【doc】辽宁地区7型人腺病毒基因组型研究

【doc】辽宁地区7型人腺病毒基因组型研究 辽宁地区7型人腺病毒基因组型研究 第1g卷第1期 1990年 中国医科太学 JOURNAL0FCHINAMEDICALUNIVERSITY Vo1.19NO.1 辽宁地区7型人腺病毒基因组型研究 任常山陈虹赵慧林侯立新富维强 (肿瘤研究所) 刘兰青 (儿科研究所) 提要应甩限制性内切酶BamHI,Hind?~,EceRI辞最近由小 儿肺炎和急性上呼吸道感染患者分离到的7型人嗦病毒分离株(7l株) 的基因DNA进行了切断点分析,结果发现辽宁地区流行的两个新基因 组型. 关键词腺耦毒}基因组型,切断点 隙病毒(Adenovirus简称AdV)是以人 和多种动物为自然宿主的DNA型病毒.腺 病毒既有能引起呼吸系统,消化系统疾病 和结膜炎的病原性n,2],又有0对啮齿类动 物及其培养细胞的致癌性[],是代表性的 DNA型肿瘤病毒.7型人隙病毒(Ad7)经 常是严重呼吸系疾病之病原体.在我国北 方婴幼儿隙病毒肺炎高于呼吸遭合胞病毒 肺炎居首位[?].因此,正确诊断腺病毒感染 及监测其流行规律具有十分重要的意义. 1978年以来瑞典Wadell等相继报遭了用限 制性内切酶分析法发现腺病毒的基因组 型,作者也在1984年报道用内切酶分析祛 发现Ad4的新基因组型],本研究应用限 制性内切酶分析法对辽宁地区1982年, 1986年闻人腺病毒7型分离株(7l株)的 基[]DNA与其括准株怍了比较分析,结果 如下._ 丰士料与方诰 一 ,病毒 标准株Ad7使用TAd7Greider株(日 本札幌医科大学藤永慧教授提供),分离 棒Ad7均由1982年,1986年辽宁埤区急性 呼吸系感染患者分离而得.分离株病毒均 经中和试验及血球凝集抑制试验鉴定为7 型人腺病毒,标准株和分离株病毒均用 KBIII细胞感染增殖. 二,病毒感染细胞 KBN细胞用含7小牛血清的Eagles minimumessentialmedium培养基培养成 单层后,按MOI—IOPFU/cell接种隙病毒, 37.C培养至细胞出现明显病变. 三,病毒DNA和病毒感染细胞DNA 的制备 应用GreenandPina的方法[6]和本室 的方法制备病毒DNA及病毒感染细胞 DNA. 四,酶 限制性内切酶EcoRI,HindnI和Bam HI}EcoliDNA聚合酶I和T{DNA聚合 酶均购自BoehringerMannheim公司 五,AdTDNA的切断及其DNA片断之 分离 按活性标准加AdTDNA和限制性内切 酶,反应混合液的组成是BamHI:6retool/ Tris-HC1(pH7.5)6mmol/LMgcl2, 2Ommol/KCl,6retool/L/3一mercaptoethan9J ?2? EcoRI:lOOramol/L'l~is—HC1(pH7.5),i0 mmol/LMgc12,50mmol/i,NaC1;HindI!I: 20mmol/LTris—HC1(pH7.4),7rcmoI/L MgC1237.c保温消化后,用琼脂糖凝胶 电泳分离各限制性内切酶降解的DNA片 段. 六,P标记病毒DNA 按Nicktranslation法啪将P标记于 Ad7病毒DNA,用DNA聚合酶反应法【e]作 病毒DNA末端标记. 实验结果 一 ,分离株Ad7DNA分子量的测定 用标准株Ad7(Greiderstrain)DNA 的}Iintl~I和BamHI片段和高分子量的 charon4ADNA的EccRI片段做分子量标 记,并依此计算出分离株AdTDNA的各种 限制性内切酶降解片段的分子量(表1). 表1Ad7分离株DNABamHI片段分子量 二,Ad7分离株7I株的限制性内切酶 降解图形 i.限制性内切酶EcoRI降解片段: Ad75~-离株DNA用Ec0RI降解时产生 图1Ad7DNA的EcoRI P,标准株,I Hinfl~和BamHI辟解电诛躅型 .Ad7? Ad7I,? a和b两个片段,与标准株Ad7的EcoRIA 和B片段大小相同,垒部分离株Ad7的Eco RI降解图型相同(图1,EccRI). 2.限制性内切酶Hind?降解片段; 限制性内切酶I-Iilldm降解全部分离株 Ad7DNA成a,儿O个片段,分别与标准株 Ad7DNA的Hind1]IA~J片段大小相同(图 1,Hind?). 3.限制性内切酶BamHI降解片段: 用]3amHI降解时,分离株Ad7DNA 的降解图形可分成两个类型(图1,BamH I,?,?),I型分离株Ad7l~BamHI 降解片段有a~jl0个片段,其中abefg hij8个片段与标准株Ad7的BamHIAB DEFGHI大小相同,与标准株不同的是分 离株新增加两个片段BamHI—c(4095碱 'lunit E州 '3? 基对,bF)~CEamHI一(:(3640bP),标准株的 BamHI—c消失.?型分离株Ad7的BamHI 降解片段为a,j0个,其中分离株的efgh i,54"片段与标准株的EFGHI大小相 同,?