。5×上样 缓冲液，按缓冲液与蛋白体积比4：1的比例加入上 样缓冲液，100cC加热 5 min，一20℃保存，用前 100oC加热 5 rain。Western blot检测试验，5O g蛋 白上样量，电压 100 V电泳 100 rain，100 V转膜60 rain。TBS洗 10 min，5％牛奶封闭液封闭 1 h，加一 抗4℃孵育过夜，用TBST配制的5％牛奶洗3次，每 次10 min。二抗室温孵育1 h，TBST洗3次，每次l0 min。用ECL发光液发光，x线片显影。采用统计 软件 SPSS 11．0进行统计分析，组间数据比较用单 因素方差分析(One—way ANOVA)。 2 结果 2．1 体质量变化 运进小鼠第一周体质量普遍下 滑，随后每周，各组小鼠体质量均呈小幅增长状态； 早性小鼠的体质量增长幅度小于6性；早5小鼠的 用药高剂量和低剂量组体质量增加较明显，与模型 · l78· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Feb；28(2) 块的主要成分，A[3 越水平的降低也就表明淀粉样斑 块沉积的几率减少，说明三七和栀子有效成分，尤其 是中剂量能够降低早性转基因小鼠脑内淀粉样斑块 的形成。安理申是乙酰胆碱酯酶抑制剂，其作用靶 点不在 AB，实验结果与理论相吻合。而 早、6小鼠 间AB 加和 AI3 表达水平的差异可能是由性激素 引起的偏差。 Fig 6 A：IDE／13"actin value in hippocampus and cortexes of mice by Western blot detection；B：NEP／13-actin value in hippocampus and cortexes of mice by W estern blot detection Western blot结果显示治疗组与模型组比较：海 马和皮质区域的蛋白表达量趋势相同；但三七和栀 子的有效成分的作用有着明显的性别差异： 性用 药组 AI3 表达量明显减低，而 IDE有小幅的增长， 说明药物可能增加了Af3降解酶的表达，进而促进 AB的清除。NEP没有出现明显的变化，是因为其 主要降解不可溶的AI3，而由于该月龄小鼠处于AD 发病早期，脑内没有产生淀粉样斑块，不可溶的AB 含量微弱，故没有引起NEP的激活。6性各组别的 各项指标表达变化差异未显现显著性，与前期动物 行为学检测结果较为一致。 以上实验结果推论：安理申属于胆碱酯酶抑制 剂，没有降解AB的作用。在预防早期阿尔采末症 阶段，三七和栀子的有效成分有可能通过增加降解 酶的表达，来清除早性小鼠脑内多余的At3，但其对 6性小鼠的作用并不明显。此外，同组 6小鼠的 指标含量差异也指出，药物作用于 AB有可能是类 早激素的原理，但具体的作用机制，有待更进一步的 研究。 参考文献： [1] Yamin G，Ono K，Inayathullah M，Teplow D B．Amyloid beta- protein assembly as a therapeutic target of Alzheimer’s disease[J]． Curt P n Des，2008，14(30)：323l一46． [2] La Ferla F M，Green K N，Oddo S．Intracellular amyloid．beta in Alzheimer，s disease[J]．Nat Rev：Neurosc，2007，8(7)：499—509． [3] De Strooper B，Saftig P，Craessaeas K，et a1．Deficiency ofpreseni— lin—l inhibits the normal cleavage of amyloid precursor protein[J]． Nature．1998．391：387—9O． [4] P6rez A，Morelli L，Cresto J C，et a1．Degradation of soluble amy- loid beta-peptides 1．4O．1-42，and the Dutch variant 1-4OQ by in- sulin degrading enzyme from Alzheimer disease and control brains [J]．Neurochem Res，2000，25(2)：247—55． [5]Kurochkin I V，Goto S．Alzheimer’s 3-amyloid peptide specifically interacts with and is degraded by insulin degrading enzyme[J]． FEBS Lett，1994，345(1)：33—7． [6] McDermott J R，Gibson A M．Degradation of Alzheimer’s t3-amyloid protein by human and rat brain peptidases：involvement of insulin— degrading enzyme[J]．Neurochem Res，1997，22(1)：49—56． [7] Mukherjee A，Song E S，Kihiko M，et a1．Insulysin hydrolyzes amy— loid beta peptides to products that are neither neurotoxic nor depos— it on amyloid plaques[J]．J Neurosci，2000，20(23)：8745—9． [8] Miller B C，Eckman E A，Sambamurti K，et a1．Amyloid—beta pep— tide levels in brain are inversely correlated with insulysin activity levels in vivo[J]．Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(10)：6221 — 6． [9] Farris W，Mansourian S，Chang Y，et a1．Insulin-degrading en— zyme regulates the levels of insulin，amyloid beta-protein，and the beta—amyloid precursor protein intracellular domain in vivo[J]． Proc Natl Acad Sci USA，2003，100(7)：4162—7． [10]Turner A J，Tanzawa K．Mammalian membrane meta110peptidases： NEP，ECE，KELL and PEX[J]．FASEB J，1997，11(5)：355— 64． [1 1]1wata N，Tsubuki S，Takaki Y，et a1．Metabolic regulation of brain Abeta by neprilysin[J]．Science，2001，292(5521)：1550— 2． [12]Yasojima K，Akiyama H，McGeer E G，et a1．Reduced neprilysin in high plaque areas of Alzheimer brain：a possible relationship to deficient degradation of beta—amyloid peptide[J]．Neurosci Lett， 2001，297(2)：97—100． [13]Liu Y，Hua Q，Lei H T，Li P T．Effect ofTong Luo Jiu Nao on AB— degrading enzymes in AD rat brains[J]．J Ethnopharmacol，201l， 137(2)：1035—46． [14]秦 川，朱 华，张兵林，等．