型分离株出现的BamHI?a(12630 bP),BamHI—b(8650bp),BamHI—c (4095bp),BamHI—d(3640bp)4个片段与 标准不同.I,?型之间的区别点在于I型 分离株有PamHI—a(9450bp)和BamHI—b (8505bp)和BamHI—c(3325bp)3个特异 片段,?型分离株有BamHI-a(12630bp) 和BamHI—b(8650bp)两个特异片段. 4.分离株Ad7的酶切点分析: Ad7标准株(Greiderstrain)和I, ?型Ad7分离株DNA的EcoRI,Hind1R和 BamHI切断点地图如图2所示,标准株 a1O203o40596o70?So1oo 』^d7p 9『^d7I L__JAd7I】 L—J^dTp 三一_jM7I 旦—J^d7 ^d7p M7】 止id州 图2Ad7分离株DNAfigEcoRI,Hind~~BamHI切点目 Ad7和分离株Ad7的EccRI切断点均为一 个(87.4地图单位,mu),标准株Ad7和分离 株Ad7的Hindm切断点均为9个'4.3,8.1, 17.5?29.2,51.4,64.4,70.5,79.1, 84.0mu).I,?型分离株的EcogI和 Hind?切断点与标准株相同,~EBam-HI 切断点图~:Ad7标准株和分离株的切断点 位置有明显不同.标准株和分离株1型的 切断点均为9个,分离株?型的切断点为 8个.I型分离株与标准株的区别是I型 ?4? 分离株有71.6rru的切断点,?型分离株 与标准株的区别是?型分离株有34.6和 82.4mu的切断点,可见I型和?型分离 株的BamtlI切断点位置与标准株明显不 同,同时,分离株丽型之间BamHI切断 点位置也有明显差异.?这些变异的t~amH I切断点位于腺病毒的后期mRNA转录领 域LILzL.L'L,即I型分离株的71.6地 图单位,?型分离株的34.6地图单位和 82.4地图单位. 三,分离株Ad7基因组型的鉴定 综上所述,可以根据分离株AdTBNA 的EccRI和hind?降解片段与其标准 株相同,而13amHI降解片段与其标准株 不同之特点将分离株A67分成哺个基因组 型,命名为Ad7I和Ad7?.辽宁地区1982 年至1985年间Ad7I型和Ad71I型均有分 离,而1986年只分离到Ad71I型,说明辽 宁地区1982年N1986年Ad7流行是以?型 为主两型同时存在,并逐渐向?型移行. 讨论 应用限制性内切酶分析法进行病毒性 疾病的流行病学研究,其重要意义是-1. 解决了血清学鉴定时出现型闻交差反应或 因血球凝集抑制试验与中和试验结果不一 致而造成的无法定型之难题.2.更重要的 是可以鉴别同一血清型内的各基因组型 (亚型).同时,病毒感染细胞NA被直 接应用于病毒的基因组型分析,减少了制 备病毒DNA时因技术复杂和需要特殊设 备等而带来的麻烦,使检测方法简便而又 迅速.本研究对辽宁地区1982年N19~6年 间Ad7分离株71株限制性内切酶切断点分 析的结果,发现辽宁地区流行的两个新的 Ad7基因组型,它们的特征是BamHI切断 时,分离株与标准株切断点不同,而且分离 株之间切断点位置亦有不同.我室1982年 至196年间由小儿急性呼吸系感染患者分 离的腺病毒11)5株中,Ad3有24株(22%), Ad7有7】株(68%),显示d7分离阳性率高 于Ac3.基因组型分析结果表明,属于Ad7 ?基因组型的有2株,占73%(52/71), l986年前,Ad2"I和A7?同时存在,至 19,6年分离株垒为Ad7?,显示有以Ad7II 为主逐渐向垒部?型移行的趋势.迭两个 新基因组型的致病性及其与Wa~ell氏报道 的Ad7基因组型的关系,我们正在分析 中.Aci7的迭两个新的基因组型分离自辽 宁地区11个市县,另有一株分离自吉林省 滓江市.为掌握更大范围的流行规律,我 们正对辽宁省邻近的吉林,黑龙江,内蒙, 河北等的分离株Ad7基因组型进行分析. 而夸后辽宁地区包括Ad7在内的腺病毒的 分子流行病学研究,是十分重要的课题. 参考文献 1.JohnTOOZe,eta1.DNAtumorvir— uses.moleculEfbi0logyoftUmO~" virusesS~cQndeditionPaxt2,Cold SprirlgHartorL"oratory1980. 2.Cra/aamrL.ttE1.studies0nirljtro t~ail$fcrmati0nbyDNAffagmentsof humfn,den0irustsEndsimiErlvirus ^0.ColdSpfingH,zl;o~Symt".cuanc. 已io1.105'363r. 8.RenChangshan.Tnsfclmaticnof 3Y1cel1stycallinefdenc,irstyPe IDAN}nditsDNArI,,me叭s.S印. 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