阿尔茨海默病转基因动物模型脑 组织病理学及免疫组化研究[J]．中国实验动物学报，2000，8 (4)：213． II 0甲 ＼ 口H II 譬_q，d Z 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2012 Feb；28(2)：179—84 ·179· 网络 出版 时间：2012—2—8 9：48 网络 出版地 址 ：http：／／www．cnki．net／kcms／detailZ34．1086．R．20120208．0948．004．html 熊果酸通过 STAT3通路调控胃癌细胞增殖和凋亡 唐 丹 ，李剑萍。，郑锡凤 ，何晓璞 ，徐 伟 ，邵 耘 ，薛绮萍 ，孙为豪 (1．南京医科大学第一附属医院老年消化科，江苏 南京 210029；2．盐城市第一人民医院肿瘤科，江苏 盐城 224005) doi：10．3969／j．issn．1001—1978．2012．02．008 文献标识码：A 文章编号：100l一1978(2012)02—0179—06 中国图书分类号：R284．1；R329．24；R329．25；R735．202．2； R979．1 摘要：目的 研究熊果酸对环氧合酶一2(cyclooxygenase-2， COX一2)表达或不表达胃癌细胞增殖和凋亡的影响，探讨信 号转导与转 录活化因子 3(signal transducer and activator of transcription 3，STAT3)通路在熊果酸调控胃癌细胞增殖和 凋亡中的作用。方法 SGC-7901和 MGC．803细胞接种于含 10％胎牛血清的 RPMI 1640培养液中，常规培养 24 h后加 收稿 日期：2011—10—31，修回日期 ：2011—11—18 基金项目：国家 自然科学基金面上项 目(No 81072030)；江苏省卫生 厅“135工程”医学重点人才基金项 目(N0 Rc2007o46) 作者简介：唐 丹(1987一)，女，硕士生，研究方 向：胃癌防治，E— mail：justwaiting87@sina．com； 孙为豪(1963一)，男，教授，博士生导师，研究方 向：胃肠 道肿瘤的分子生物学，通讯作者，E—mail：weihaosun@hot— mail．corn 熊果酸(10、20、40、80 txmol·L )，分别培养 24、36和48 h， MTT法检测细胞增殖。Hoechst染色观察细胞凋亡的形态变 化 ，流式细胞仪检测细胞凋亡率；免疫印迹法检测 STAT3、磷 酸化 STAT3(p-STAT3)、COX-2、半 胱天冬 酶一3酶原 (pro— caspase-3)的表达。结果 熊果酸剂量和时间依赖性抑制 SGC-7901和 MGC一803细胞增殖；Hoechst染色显示熊果酸作 用两种 胃癌细胞后发生了典型的细胞凋亡形态学改变 ，1O、 20、40、80 m01·L 熊果酸作用 SGC-7901和 MGC-803细胞 24 h后的凋亡率分别为：(4．7±0．4)％和(3．3±0．2)％、 (6．4±0．5)％和 (4．6±0．3)％、(9．9-4-1．8)％和 (6．8± 0．5)％ 、(14．5±1．7)％和(10．3±1．6)％；熊果酸剂量依赖 性抑制 SGC-7901和 MGC一803细胞中STAT3磷酸化，下调 SGC一7901细胞 COX-2和 MGC-803细胞 procaspase-3表达。 结论 熊果酸可能通过阻断 STAT3通路下调COX-2或 pro— aaspase一3表达而抑制胃癌细胞增殖 、诱导凋亡。 关键词 ：熊果酸；胃癌；环氧合酶一2；半胱天冬酶一3酶原；增 殖；凋亡 [14]Qin C，Zhu H，Zhang B L，et a1．Pathomorphological and Immu— nohistochemical Findings in Brains of APP Transgenic Model[J]． Acta Lab Animal Sci Sin，2000，8(4)：213． [15]秦 川I，朱 华，常 洋，等．阿尔茨海默症转基因小鼠的初步 行为学评价[J]．上海实验动物科学，2000，20(4)：210． [15]Qin C，ZhuH，ChangY，et a1．The Behavior evaluation ontrans— genie mice of Alzheimer，s disease[J]．Shanghai Lab Animal Sci， 2000，20(4)：210． Research on the mechanism of the active ingredients of Sanchi and Gardenia removing the early amyloid in the AD transgenic mouse brain ZHANG Ying，LIN Sen—xiang，HUA Qian，YANG Kai—yu， YAO Na，YI Liu—shu，WANG Ai—min，CHEN Wen-ju，CHEN Jin—yan (School ofPreclinical Medicine，Beijing University ofChinese Medicine，Beo'ing 100029，China) Abstract：Aim To investigate the effect of the active ingredients of Sanchi and Gardenia(PNS and Genipo— side on the amyloid in the APPV7 l 7 I transgenic mouse brain．M ethods Transgenic mice were divided into halves：the male and the female．And each was randomly divided into high dose， middle dose，low dose treatment groups， positive control and model groups．The negative control are wild-type littermates mice．The expression levels of hippocampus and cortex amyloid Ap1．40，AI3142 and degrading enzyme IDE and NEP in hippocampus and cortex were examined by im— munohistochemistry methods，Western blot and ELISA tests after behavior detection when the 3 months old mouse took the drug for three months．Results In the female groups， Sanchi and Gardenia middle dose groups show significantly reduced brain levels of AI342 but slightly increased levels of degrading enzyme IDE， however，in the male groups，the effect is not obvious． Conclusion The active ingredients of Sanchi and Gardenia possibly lower levels of AI342 in the female groups by promoting the degradation of AI3，but the effect on the male groups is not obvious． Key words：Alzheimer’s disease；sanchi；gardenia；am— yloid；NEP；IDE